肖寧，羅慶華，羅濤，魏芳，曾亞軍

(1.貴陽護(hù)理職業(yè)學(xué)院，貴陽550081；2.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽550001； 3.荔波縣世界自然遺產(chǎn)管理局，貴州荔波558400；4.貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴陽550004)

徂徠林蛙Ranaculaiensis隸屬于蛙科Ranidae蛙屬Rana，是Li等(2008)依據(jù)山東泰安徂徠山的標(biāo)本而描述，目前已知分布于山東、河南、湖南和廣西等地(費(fèi)梁等，2012；AmphibiaWeb，2019；Frost，2019；中國兩棲類，2019)。楊寶田等(2013)依據(jù)線粒體16S rRNA支持徂徠林蛙的有效性，并認(rèn)為其與鎮(zhèn)海林蛙Ranazhenhaiensis為姐妹種，兩者處于物種分化過程中的并系階段，其物種分化還未完成。大多數(shù)研究均支持該物種的有效性(Yanetal.，2011；楊寶田等，2013；Yuanetal.，2016；Wangetal.，2017；Zhaoetal.，2017)。貴州省現(xiàn)記錄分布的蛙屬物種有威寧蛙R.weiningensis、昭覺林蛙R.chaochiaoensis、峨眉林蛙R.omeimontis、寒露林蛙R.hanluica和鎮(zhèn)海林蛙R.zhenhaiensis5種(伍律等，1986；費(fèi)梁等，2009；張雷等，2010；陳繼軍等，2017)。魏剛等(2017)基于分子形態(tài)數(shù)據(jù)將貴州梵凈山地區(qū)的林蛙種類記錄為鎮(zhèn)海林蛙(樣本號：lshz40)和寒露林蛙(樣本號：lshz41)，但是梵凈山種群(樣本號：lshz40)與徂徠林蛙模式產(chǎn)地種群(山東徂徠，標(biāo)本號：SYNU07050129，GenBank登錄號：KF204620)的遺傳距離為0。

2018年5月在貴州省黃平縣朱家山縣級自然保護(hù)區(qū)進(jìn)行本底資源調(diào)查時(shí)采集到林蛙標(biāo)本10號，經(jīng)過形態(tài)學(xué)比較和分子系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定為徂徠林蛙，為貴州省新記錄。本研究對徂徠林蛙貴州種群進(jìn)行了詳細(xì)的形態(tài)學(xué)描述，補(bǔ)充了其分子遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，并與長肢林蛙R.longicrus種組物種進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系分析，探討它們之間的遺傳分化和系統(tǒng)演化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

徂徠林蛙成體標(biāo)本10號(4雄6雌)，采自貴州省黃平縣朱家山縣級自然保護(hù)區(qū)(107°39′44.49″E，26°54′35.23″N，海拔833 m；圖1)。取腿部肌肉保存于90%乙醇中；使用10%福爾馬林浸泡標(biāo)本，保存于貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物生態(tài)學(xué)標(biāo)本室(GZNU)。

圖1 徂徠林蛙采樣點(diǎn)Fig.1 Sampling points of Rana culaiensis

1.2 形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)測量

測量標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)費(fèi)梁等(2009)，使用游標(biāo)卡尺(Serial No.14133868，德國)測量標(biāo)本的12個(gè)形態(tài)特征(精確度為0.01 mm)，包括頭體長(SVL)、頭長(HL)、頭寬(HW)、吻長(SL)、眼徑(ED)、鼻間距(INS)、眼間距(IOS)、前臂及手長(LAHL)、手長(HL)、后肢全長(HLL)、脛長(TL)和足長(FL)。

1.3 DNA提取、擴(kuò)增和測序

總DNA提取自保存于90%乙醇中的標(biāo)本腿部肌肉，使用DNeasy Blood &Tissue Kit(QIAGEN Catalog 69504)進(jìn)行提取。選擇線粒體基因16SrRNA、cytb和ND2作為分子標(biāo)記，擴(kuò)增引物和反應(yīng)體系參考Yuan等(2016)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司雙向測序。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

選擇長肢林蛙種組9個(gè)物種的16SrRNA、cytb和ND2基因序列用于系統(tǒng)發(fā)育分析(表1)，以威寧蛙、中國林蛙R.chensinensis為外群，分子數(shù)據(jù)主要來自于Yuan等(2016)。使用MEGA 7.0(Kumaretal.，2016)中MUSCLE進(jìn)行多重序列比對，并使用DAMBE(Xia &Xie，2001)進(jìn)行序列飽和性檢測。

使用貝葉斯(BI)法和最大似然(ML)法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。最適模型基于赤池信息準(zhǔn)則(AIC)在PartitionFinder 2(Lanfearetal.，2012)中進(jìn)行選擇。在MrBayes 3.2(Ronquistetal.，2012)中進(jìn)行BI分析，設(shè)置4條鏈獨(dú)立運(yùn)行107代，每隔100代對樹進(jìn)行1次采樣，前25%被舍棄，使用貝葉斯后驗(yàn)概率(BPP)來檢測節(jié)點(diǎn)的支持率。在Tracer 1.6(Rambautetal.，2013)中查看相關(guān)運(yùn)行參數(shù)的收斂性和有效樣本量(ESS)。在IQ-TREE(Nguyenetal.，2014)中運(yùn)行1 000次Bootstrap重復(fù)抽樣分析，以檢驗(yàn)各節(jié)點(diǎn)置信度，使用自舉支持值(BSP)檢驗(yàn)節(jié)點(diǎn)處的支持率。在MEGA 7.0中以物種為組，采用分組的方法計(jì)算了長肢林蛙種組物種間的遺傳距離。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)發(fā)育分析

將采自貴州省黃平縣朱家山縣級自然保護(hù)區(qū)的4號林蛙標(biāo)本的16SrRNA、cytb和ND2基因序列上傳到GenBank，標(biāo)本編號對應(yīng)的檢索號見表1。對長肢林蛙種組9個(gè)物種共計(jì)26個(gè)標(biāo)本的16SrRNA、cytb和ND2基因序列進(jìn)行多重序列比對拼接后的堿基長度為2 336 bp?；谑褂?個(gè)線粒體基因聯(lián)合序列計(jì)算的長肢林蛙種組物種間的遺傳距離為0.77%～2.58%；采自朱家山縣級自然保護(hù)區(qū)的徂徠林蛙與該物種模式產(chǎn)地種群之間的遺傳距離為0.77%。

表1 由GenBank中下載用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的相關(guān)序列Table 1 Information of gene sequences used for building phylogenetic trees

注：*Yuan等(2016)將此標(biāo)本錯(cuò)錄入為四川威寧，現(xiàn)修訂為貴州威寧
Note：*Yuanetal.(2016)recorded "Sichuan：Weining" as the sampling site，it is now revised as "Guizhou：Weining"

基于BI法和ML法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹生成了相同的的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖2)，僅在末端分支節(jié)點(diǎn)上存在一些差異。本研究樣本與模式產(chǎn)地的徂徠林蛙聚為一支(BPP=0.99，BSP=91)，與鎮(zhèn)海林蛙為姐妹種，這與之前的研究有著相似的樹形結(jié)構(gòu)(Yanetal.，2011；楊寶田等，2013；Yuanetal.，2016；Wangetal.，2017)。因此，基于系統(tǒng)發(fā)育分析和遺傳距離的結(jié)果表明，本次采集的林蛙物種為徂徠林蛙。

2.2 形態(tài)描述

雄性頭體長41.61～51.09 mm，雌性頭體長48.46～56.60 mm(表2)；頭長大于頭寬(雄)，頭長略小于頭寬(雌)；吻端略鈍圓，突出于下唇；吻棱清晰；鼻孔位于吻棱下方，在眼和吻端之間；眼間距略等于鼻間距；瞳孔呈橫橢圓形；顳褶弱；鼓膜近圓形，約為眼徑的2/3；犁骨齒列呈兩短斜行；舌卵圓形，其后端缺刻深。

圖2 基于線粒體聯(lián)合序列構(gòu)建的長肢林蛙種組物種系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the Rana longicrus species group constructed using mitochondrial joint sequence紅色部分表示來自貴州省黃平縣的徂徠林蛙樣品Red indicates the R.culaiensis samples were from Huangping county，Guizhou province

四肢較為細(xì)長，前臂及手長為頭體長的59.29%；指細(xì)長，末端鈍圓；指側(cè)具較細(xì)的緣膜；第二指與第四指約等長；指長順序?yàn)棰?Ⅱ≈Ⅳ>Ⅰ；關(guān)節(jié)下瘤發(fā)達(dá)，內(nèi)掌突較大呈卵圓形；后肢全長為體全長的189.76%；前伸貼體時(shí)脛跗關(guān)節(jié)超過眼前角；左右跟部略重疊；脛長為頭體長的60.32%；脛長略大于足長；趾細(xì)長，趾端略膨大呈圓形而無溝；關(guān)節(jié)下瘤大而明顯；第三趾長于第五趾，第三趾超過第四趾第二關(guān)節(jié)下瘤，第五趾達(dá)第二關(guān)節(jié)下瘤，趾長順序?yàn)棰?Ⅲ>Ⅴ>Ⅱ>Ⅰ；趾間蹼較發(fā)達(dá)；雌蛙趾間蹼均不達(dá)趾端，第四趾兩側(cè)蹼其凹陷處位于第四趾第一關(guān)節(jié)與第二關(guān)節(jié)約 1/2處，兩側(cè)蹼以緣膜達(dá)第二關(guān)節(jié)下瘤；內(nèi)蹠突呈橢圓形、明顯，外蹠突不顯著(圖3)。

生活史顏色變異較大，為棕色或橄欖棕色，雌蛙多棕色；皮膚較光滑，背部及體側(cè)有少數(shù)小圓疣；體腹面光滑；體背面多為紅褐色或棕灰色而無深色斑，背側(cè)褶細(xì)窄從眼后上方直達(dá)胯部，在顳部上方略向外側(cè)彎曲，不與顳褶相連；頷腺細(xì)窄從口角延續(xù)至肩部上方；顳部有黑色三角斑，眼間有深色橫斑或橫斑顏色淺；兩眼間的橫斑、顳部的三角形斑以及背部的“八”形斑或短桿狀斑均為黑褐色，個(gè)別個(gè)體體側(cè)有褐色斑或小點(diǎn)；四肢背面黑褐色橫紋，較為細(xì)窄長，排列較為緊密，前臂有2～3條，股部有4～7條；脛部有5～6條；腹面乳黃色(圖3)。

第二性征：雄性無聲囊；雄性第一指具大而密的婚刺。

2.3 生境描述

貴州朱家山縣級自然保護(hù)區(qū)位于107°35′～107°42′E，26°53′～27°06′N，為武陵山脈向西南的延伸部分，是舞陽河主流和清水江支流的主要發(fā)源地。該區(qū)具明顯的亞熱帶季風(fēng)氣候特征。采自朱家山縣級自然保護(hù)區(qū)的徂徠林蛙生境較多樣，包括農(nóng)田和山間較濕潤的林區(qū)。5月調(diào)查時(shí)已發(fā)現(xiàn)其幼體完全變態(tài)營陸地生活，因此推測該蛙的繁殖時(shí)間為3—4月，這與Li等(2008)記錄的一致。

3 討論

本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)和3個(gè)線粒體基因從分子生物學(xué)的角度證實(shí)貴州省黃平縣朱家山縣級自然保護(hù)區(qū)分布林蛙為徂徠林蛙。從貴州黃平和山東徂徠山采集的徂徠林蛙在繁殖時(shí)間(Lietal.，2008)和遺傳上的差異較小(表3)，兩地種群遺傳距離為0.77%，小于徂徠林蛙與鎮(zhèn)海林蛙之間的遺傳距離(1.80%)，因此本研究采納了楊寶田等(2013)的觀點(diǎn)，將貴州黃平分布的林蛙記錄為徂徠林蛙。但貴州黃平和山東徂徠山的樣本在身體各部位的形態(tài)性狀和量度上仍存在一定的差異：1)前者的第四趾兩側(cè)蹼凹陷處位于第四趾第一關(guān)節(jié)與第二關(guān)約1/2處；而后者的趾間蹼缺刻深，其凹陷處位于第四趾第二關(guān)節(jié)處；2)前者眼間有深色橫斑或色斑顏色較淺，背面有倒“V”形斑；而后者眼間無深色橫斑，無倒“V”形斑；3)在前臂及手長占頭體長的比例上，前者(雌性為64.07%，雄性為59.29%)大于后者(雌性為45.54%，雄性為44.26%)；4)在體型上，前者(平均值：雄性44.73 mm，雌性52.29 mm)小于后者(平均值：雄性53.57 mm，雌性62.04 mm)。由于本研究采集的徂徠林蛙標(biāo)本數(shù)量有限，上述差異是否為適應(yīng)不同的地理環(huán)境而導(dǎo)致的形態(tài)變異，還有待采集符合統(tǒng)計(jì)學(xué)的標(biāo)本數(shù)據(jù)來論證。

表2 貴州黃平朱家山縣級自然保護(hù)區(qū)徂徠林蛙的量度Table 2 Morphological measure of Rana culaiensis in the Zhujiashan Nature Reserve，Huangping，Guizhou

圖3 貴州省黃平縣朱家山縣級自然保護(hù)區(qū)分布的徂徠林蛙生態(tài)照Fig.3 Ecological images of Rana culaiensis distributed in the Zhujiashan Nature Reserve，Huangping county，Guizhou provinceA.背面觀，B.腹面觀，C.側(cè)面觀，D.手腹面觀，E.足腹面觀，F(xiàn).頭部側(cè)面觀A.dorsal view，B.ventral view，C.side view，D.ventral view of hand，E.ventral view of foot，F(xiàn).side view of head

表3 基于線粒體聯(lián)合序列計(jì)算的長肢林蛙種組物種間的遺傳距離(P-distance，%)Table 3 Genetic distances among the species of Rana longicrus species group based on mitochondrial joint sequences (P-distance，%)

貴州地區(qū)最早分布的林蛙記錄為日本林蛙指名亞種R.japonicajaponica和日本林蛙昭覺亞種R.japonicachaochiaoensis，后修訂為峨眉林蛙和昭覺林蛙(Liuetal.，1946；費(fèi)梁等，1990；葉昌媛等，1993)。

這2種林蛙曾被作為廣泛種記錄在貴州省的各個(gè)區(qū)縣(伍律等，1986；貴州省黔東南苗族侗族自治州人民政府，1989；喻理飛，2004；貴州省林業(yè)廳，2006；費(fèi)梁等，2009；貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴州省盤縣林業(yè)局，2013；茍光前等，2017)。但近年來貴州省東部地區(qū)的蛙屬物種分布尚存爭議(張雷等，2010；陳繼軍等，2017)。魏剛等(2017)對梵凈山地區(qū)的蛙屬進(jìn)行了調(diào)查和研究，基于線粒體16SrRNA的分析表明，該地區(qū)分布有鎮(zhèn)海林蛙和寒露林蛙，而未發(fā)現(xiàn)所記錄的日本林蛙指名亞種(貴州省林業(yè)廳，梵凈山國家級自然保護(hù)區(qū)，1990)，即峨眉林蛙。然而，在魏剛等(2017)基于線粒體16SrRNA的研究中，其鎮(zhèn)海林蛙樣本(樣本號：lshz40)與來自模式產(chǎn)地的徂徠林蛙的遺傳距離為0，加上黃平朱家山與梵凈山地區(qū)同屬于武陵山系，對物種的阻隔較小(Zhanetal.，2009)，因此，魏剛等(2017)記錄于梵凈山地區(qū)分布的鎮(zhèn)海林蛙與朱家山地區(qū)分布的林蛙應(yīng)為同一物種，是徂徠林蛙的錯(cuò)誤鑒定。截止目前，貴州地區(qū)是否分布有峨眉林蛙，尚有待進(jìn)一步調(diào)查。

蛙屬物種的形態(tài)保守性成為依靠形態(tài)特征鑒別的困難，因此在今后有必要結(jié)合分子生物學(xué)開展系統(tǒng)地理學(xué)和分類學(xué)研究。貴州作為第一階梯和第二階梯的過渡區(qū)域，已有越來越多的研究證明了該地區(qū)是一些生物的起源和擴(kuò)散的中心(Yanetal.，2013；Yuanetal.，2016；姚明燦等，2018)。因此，對于在青藏高原以外的地區(qū)進(jìn)行相關(guān)的生物地理學(xué)研究和厘清貴州高原地區(qū)的物種組成，以期進(jìn)一步理解高原運(yùn)動對物種形成和對保護(hù)物種多樣性作出科學(xué)的保護(hù)決策有著重要的作用。

致謝：感謝貴州省林業(yè)科學(xué)研究院、黃平縣朱家山縣級自然保護(hù)區(qū)工作人員在調(diào)查過程中提供的幫助。