葉曉斌，衛(wèi) 波，范仁春，張相岐

(中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，植物細胞與染色體工程國家重點實驗室，北京 100101)

小麥(TriticumL.)籽粒顏色一般為白色或紅色，但也有一些藍色、紫色等特殊粒色的品種和種質(zhì)資源。在一粒小麥(T.monococcumL.)、二粒小麥(T.aethiopicumJakubz.)和普通小麥(T.aestivumL.)中都有藍粒的報道[1-2]。小麥的藍色籽粒是因為在糊粉層中有藍色花青素積累[3]。花青素具有抗氧化、抗癌和降血糖等功效[4-5]。并且，藍粒小麥還含有較豐富的氨基酸和微量元素等對人體健康有利的成分，因而具有較高的營養(yǎng)保健價值[6-7]。在小麥遺傳育種中，藍色籽?？梢宰鳛闃?biāo)記性狀加以利用。李振聲等[8]通過普通小麥與十倍體長穗偃麥草遠緣雜交方法培育了藍單體小麥。進而，穆素梅等[9]利用藍單體培育出了穩(wěn)定遺傳的小麥缺體材料。利用藍粒標(biāo)記無需進行大量的細胞學(xué)鑒定，只憑籽粒顏色就可以鑒別二體、單體或缺體材料。黃壽松等[10]利用小偃麥的藍粒性狀標(biāo)記選育了雄性不育-保持系，解決了小麥核型雄性不育系保持困難的問題。Hanson等[11]以藍粒為標(biāo)記性狀研究隔離距離對小麥品種間異交率的影響，確定了保證種子純度的最小隔離距離。

小麥的一些近緣屬種也有藍粒性狀，如偃麥草屬(Thinopyrum=Elytrigia)、山羊草屬(Aegilops)、黑麥屬(Secale)等。Jan等[12]將十倍體長穗偃麥草(Elytrigiapontica=Thinopyrumponticum=Agropyronelongatum)中控制藍粒性狀的染色體4Ag(=4E)導(dǎo)入普通小麥后，得到了4EL/4AS易位系，并將藍?；蚨ㄎ坏?Ag染色體長臂上。后來，Zheng等[13]又將長穗偃麥草的藍粒基因Ba1定位到4Ag染色體長臂0.71～0.80區(qū)間，并開發(fā)了與藍粒基因連鎖的分子標(biāo)記和FISH探針[14]。百薩偃麥草(Thinopyrumbessarabicum=Elytrigiabessarabica)的藍粒基因被命名為BaThb，并被定位于4Eb染色體長臂的著絲粒與FL0.52之間的區(qū)域[15]。Love 和Suneson[16]以及袁文業(yè)和孫善澄[2]曾報道在普通小麥與中間偃麥草(Et.intermedia)的雜交后代中也出現(xiàn)了藍粒材料，但未見進一步研究。來自于栽培一粒小麥(T.monococcum，2n=2x=14, AA)的藍粒基因被命名為Ba2，并已被定位于4AL的著絲粒附近[17]。

為給藍粒小麥品種的選育提供新的種質(zhì)資源，并為中間偃麥草藍?；虻倪z傳學(xué)研究奠定基礎(chǔ)，本研究利用八倍體小偃麥中5(來自普通小麥與中間偃麥草雜交)與普通小麥中國春的缺-四體系列材料雜交和回交，在后代中選育出兩份藍粒材料。通過細胞學(xué)和分子標(biāo)記鑒定，確定了兩份藍粒小麥材料的染色體組成和控制藍粒性狀染色體的來源染色體組和同源群。

1 材料與方法

1.1 材 料

八倍體小偃麥中5(2n=8x=56，AABBDDXX)來自于普通小麥(2n =6x=42, AABBDD)與中間偃麥草(2n=6x=42, EeEeEeEeStSt或EeEeEbEbStSt)的雜交后代，由原黑龍江省農(nóng)科院孫善澄研究員培育[18]，種子由東北師范大學(xué)郝水院士惠贈。一套普通小麥中國春(CS)的缺體-四體(NT)系列材料的種子由英國John Innes Centre的John Snape教授惠贈。二倍體長穗偃麥草(2n=2x=14，EeEe)的種子由美國密蘇里大學(xué)的Perry Gustafson教授惠贈。假鵝觀草[Pseudoroegneriastipifolia(Nevski) Love，2n=2x=14，StSt]的種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院的李立會研究員惠贈。中國春-二倍體長穗偃麥草[Et.elongata(Host) Nevski]的雙二倍體CS/THE(2n=8x=56, AABBDDEeEe)種子由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所的王道文研究員惠贈。百薩偃麥草[Et.bessarabica(Savul.and Rayss) Dubovik，2n=2x=14，EbEb(= JJ)]基因組DNA由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所的韓方普研究員惠贈。普通小麥中國春種子由本實驗室收集保存。

1.2 方法

1.2.1 染色體制片

染色體制片參考Han等[19]的方法，略有 修改。

1.2.2 連續(xù)GISH-FISH分析

染色體的連續(xù)GISH-FISH鑒定參照Han等[19-20]的方法。GISH探針標(biāo)記體系為60 μL，包括要標(biāo)記的基因組DNA 6.0 μg，加重蒸水至 35.0 μL，10×Nick buffer 6.0 μL，dNTP (不含dUTP，1 mmol/L)5.0 μL，DNA polymerase I 10.0 μL，DNase 2.0 μL，F(xiàn)luorescein-12-dUTP(用于中間偃麥草基因組DNA標(biāo)記)或Texas Red-5-dCTP(用于二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草和假鵝觀草基因組DNA標(biāo)記)2.0 μL?；旌弦?5 ℃金屬浴標(biāo)記反應(yīng)2 h，然后加入480 μL ssDNA和1 mL(90%乙醇 + 10% NaAc)，混勻后-20 ℃過夜。12 000 r·min-1離心30 min，收集沉淀，用70%乙醇沖洗2次，晾干，加60.0 μL 2×SSC溶解并將探針-20 ℃避光保存。

GISH雜交液體系為10 μL，包括熒光標(biāo)記的偃麥草或假鵝觀草探針0.5 μL，封阻DNA (中國春基因組DNA，濃度為3.5 μg·μL-1) 4.5 μL， 2×SSC 5.0 μL。選取制備好的染色體制片，放入交聯(lián)儀中交聯(lián)兩次。將雜交液(每張染色體制片10 μL)滴加到染色體制片上的根尖酶解液區(qū)域，加塑料蓋玻片，放入墊有濕潤濾紙的容器內(nèi)，沸水浴5 min。將水浴過的染色體制片放入墊有濕潤濾紙的載玻片盒中(內(nèi)有載玻片支架)，55 ℃處理12 h后取出，2×SSC溶液洗脫蓋玻片。滴加10 μL DAPI復(fù)染液，蓋上24×50 mm蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察和照相。選取有較好有絲分裂中期相的染色體制片，用70%乙醇洗脫DAPI及熒光標(biāo)記后用于進一步的FISH分析。

FISH檢測所使用的探針為來自于黑麥(SecalecerealeL.)的重復(fù)序列pSc119.2和來自于粗山羊草(AegilopstauschiiCoss.)的重復(fù)序列pAs1。探針pSc119.2用Fuorescein-12-dUTP標(biāo)記為綠色，探針pAs1 用Texas Red-5-dCTP標(biāo)記為紅色。FISH探針標(biāo)記和雜交程序參考Han等[20]的方法。

1.2.3 SNP標(biāo)記分析

本研究所使用的SNP標(biāo)記為中國科學(xué)院遺傳發(fā)育所的婁海娟博士[21]通過二倍體長穗偃麥草(Et.elongata) Ee基因組與普通小麥中國春直向同源基因之間的SNP位點對比開發(fā)的Ee基因組特異SNP標(biāo)記，共373對引物，分布在1E至7E染色體上。SNP標(biāo)記分析采用PCR擴增方法。使用全式金公司的EASYTaq構(gòu)建20 μL PCR體系，包括模板DNA 1.0 μL(100 ng·μL-1)，正、反向引物各0.3 μL(0.1 μmol·L-1)，dNTP混合物1.6 μL(dNTPs 2.5 mmol·L-1)，Taq酶0.2 μL(EASYTaqDNA Polymerase 1.0 U)，10×EASYTaqbuffer (200 mmol·L-1Tris-HCl，200 mmol·L-1KCl，100 mmol·L-1(NH4)2SO4)2.0 μL，LC Green熒光劑(Idaho) 1.0 μL，ddH2O 13.6 μL。程序為： 94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，56 ℃ 退火20 s，72 ℃ 延伸10 s，35個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。結(jié)果分析采用高分辨率熔解曲線(HRM)方法。高分辨率熔解曲線檢測儀器為Light Scanner(Idaho, LightScanner 96)。

1.2.4 SSR標(biāo)記分析

SSR標(biāo)記來自小麥。使用GenStar Mix構(gòu)建20 μL PCR體系。程序為：95 ℃變性5 min； 95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍粒小偃麥的選育

以八倍體小偃麥中5作母本，中國春缺-四體系列材料作父本進行雜交獲得雜種F1，用缺-四體親本作母本回交一次后連續(xù)自交至BC1F4代。每代選取植株形態(tài)偏向中國春的類型混收并繁育下一代。結(jié)果分別在中5×N4BT4A和中5×N7BT7D兩個雜交組合的后代植株中發(fā)現(xiàn)了藍色籽粒(圖1)。分別收獲藍粒種子并自交繁殖一代。田間觀察顯示，藍粒株系與白粒姊妹系在株穗型上并無明顯差別。選取藍粒性狀不發(fā)生分離單株Zh5-a2-1(來自中5×N4BT4A組合)和Zh5-c13-2(來自中5×N7BT7D組合)的種子進行染色體組成分析。

a：中國春；b：中國春缺-四體系N4BT4A；c：中國春缺-四體系N7BT7D；d：中5；e：藍粒株系Zh5-a2-1；f：藍粒株系Zh5-c13-2。

a:Chinese Spring; b:Chinese Spring NT line N4BT4A; c:Chinese Spring NT line N7BT7D; d:Zhong 5; e:Blue-grained line Zh5-a2-1; f:Blue-grained line Zh5-c13-2.

圖1 兩份藍粒小麥及其親本和中國春的種子

Fig.1 Seeds of the two blue-grained wheat lines and their parents and Chinese Spring

2.2 藍粒小偃麥的染色體組成

2.2.1 藍粒小偃麥的染色體組成

利用中間偃麥草基因組DNA作探針的GISH分析顯示，藍粒系Zh5-a2-1和Zh5-c13-2的根尖細胞染色體數(shù)均為42條，包括40條小麥染色體和2條中間偃麥草染色體(圖2a, c)，即一對中間偃麥草的染色體代換了一對小麥的染色體。進一步利用pSc119.2和pAs1作探針對同一染色體制片進行FISH分析，通過與中國春標(biāo)準核型[22]比對，發(fā)現(xiàn)兩個藍粒系Zh5-a2-1和 Zh5-c13-2中被代換的一對小麥染色體分別為4B和4D(圖2b，d)。并且，兩個藍粒系中的一對中間偃麥草染色體有非常相似的形態(tài)大小和一致的FISH帶型，都在短臂靠近著絲粒區(qū)有一pAs1探針的雜交信號(圖2b和d中箭頭所示)。由此推斷，藍粒系Zh5-a2-1和Zh5-c13-2分別是4B和4D染色體的二體代換系，并且二者可能代入了同一對中間偃麥草染色體。本研究也對兩個藍粒代換系的多個白粒姊妹系進行了平行GISH鑒定，結(jié)果顯示在所有白粒姊妹系中均不存在中間偃麥草的染色體(圖2e, f)。由此說明，這兩個藍粒代換系的藍粒性狀是由代入的一對中間偃麥草染色體決定的。

2.2.2 藍粒代換系中中間偃麥草染色體的染色體組來源

由于尚沒有中間偃麥草的標(biāo)準FISH核型可供參考，因此，僅根據(jù)FISH帶型尚不能判定藍粒代換系Zh5-a2-1和Zh5-c13-2中的中間偃麥草染色體的染色體組來源和同源群歸屬。研究表明，中間偃麥草的染色體組構(gòu)成可能為EeEeEeEeStSt[23]或EeEeEbEbStSt[24]，但中5中的中間偃麥草染色體的所屬染色體組還不清楚。為了明確藍粒代換系中的中間偃麥草染色體的染色體組來源，分別利用二倍體假鵝觀草(StSt)、二倍體長穗偃麥草(EeEe)和百薩偃麥草(EbEb)的基因組DNA作探針，用小麥基因組DNA做封阻，對代換系Zh5-a2-1進行了GISH鑒定，同時以中間偃麥草基因組DNA為探針的GISH作對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Zh5-a2-1中的一對中間偃麥草染色體只能與St基因組DNA探針雜交，而不能與Ee或Eb基因組DNA探針雜交(圖3)。當(dāng)用St基因組DNA探針雜交時，雜交信號分布于Zh5-a2-1的整條中間偃麥草染色體上，且信號強度與用中間偃麥草基因組DNA作探針的雜交信號相似(圖3a，b)。而當(dāng)用Ee或Eb基因組DNA探針雜交時，Zh5-a2-1中的一對中間偃麥草染色體則完全沒有雜交信號(圖3c，e)，但作為對照的同一細胞用中間偃麥草基因組DNA作探針雜交時，則都能產(chǎn)生很強的雜交信號(圖3d，f)。由此推斷，藍粒代換系Zh5-a2-1中的一對中間偃麥草染色體屬于St組。由于連續(xù)GISH-FISH分析結(jié)果顯示，另一個藍粒代換系Zh5-c13-2中的一對中間偃麥草染色體與Zh5-a2-1中的相同(圖2)，所以，可推定Zh5-c13-2中的一對中間偃麥草染色體也屬于St組。另外，用St基因組DNA作探針對中5的GISH分析結(jié)果顯示，在中5中有7對中間偃麥草染色體，其中兩對染色體在整條染色體上都有很強的St基因組DNA探針的原位雜交信號，推測其屬于St組。而另外5對染色體只有節(jié)段性的St組DNA探針雜交信號，推測其不屬于或不完全屬于St組染色體(結(jié)果未在本文中顯示)。由此說明中5中確實存在St組的染色體。

a：藍粒代換系Zh5-a2-1染色體的GISH鑒定結(jié)果；b：與圖a同一細胞染色體的FISH鑒定結(jié)果；c：藍粒代換系Zh5-c13-2染色體的GISH鑒定結(jié)果；d：與圖c同一細胞染色體的FISH鑒定結(jié)果；e：藍粒代換系Zh5-a2-1的白粒姊妹系Zh5-a2-2染色體的GISH鑒定結(jié)果；f：藍粒代換系Zh5-c13-2的白粒姊妹系Zh5-c13-3染色體的GISH鑒定結(jié)果。GISH探針為Fluorescein-12-dUTP標(biāo)記的中間偃麥草基因組DNA；FISH探針分別為Fuorescein-12-dUTP標(biāo)記的pSc119.2 (綠色) 和Texas Red-5-dCTP標(biāo)記的pAs1 (紅色)；箭頭示一對中間偃麥草染色體。

a:GISH identification of chromosomes in blue-grained substitution line Zh5-a2-1; b:FISH identification of the chromosomes in the same cell as subfigure a; c: GISH identification of chromosomes in blue-grained substitution line Zh5-c13-2; d:FISH identification of the chromosomes in the same cell as subfigure c. e:GISH identification of chromosomes in a white-grained sib line of blue-grained substitution line Zh5-a2-1; f: GISH identification of chromosomes in a white-grained sib line of blue-grained substitution line Zh5-c13-2.The Fluorescein-12-dUTP labelled genomic DNA ofEt.intermediawas used as GISH probe; The Fuorescein-12-dUTP labelled repetitive sequence ofS.cerealepSc119.2(green) and Texas Red-5-dCTP labelled repetitive sequence ofAe.tauschiipAs1(red) were used as FISH probes; The arrows indicate the pair ofEt.intermediachromosomes.

圖2 小麥-中間偃麥草藍粒代換系染色體的連續(xù)GISH-FISH鑒定結(jié)果

Fig.2Identifications of chromosomes of common wheat-Et.intermedia blue-grained substitution lines by sequential GISH-FISH

2.2.3 藍粒代換系中的中間偃麥草染色體同源群歸屬

以上的細胞遺傳學(xué)分析已證明Zh5-a2-1和Zh5-c13-2中被代換的小麥染色體同屬第四同源群，分別為4B和4D(圖2)，代入的中間偃麥草染色體屬于St組(圖3)，但其同源群歸屬仍不能確定。已有的研究表明，中間偃麥草和十倍體長穗偃麥草都有Ee和St染色體組，并且兩者有很近的親緣關(guān)系[25]。因此，本研究利用來自于二倍體長穗偃麥草Ee基因組的SNP標(biāo)記[21]，通過高分辨率溶解曲線(HRM)方法對藍粒代換系Zh5-a2-1和Zh5-c13-2中的中間偃麥草染色體同源群歸屬進行了分析。經(jīng)過對373對SNP標(biāo)記引物的篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有定位于4Ee染色體上的5對引物(2對定位于4EeS，3對定位于4EeL)對Zh5-a2-1和Zh5-c13-2擴增產(chǎn)物的高分辨率溶解曲線與中國春明顯不同，而與中5和中國春-二倍體長穗偃麥草雙二倍體CS/THE相似(圖4，表1)。由此說明，藍粒代換系Zh5-a2-1和Zh5-c13-2中的中間偃麥草染色體都與二倍體長穗偃麥草的4Ee染色體同源，應(yīng)為同屬第四同源群的4St。由此，將藍粒代換系Zh5-a2-1和Zh5-c13-2分別命名為SubZh5-4St(4B)和SubZh5-4St(4D)。本實驗結(jié)果說明來自中5的4St染色體上帶有控制藍粒性狀的基因。

2.2.4 藍粒代換系中的中間偃麥草染色體變異

藍粒代換系SubZh5-4St(4B)和SubZh5-4St(4D)的親本之一是八倍體小偃麥中5，即兩個代換系中的中間偃麥草染色體直接來自中5。因此，本研究對藍粒代換系和中5中的中間偃麥草染色體進行了FISH比較分析。結(jié)果顯示，在中5中含有7對中間偃麥草的染色體，但并沒有與藍粒代換系中FISH帶型相同的(圖5a，圖2b，d)。比較發(fā)現(xiàn)，在中5中只有一對中間偃麥草的染色體(圖5a，箭頭所示的add3)在短臂近著絲點區(qū)有一個pAs1的雜交信號，長臂無信號，與代換系中的中間偃麥草染色體的信號位置及染色體形態(tài)都很相似，但在短臂末端還有一個很強的pSc119.2雜交信號。由此推測，藍粒代換系中的中間偃麥草染色體可能是由這對染色體演變而來的。為了證明這一推測，本研究對代換系SubZh5-4St(4D)的藍粒姊妹株進行了大量鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)姊妹株Zh5-c13-1的染色體數(shù)也是2n=42，GISH鑒定也顯示有一對中間偃麥草的染色體，即也是一個二體代換系。但是，F(xiàn)ISH分析卻顯示Zh5-c13-1中的這對中間偃麥草染色體是異形的，其中一條與中5的add3染色體的FISH結(jié)果相同，即除了在短臂近著絲點區(qū)有一pAs1的紅色雜交信號外，在短臂末端也有一個很強的pSc119.2綠色雜交信號。而另一條則與其姊妹系SubZh5-4St(4D)中的FISH信號相同，即只在短臂近著絲點區(qū)有一pAs1的紅色雜交信號，在短臂端部沒有pSc119.2的綠色雜交信號(圖5b，箭頭所示)。由此推測，藍粒代換系中的一對中間偃麥草染色體在雜交選育過程中發(fā)生了結(jié)構(gòu)變異，是由中5中的一對染色體(圖5a中的add3)發(fā)生短臂端部缺失后形成的。另外，在Zh5-c13-1中被代換的兩條小麥染色體也不是一對，而分別是一條4B和一條4D(圖5b)，即是一個雜合二體代換系。

a：藍粒代換系Zh5-a2-1染色體用Texas Red-5-dCTP標(biāo)記的假鵝觀草基因組(St)DNA作探針(紅色)的GISH檢測結(jié)果；b：與圖a同一細胞用Fuorescein-12-dUTP標(biāo)記的中間偃麥草基因組(EeEeSt或EeEbSt)DNA作探針(綠色)的GISH檢測結(jié)果；c：藍粒代換系Zh5-a2-1染色體用Texas Red-5-dCTP標(biāo)記的二倍體長穗偃麥草基因組(Ee)DNA作探針的GISH檢測結(jié)果(無雜交信號)；d：與圖c同一細胞用Fuorescein-12-dUTP標(biāo)記的中間偃麥草基因組(EeEeSt或EeEbSt)DNA作探針(綠色)的GISH檢測結(jié)果；e：藍粒代換系Zh5-a2-1染色體用Texas Red-5-dCTP標(biāo)記的百薩偃麥草基因組(Eb)DNA作探針的GISH檢測結(jié)果(無雜交信號)；f：與圖e同一細胞用Fuorescein-12-dUTP標(biāo)記的中間偃麥草基因組(EeEeSt或EeEbSt)DNA作探針(綠色)的GISH檢測結(jié)果。箭頭示一對中間偃麥草染 色體。

a:GISH identification of chromosomes in blue-grained substitution line Zh5-a2-1 using Texas Red-5-dCTP labelled genomic DNA ofPs.stipifolia(St) as probe (red). b. GISH identification of the same cell as subfigure a using Fuorescein-12-dUTP labelled genomic DNA ofEt.intermedia(EeEeSt or EeEbSt)as probe (green); c: GISH identification of blue-grained substitution line Zh5-a2-1 using Texas Red-5-dCTP labelled genomic DNA of diploidEt.elongata(Ee)as probe (no hybridization signal); d:GISH identification of the same cell as subfigure c using Fuorescein-12-dUTP labelled genomic DNA ofEt.intermedia(EeEeSt or EeEbSt)as probe (green);e. GISH identification of blue-grained substitution line Zh5-a2-1 using Texas Red-5-dCTP labelled genomic DNA of diploidEt.bessarabica(Eb) as probe (no hybridization signal); f. GISH identification of the same cell as subfigure e using Fuorescein-12-dUTP labelled genomic DNA ofEt.intermedia(EeEeSt or EeEbSt)as probe (green). The arrows indicate the pair ofEt.intermediachromosomes.

圖3 藍粒代換系Zh5-a2-1中中間偃麥草染色體的染色體組來源分析

Fig.3 Originated genome analysis ofEt.intermediachromosomes in blue-grained substitution line Zh5-a2-1

a：位于4EeS的SNP標(biāo)記4E05的熱熔解峰圖；b：位于4EeS的SNP標(biāo)記4E05的高分辨率熔解曲線；c：位于4EeL的SNP標(biāo)記4E16的熱熔解峰圖；d：位于4EeL的SNP標(biāo)記4E16的高分辨率熔解曲線圖。CS：普通小麥中國春；CS/THE：中國春與二倍體長穗偃麥草的雙二倍體。

a:The melting peaks of the SNP marker 4E05 from 4EeS; b: The melting curves of the SNP marker 4E05 from 4EeS; c:The melting peaks of the SNP marker 4E16 from 4EeL; d: The melting curves of the SNP marker 4E16 from 4EeL.CS:Common wheat Chinese Spring; CS/THE: Chinese Spring-diploidEt.elongataamphidiploid.

圖4 藍粒代換系的SNP標(biāo)記鑒定結(jié)果

Fig.4 Identification of blue-grained substitution lines by SNP markers

表1 檢測藍粒代換系的特異SNP標(biāo)記Table 1 Specific SNP markers for detection of blue-grained substitution lines

2.3 4St染色體特異SSR標(biāo)記的篩選

為了建立更便捷的跟蹤檢測藍粒代換系中中間偃麥草染色體(4St)的分子標(biāo)記方法，本研究分別以中國春和中5為對照，利用450對小麥的SSR標(biāo)記引物對代換系進行了鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4對引物的擴增產(chǎn)物中存在兩個藍粒代換系與中5一致而與中國春不同的多態(tài)性片段(圖6)，它們都來自第四同源群，分別定位于小麥的4A和4B染色體上(表2)。這些SSR標(biāo)記可作為藍粒代換系的特異分子標(biāo)記跟蹤檢測4St染色體。

a：中5有絲分裂中期染色體的FISH分析，add1～add7表示7對中間偃麥草染色體，箭頭示一對add3染色體；b：代換系Zh5-c13-1有絲分裂中期染色體的 FISH分析，箭頭示一對異形中間偃麥草染色體(add3)。FISH探針分別為用Fuorescein-12-dUTP標(biāo)記的pSc119.2(綠色)和用Texas Red-5-dCTP標(biāo)記的pAs1(紅色)。

a:FISH analysis of mitotic metaphase chromosomes in Zhong 5，the add1-add7 mark seven pairs of chromosomes fromEt.intermedia，the arrows indicate a pair of add3 chromosomes; b:FISH analysis of mitotic metaphase chromosomes in substitution line Zh5-c13-1,the arrows indicate a pair of heteromorphicEt.intermediachromosomes (add3). The Fuorescein-12-dUTP labelled pSc119.2 (green) and Texas Red-5-dCTP labelled pAs1 (red) were used as FISH probes.

圖5 中5和藍粒代換系Zh5-c13-1染色體的FISH比較分析

Fig.5 FISH comparative analysis of chromosomes in Zhong 5 and blue-grained substitution line Zh5-c13-1

表2 檢測藍粒代換系的特異SSR標(biāo)記Table 2 Specific SSR markers for detecting blue-grained substitution lines

3 討 論

以往的研究表明，十倍體長穗偃麥草[13]、百薩偃麥草[15]和栽培一粒小麥[17]的藍?；蚨级ㄎ挥诘谒耐慈喝旧w，而本研究也證明藍粒代換系的藍粒性狀是由中間偃麥草的4St染色體控制的。由此看來，在小麥族植物中，決定籽粒藍色糊粉層的主效基因位點可能比較普遍地存在于第四同源群染色體上，它們很可能有共同的起源。

雖然長穗偃麥草的Ee染色體組與假鵝觀草的St染色體組有很近的親緣關(guān)系[25]，但基因組水平上的差異是可想而知的。本研究利用二倍體長穗偃麥草的SNP標(biāo)記成功地鑒定了藍粒代換系中來自中間偃麥草的4St染色體。在使用的373對SNP標(biāo)記引物中，有34對來自于4Ee連鎖群[21]，結(jié)果只有5對引物可用于鑒定4St代換系，有效率僅為14.7%。盡管有效率較低，但在St組分子標(biāo)記尚缺乏的情況下，作為一種替代辦法，用Ee組的SNP標(biāo)記鑒定St組染色體在一定程度上還是可行的。另外，SNP標(biāo)記雖然具有數(shù)量大、分布廣、分辨率高等許多SSR標(biāo)記無法比擬的優(yōu)點，但對儀器設(shè)備和實驗技術(shù)的要求都相對較高，實驗成本也較高。因此，為了建立鑒定藍粒代換系的簡便方法，本研究對小麥的SSR標(biāo)記進行了篩選。結(jié)果獲得了4個可在小麥背景下特異性識別4St染色體的SSR標(biāo)記，它們可用于藍粒代換系的準確鑒定。

中國春缺-四體的農(nóng)藝性狀并不好，本研究之所以選擇其作為創(chuàng)制代換系的親本，主要是參考了張學(xué)勇等[27]創(chuàng)制小麥異源代換系的缺體回交法，期望將與缺-四體中的缺體染色體部分同源的偃麥草染色體定向地導(dǎo)入到小麥背景中，以提高獲得部分同源染色體代換系的頻率。結(jié)果獲得的兩份代換系材料雖然都是部分同源染色體之間的代換，即4St分別代換了4B和4D，但其中的SubZh5-4St(4B)產(chǎn)生于中5 × N4BT4A組合，屬于定向代換，而SubZh5-4St(4D)則產(chǎn)生于中5×N7BT7D組合，屬于非定向代換。這個結(jié)果對于可代換的21對小麥染色體來說，較隨機代換具有明顯的定向代換傾向。但獲得的代換系材料還較少，缺-四體雜交/回交法誘導(dǎo)定向代換系的有效性尚需進一步驗證。

a、b、c、d分別為SSR標(biāo)記gwm4、gwm251、gwm192和gwm495的擴增結(jié)果。泳道M、1、2、3和4分別為 DNA marker、中國春、中5以及藍粒代換系SubZh5-4St(4B)和SubZh5-4St(4D)。箭頭示目標(biāo)條帶。

a, b, c and d represent the amplification profiles of SSR markers gwm4, gwm251, gwm192 and gwm495, respectively. The lanes M, 1, 2, 3 and 4 represent DNA marker, Chinese Spring, Zhong 5, SubZh5-4St(4B) and SubZh5-4St(4D),respectively.The arrows indicate the target bands.

圖6 藍粒代換系特異SSR標(biāo)記擴增圖譜

Fig.6 Amplification profiles of blue-grained substitution lines with specific SSR markers

本研究獲得的兩份藍粒代換系的親本，八倍體小偃麥中5和中國春缺-四體都不是藍色籽粒，中5的原始親本中間偃麥草也不是藍色籽粒。同樣，產(chǎn)生藍粒后代最多的長穗偃麥草也不是藍粒，但卻產(chǎn)生了各種類型的藍粒后代[8,13]。已知小麥的藍粒性狀是由于在糊粉層中積累了大量的藍色花青素，但至今對藍色糊粉層的形成和調(diào)控機制尚屬未知。在植物中，天然存在的花青素有數(shù)百種，代謝途徑非常復(fù)雜。不同的基因型和不同的內(nèi)外環(huán)境都可產(chǎn)生不同的花青素組合，從而產(chǎn)生不同顏色的植物組織或器官。已知藍色小麥的糊粉層中主要有4種花青素[3]，但對其相關(guān)基因的表達和調(diào)控機制還知之甚少。因此，非常有必要開展深入研究，以闡明藍色糊粉層形成的分子機制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為藍粒小麥的分子設(shè)計育種和特色食品或保健品的開發(fā)提供理論依據(jù)。