蘇在興，高閏飛,2，易 媛，王 波，常 勇，黃忠勤，周興根

(1.江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇徐州 221131；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院甘薯研究所，江蘇徐州 221131)

小麥?zhǔn)斋@期若遭遇連陰雨或高溫高濕天氣，容易發(fā)生穗發(fā)芽現(xiàn)象(pre-harvest sprouting,PHS)，也叫胚萌[1]。穗發(fā)芽消耗了籽粒積累的生物質(zhì)，直接影響小麥的產(chǎn)量、品質(zhì)以及商用種子質(zhì)量等，是世界性的自然災(zāi)害[2-3]。我國(guó)北方冬麥區(qū)、長(zhǎng)江中下游及西南麥區(qū)和東北春麥區(qū)經(jīng)常受到穗發(fā)芽影響[4]，因而抗穗發(fā)芽小麥新品種的選育一直是我國(guó)小麥育種家高度關(guān)注的問(wèn)題。

小麥穗發(fā)芽是基因型與環(huán)境互作的結(jié)果，影響小麥穗發(fā)芽的因素很多，包括種子休眠特性、吸水能力、α-淀粉酶活性[5]、種子萌發(fā)時(shí)儲(chǔ)藏物的降解速率、脫落酸及赤霉素的水平、種皮顏色、穗部含水能力和易干燥程度、收獲期降水及田間溫度、濕度等因素[3]。其中小麥種子的休眠特性是影響其穗發(fā)芽抗性的關(guān)鍵因素。

小麥的抗穗發(fā)芽特性是由多基因控制的數(shù)量性狀[6]，研究者將紅麥Zen的紅粒控制基因R、MFT及QPhs-5ALQTL導(dǎo)入硬粒小麥構(gòu)建了近等基因系(near isogenic lines,NILs)，獲得發(fā)芽率(percentage germination,PG)和萌發(fā)指數(shù)(germination index,GI)均較低的硬粒小麥資源[7]。 Vp1是調(diào)節(jié)小麥休眠的重要轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)小麥種子的休眠和抗穗發(fā)芽能力具有重要作用，其中STS標(biāo)記Vp1B3在小麥抗穗發(fā)芽基因型鑒定中能擴(kuò)增出849 bp(Vp1Bb抗穗發(fā)芽型)、569 bp(Vp1Bc抗穗發(fā)芽型)和652 bp(Vp1Ba感穗發(fā)芽型)三種帶型，能對(duì)抗穗發(fā)芽小麥種質(zhì)資源進(jìn)行一定程度的區(qū)分[8-10]。除上述幾個(gè)基因外，在3A、4A染色體上廣泛存在控制穗發(fā)芽抗性的位點(diǎn)，這些位點(diǎn)已被開(kāi)發(fā)為分子標(biāo)記，如：XBarc321、XBarc310、Xgwm397和Xgwm269等[11]。

應(yīng)用抗穗發(fā)芽相關(guān)的分子標(biāo)記，結(jié)合田間性狀調(diào)查和穗發(fā)芽試驗(yàn)，可獲得抗穗發(fā)芽的優(yōu)質(zhì)品種和育種親本。本單位利用淮麥20與矮抗58的雜交F1代與淮麥20回交后經(jīng)多年系統(tǒng)選擇得到中抗穗發(fā)芽小麥新品種徐農(nóng)029。本研究擬通過(guò)整穗發(fā)芽法、籽粒發(fā)芽法和穗發(fā)芽相關(guān)分子標(biāo)記探究徐農(nóng)029及另外4個(gè)在黃淮冬麥區(qū)大面積推廣小麥品種的穗發(fā)芽抗性，為后續(xù)的育種研究及生產(chǎn)推廣奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

選取黃淮冬麥區(qū)大面積推廣的矮抗58、淮麥20、周麥18、煙農(nóng)19和中抗穗發(fā)芽小麥新品種徐農(nóng)029為供試材料，于2017-2018年種植于徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田，正常田間管理。其中淮麥20(♀)和矮抗58(♂)為徐農(nóng)029的親本。

1.2 方 法

1.2.1 整穗發(fā)芽率測(cè)定

在小麥成熟期，每品種隨機(jī)選取10個(gè)大小基本一致的麥穗，2次重復(fù)。在實(shí)驗(yàn)室用自來(lái)水沖洗0.5 h后，去除多余水份，用吸水紙覆蓋，置于種子發(fā)芽盒中，在18 ℃發(fā)芽箱中培養(yǎng)；每天噴水2次，保證吸水紙濕潤(rùn)；3 d后取出麥穗，于60 ℃烘箱烘烤過(guò)夜，阻止進(jìn)一步發(fā)芽；手工脫粒；以籽粒胚部種皮破裂為穗發(fā)芽鑒定標(biāo)準(zhǔn)[1]，調(diào)查小麥的整穗發(fā)芽率(spike germination rate,SGR)。整穗發(fā)芽率=發(fā)芽籽粒數(shù)/籽?？倲?shù)×100%[12]。

1.2.2 籽粒發(fā)芽率和萌發(fā)指數(shù)測(cè)定

每個(gè)品種隨機(jī)選取50穗成熟一致的麥穗，脫粒并充分混合。隨機(jī)選100?；旌蠘臃N子，腹溝朝下整齊排列于墊有吸水紙的發(fā)芽盒中，分別于正常溫度(18 ℃)和低溫(5 ℃)處理3 d后均轉(zhuǎn)入18 ℃條件下培養(yǎng)。以籽粒胚部種皮破裂為穗發(fā)芽鑒定標(biāo)準(zhǔn)[1]，每天定時(shí)記錄發(fā)芽種子數(shù)。于第7天計(jì)算發(fā)芽率和萌發(fā)指數(shù)。3次重復(fù)。

發(fā)芽率=發(fā)芽籽粒數(shù)/100×100%[12]；

萌發(fā)指數(shù)=(7×n1+6×n2+5×n3+4×n4+3×n5+2×n6+1×n7)/( 7×總籽粒數(shù))×100%，其中n1、n2、…、n7為第1至第7天每天發(fā)芽的小麥籽粒數(shù)[13]。

1.2.3 小麥基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增

采用柴建芳[14]的方法提取小麥的DNA。選取10個(gè)與穗發(fā)芽抗性相關(guān)的分子標(biāo)記(表1)，引物由上海生工公司合成。PCR反應(yīng)體系為20 μL，康為2×Taq Mix混合液10 μL，10 mmol·L-1的正反引物各1 μL，50 ng·μL-1的DNA 模板1 μL，7 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性3 min; 94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min; 4 ℃保持。用6%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)[15]。

表1 小麥穗發(fā)芽抗性相關(guān)分子標(biāo)記Table 1 Molecular markers associated with PHS in wheat

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Office 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及繪圖，用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 整穗發(fā)芽率分析

對(duì)5個(gè)小麥品種進(jìn)行整穗發(fā)芽率分析發(fā)現(xiàn)，煙農(nóng)19的整穗發(fā)芽率最高，達(dá)68.80%；其次為周麥18，為26.76%；矮抗58、淮麥20和徐農(nóng)029的整穗發(fā)芽率分別為7.05%、8.90%和3.02%。方差分析表明，品種對(duì)整穗發(fā)芽率有顯著(P< 0.05)影響。多重比較發(fā)現(xiàn)，煙農(nóng)19的整穗發(fā)芽率顯著高于其他4個(gè)品種；周麥18的整穗發(fā)芽率顯著高于矮抗58、淮麥20和徐農(nóng)029；矮抗58、淮麥20和徐農(nóng)029的整穗發(fā)芽率差異不顯著 (圖1)。

圖柱上不同字母表示品種間差異在0.05水平上顯著。

Different letters above bars indicate significant difference among the five cultivars at 0.05 level.

圖1 整穗發(fā)芽率

Fig.1Spike germination rate(SGR) of the five cultivars

2.2 籽粒發(fā)芽率分析

2.2.1 正常溫度條件下的發(fā)芽率

由表2可知，持續(xù)18 ℃培養(yǎng)，不同小麥品種間的發(fā)芽率和萌發(fā)指數(shù)的差異程度不同。徐農(nóng)029的發(fā)芽率和萌發(fā)指數(shù)分別為41.00%和 21.43%，均極顯著低于其親本矮抗58(71.67%、 53.10%)和淮麥20( 89.67%、61.00%)，周麥18和煙農(nóng)19的發(fā)芽率均為99.33%，煙農(nóng)19的萌發(fā)指數(shù)高于周麥18，但差異不顯著。

2.2.2 低溫處理后的發(fā)芽率

5 ℃處理3 d后，徐農(nóng)029的發(fā)芽率達(dá) 93.67%，較持續(xù)18 ℃提高了52.67%；矮抗58和淮麥20的發(fā)芽率分別為88.00%和99.33%，較持續(xù)18 ℃提高了16.33%和9.67%；低溫對(duì)周麥18和煙農(nóng)19的發(fā)芽率影響不明顯(表2)。低溫處理提高了徐農(nóng)029的萌發(fā)指數(shù)，但降低了其余四個(gè)品種的萌發(fā)指數(shù)。

2.2.3 小麥種子發(fā)芽動(dòng)態(tài)分析

持續(xù)18 ℃條件下，煙農(nóng)19、周麥18和矮抗58種子能迅速啟動(dòng)發(fā)芽過(guò)程，2 d內(nèi)發(fā)芽率達(dá)到較高水平，第4天煙農(nóng)19和周麥18的發(fā)芽率分別達(dá)93.7%和96.7%；淮麥20的發(fā)芽啟動(dòng)較矮抗58晚，第4天時(shí)其發(fā)芽率為82.0%，而矮抗58的發(fā)芽率為68.0%；此時(shí)徐農(nóng)029的發(fā)芽率僅 24.3%。第8天煙農(nóng)19和周麥18的發(fā)芽率達(dá)到最高，分別為99.3%和99.7%；淮麥20、矮抗58和徐農(nóng)029的發(fā)芽率分別為94.0%、73.0%和 45.0%；第14天，后3個(gè)品種的發(fā)芽率分別增加了4.3%、6.0%和2.0%(圖2)。

表2 不同溫度處理下各品種的發(fā)芽率和萌發(fā)指數(shù)Table 2 Percentage germination(PG) and germination index(GI) of the five cultivars with different temperature %

同列數(shù)據(jù)后不同字母表示品種間差異在0.01水平顯著。

Different letters following values in same column indicate significant difference among cultivars at 0.01 level.

圖2 正常溫度條件下各品種的發(fā)芽率動(dòng)態(tài)

經(jīng)5 ℃低溫處理，第4天煙農(nóng)19的發(fā)芽率達(dá)100%，較持續(xù)18 ℃的發(fā)芽率提高了6.3%，周麥18的發(fā)芽率不變，淮麥20、矮抗58和徐農(nóng)029的發(fā)芽率均有所提高。第8天煙農(nóng)19和周麥18的發(fā)芽率均為100.0%；淮麥20、矮抗58和徐農(nóng)029的發(fā)芽率分別提高了6.0%、18.0%和 53.3%，徐農(nóng)029的發(fā)芽率達(dá)到98.3%。第14天，淮麥20、矮抗58和徐農(nóng)029的發(fā)芽率分別為100.0%、94.3%和98.3%。說(shuō)明低溫處理可提高種子的發(fā)芽率(圖3)。

圖3 低溫處理后各品種兩周內(nèi)發(fā)芽率動(dòng)態(tài)

2.3 分子標(biāo)記檢測(cè)

就Vp1B3標(biāo)記而言，煙農(nóng)19、徐農(nóng)029和淮麥20擴(kuò)增得到569 bp的條帶，屬于Vp1Bc型抗穗發(fā)芽；周麥18和矮抗58擴(kuò)增得到652 bp的條帶，屬于Vp1Ba型感穗發(fā)芽，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)845 bp的條帶。Xgwm282在5個(gè)品種中呈現(xiàn)2種帶型，矮抗58、淮麥20和徐農(nóng)029帶型相同，周麥18和煙農(nóng)19呈另一種帶型，說(shuō)明其能較好地區(qū)分抗穗發(fā)芽和穗發(fā)芽敏感的品種。MST101的擴(kuò)增片段在400～750 bp之間，多態(tài)性比較豐富，5個(gè)品種呈現(xiàn)出5種不同的帶型，其中，徐農(nóng)029幾乎綜合了其雙親矮抗58和淮麥20的各個(gè)條帶，但沒(méi)有共性。另外7個(gè)分子標(biāo)記不能很好區(qū)分上述5個(gè)品種的抗穗發(fā)芽特性(圖4)。

M1:2 000 bp的marker；M2:500 bp的marker；各分子標(biāo)記對(duì)應(yīng)的品種從左至右依次為：矮抗58、淮麥20、徐農(nóng)029、周麥18和煙農(nóng)19。

M1:2 000 bp marker; M2: 500 bp marker; The order of cultivars(left to right) corresponding to each molecular marker is Aikang 58,Huaimai 20,Xunong 029,Zhoumai 18 and Yannong 19.

圖4 穗發(fā)芽抗性相關(guān)分子標(biāo)記檢測(cè)

Fig.4 Detection with 10-pair molecular markers associated with PHS resistance

3 討 論

穗發(fā)芽在世界范圍內(nèi)較為普遍，是影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的重大災(zāi)害之一。目前，黃淮麥區(qū)大面積種植的周麥18、煙農(nóng)19等品種不具有穗發(fā)芽抗性，生產(chǎn)上存在一定的風(fēng)險(xiǎn)性[21]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，矮抗58和淮麥20具有較強(qiáng)的穗發(fā)芽抗性，周麥18和煙農(nóng)19不抗穗發(fā)芽，與苗西磊等[12]、張兆萍等[3]、簡(jiǎn)俊濤等[22]、趙 斌等[21]、張秀英等[23]的報(bào)道基本一致。就整穗發(fā)芽率、籽粒發(fā)芽率而言，徐農(nóng)029的抗穗發(fā)芽能力優(yōu)于其親本矮抗58和淮麥20，在生產(chǎn)上具有較好的推廣應(yīng)用前景。

整穗發(fā)芽試驗(yàn)可模擬小麥?zhǔn)斋@期田間的溫濕環(huán)境，沈正興等[24]、苗西磊等[12]研究表明，不同基因型的小麥穎殼、穗軸或它們的分泌物可能對(duì)籽粒的發(fā)芽有一定的控制作用。籽粒發(fā)芽試驗(yàn)?zāi)茌^好的分析小麥品種之間籽粒的休眠特性，具有較高的實(shí)用性。在記錄穗發(fā)芽時(shí)，有以胚部出現(xiàn)破裂跡象即為穗發(fā)芽的[1,25]，有以芽長(zhǎng)達(dá)到種子長(zhǎng)度一半記為穗發(fā)芽的[17]，本研究采用籽粒種皮破裂記為穗發(fā)芽。相關(guān)學(xué)者在抗穗發(fā)芽分子標(biāo)記方面已進(jìn)行了大量的探索，開(kāi)發(fā)出一定數(shù)量的分子標(biāo)記，如STS標(biāo)記Vp1B3[13]、MST101[26]和SSR標(biāo)記Xgwm155[27]wmc104[26]等。上述三種方法的結(jié)合在尋找抗穗發(fā)芽種質(zhì)資源和后備材料的抗性分析方面發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，選取的10個(gè)穗發(fā)芽抗性相關(guān)分子標(biāo)記中，Vp1B3和Xgwm282和穗發(fā)芽抗性關(guān)系較密切，其他標(biāo)記不能區(qū)分5份供試材料的穗發(fā)芽抗性，其原因可能與開(kāi)發(fā)相關(guān)分子標(biāo)記所用材料的基因型背景不同有關(guān)。

種子產(chǎn)生休眠的原因具有多樣性，故解除其休眠的方法也不同。前人研究表明，可采用低溫或高溫、射線、超聲波等能改善種殼透性的物理處理以及激素、H2O2或強(qiáng)酸強(qiáng)堿等化學(xué)試劑破除種子的休眠[28]。本試驗(yàn)采用低溫處理打破供試材料的休眠性，并對(duì)兩周內(nèi)種子的發(fā)芽動(dòng)態(tài)進(jìn)行了分析，持續(xù)18 ℃條件下，徐農(nóng)029在14 d時(shí)發(fā)芽率僅47%；經(jīng)5 ℃低溫處理3 d后，其發(fā)芽率達(dá)98.3%，說(shuō)明發(fā)芽率主要由種子的休眠特性決定。

前人應(yīng)用Vp1B3標(biāo)記在篩選小麥抗穗發(fā)芽品種(系)方面已進(jìn)行了大量的研究[8,12,29]，也有研究者認(rèn)為，該基因的等位變異與穗發(fā)芽抗性關(guān)系不密切[30]。苗西磊等[12]研究表明，矮抗58屬于Vp1Ba基因型，該基因型與感穗發(fā)芽相關(guān)，但矮抗58屬中抗穗發(fā)芽品種，其抗性可能與穗軸有關(guān)。本研究中，徐農(nóng)029、淮麥20和煙農(nóng)19均擴(kuò)增得到569 bp(Vp1Bc型抗穗發(fā)芽)的條帶，但煙農(nóng)19的分子標(biāo)記結(jié)果與穗發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果不符合。周麥18和矮抗58擴(kuò)增得到652 bp(Vp1Ba型感穗發(fā)芽)的條帶，前人的研究中也存在此類情況[8,12]。穗發(fā)芽抗性機(jī)制比較復(fù)雜，分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果與穗發(fā)芽抗性不符合可能與標(biāo)記與抗性基因連鎖性不緊密或供試材料的遺傳背景不同有關(guān)，需進(jìn)一步深入研究。