袁曉波，常亞南，王苗苗，樊亞棟，王瀑童，吳玉杰，李夢園，張 莉，孟凡榮，李永春

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南鄭州 454002； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州 454002)

硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)是一類廣泛存在于高等植物的低分子量氧化還原蛋白[1-2]，大量研究發(fā)現(xiàn)，該類蛋白在維持細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡、調(diào)節(jié)蛋白空間結(jié)構(gòu)及其活性等方面具有不可替代的作用，而且Trx蛋白參與了植物生長發(fā)育調(diào)控以及抵御干旱、高溫等逆境脅迫的響應(yīng)過程[3-4]。核氧還蛋白(nucleoredoxin，NRX)是硫氧還蛋白家族的重要成員，該類蛋白最早從小鼠中發(fā)現(xiàn)[5]，關(guān)于植物中NRX的研究報道還較少。依據(jù)氨基酸序列特征，可將植物的NRX分為3個亞類。第Ⅰ類包含3個TRX-like結(jié)構(gòu)域，其中第二個結(jié)構(gòu)域不包含TRX活性位點；第Ⅱ類包含2個TRX-like結(jié)構(gòu)域，且均含有TRX活躍位點WYP/AK/PC 和 W/R/HCL/A/V/RPC/G；第Ⅲ類NRX中含有2個TRX-like結(jié)構(gòu)域，其中分別包括高度保守的WCRPC氧化還原活性位點和典型的Trx活性位點WCPPC/F/S[6]。目前，已從擬南芥中鑒定了2個NRX基因(AtNRX1和AtNRX2)，分屬于第Ⅰ和第Ⅲ亞類，其中AtNRX1基因突變后導(dǎo)致花粉活力降低[7]，推測其在接收雌蕊信號并引導(dǎo)花粉管向胚珠生長的過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能[8]。從玉米中鑒定的ZmNRX蛋白包含3個TRX-like結(jié)構(gòu)域，而且該基因在不同組織間存在顯著的差異表達現(xiàn)象，推測其在玉米生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能[9]。

在小麥中，已有研究表明核氧還蛋白基因TaNRX(KC890769)的第一內(nèi)含子變異可能與小麥的抗旱性密切相關(guān)[10-11]，基于該基因序列差異的分子標(biāo)記可以用于小麥品種的抗旱性鑒定分析[12-13]。課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，一個小麥核氧還蛋白基因(CA605146)可能參與了籽粒發(fā)育調(diào)控過程[14]。在此基礎(chǔ)上，本研究克隆了該核氧還蛋白的編碼基因，并系統(tǒng)分析了其序列特征、染色體定位和時空表達模式，以期為進一步探討該基因在小麥發(fā)育調(diào)控過程中的生物學(xué)功能提供了重要信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料為小麥品種中國春和矮抗58，于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)毛莊科學(xué)試驗基地種植，分別取成熟的籽粒、開花期的穗下節(jié)、旗葉、節(jié)間和節(jié)用于基因的組織表達特性分析，同時分別取授粉后5、10、15、20、25和30 d的籽粒用于基因在種子發(fā)育過程中的表達特性分析。試驗設(shè)3個生物學(xué) 重復(fù)。

1.2 RNA的提取、cDNA第一鏈的合成及DNA的提取

籽?？俁NA采用TransZol Plant試劑盒(全式金，北京)提取，其余組織材料總RNA采用RNAisoPlus試劑(Takara，日本)提取。利用瓊脂糖凝膠電泳及OD260/280值來評估總RNA的完整性、純度和濃度，然后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(Takara，日本)進行cDNA第一鏈的合成，基因組DNA采用CTAB法[15]提取。

1.3 基因克隆和序列分析

依據(jù)前期研究中發(fā)現(xiàn)的小麥NRX基因cDNA序列(GenBank登錄號CA605146)進行小麥基因組(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)序列比對分析，初步對該基因的基因組結(jié)構(gòu)和編碼區(qū)等特性進行分析，并利用URGI小麥基因組數(shù)據(jù)庫(https://urgi.versailles.inra.fr/blast/blast.php)進行染色體定位。在此基礎(chǔ)上，利用Primer Premier 5.0設(shè)計基因克隆、部分同源基因鑒定和表達分析的引物(表1)。利用引物cF/R1通過高保真酶LATaq(Takara，日本)進行cDNA序列的克隆，擴增片段經(jīng)回收、連接pMD19-T載體(Takara，日本)和轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞后，用A、B和D基因組特異引物sF-A、sF-B和sF-D分別與下游引物cR1配對進行重組克隆鑒定，并進行測序分析?；蚪M序列克隆時，采用花后15 d籽粒的基因組DNA為模板，利用引物cR2分別與特異引物cF2-A、cF2-B和cF2-D組合進行該基因A、B和D基因組上游的調(diào)控區(qū)的克隆。利用引物組合Intron-1R/cF1和Intron-23F/cR1分別擴增第一內(nèi)含子和第二/三內(nèi)含子區(qū)域序列?；蚪M上游調(diào)控區(qū)的元件分析通過PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)軟件進行，蛋白的聚類通過MEGA 6.0軟件進行分析，蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)分析通過SWISS MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)進行。

1.4 基因表達分析

實時定量分析采用TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒(全式金，北京)進行，PCR儀為Bio-Rad CFXConnectTM。反應(yīng)體系20 μL，其中cDNA模板1μL，2×TransStart Tip Green qPCR Super Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，RNase-free水8.2 μL。表達分析通用引物為qF/R，以β-肌動蛋白基因Actin為內(nèi)標(biāo)基因，引物為actin-F/R。PCR程序為：94 ℃ 30 s；94 ℃5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)；表達特性分析采用2-△△Ct法。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaNRX1基因的克隆及序列分析

利用小麥cDNA序列進行NCBI blastx(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析，結(jié)果顯示，該序列的第3個閱讀框編碼氨基酸序列與核氧還蛋白(AHL29285.1)的序列一致性為100%；進一步通過小麥基因組(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)序列比對分析發(fā)現(xiàn)，該核氧還蛋白基因位于第2染色體長臂，將其在A、B和D基因組對應(yīng)的3個部分同源基因分別命名為TaNRX1-2AL、TaNRX1-2BL、TaNRX1-2DL(圖1)。序列分析顯示，該基因編碼區(qū)包含3個內(nèi)含子，且TaNRX1-2AL、TaNRX1-2BL和TaNRX1-2DL部分同源基因之間的內(nèi)含子差異較大，和A基因組相比，TaNRX1-2BL和-2DL基因組和它的序列一致性分別為84%和90%；外顯子區(qū)域序列一致性較高，三者之間的序列相似度約98%。

表1 本研究中使用的引物信息Table 1 Primer information used in the study

圖1 TaNRX1的基因組結(jié)構(gòu)特征

利用特異引物cF/R1進行cDNA擴增得到大小約為1 900 bp的條帶(圖2)，利用引物Intron-1R和cF1克隆包含TaNRX1第一內(nèi)含子序列的大小約為1 700 bp的片段，同時利用引物Intron-23F和cR1擴增包含第二、三內(nèi)含子序列的片段，獲得大小約為2 100 bp的條帶(圖2)，利用引物cR2分別與A、B和D基因組特異引物(cF2-A、cF2-B和cF2-D)組合進行基因組DNA擴增，獲得了該基因上游調(diào)控區(qū)的DNA片段(圖2)。結(jié)果分析顯示，TaNRX1-2AL的cDNA大小為1 936 bp，ORF大小為1 731 bp(GenBank：MK497247)；TaNRX1-2BL的cDNA大小為 1 942 bp，ORF大小為1 743 bp(GenBank：MK497248)；TaNRX1-2DL的cDNA大小為 1 931 bp，ORF大小為1 734 bp(GenBank：MK497249)。對該基因編碼氨基酸序列分析顯示，TaNRX1-2AL、-2BL和-2DL蛋白均包含3個TryX_like_TryX_NRX(cd03009)保守結(jié)構(gòu)域，分別位于第22～153位氨基酸、第184～316位氨基酸和第347～476位氨基酸，其中，第1個和第3個保守結(jié)構(gòu)域分別包含了WCPPC和WCGPC活性位點；另外，在TaNRX1的C端還檢測到一個富集半胱氨酸和組氨酸的C1保守域，該區(qū)域可能和兩個鋅離子結(jié)合形成鋅指結(jié)構(gòu)。

對矮抗58和中國春兩個品種間TaNRX1基因序列比對發(fā)現(xiàn)，該基因在cDNA、內(nèi)含子及上游調(diào)控區(qū)，所檢測的兩個品種間序列一致性在99%以上。對該基因A、B和D基因組間的序列比對分析發(fā)現(xiàn)，TaNRX1基因上游調(diào)控區(qū)存在較大的序列差異(圖3)。與A基因組相比，B基因組與之序列一致性僅有25%，D基因組為79%；不過，在轉(zhuǎn)錄起始位點上游340 bp的區(qū)域內(nèi)，A、B、D基因組間序列一致性較高，均包含TATA signal(-27～-33 bp)、TGACG motif(-90～-94 bp)、CAAT signal(-180～-183 bp)和MYB結(jié)合位點(-320～-325 bp)。另外，B和D基因組還包含一個光響應(yīng)元件；在上游調(diào)控序列340～1 300 bp的區(qū)域內(nèi)，含有4～6個MeJA調(diào)控響應(yīng)元件和 1～2個光響應(yīng)元件(AE-box、G-box)，在A和B基因組中還檢測到 2～3個MYB結(jié)合位點和 1～2個ABA響應(yīng)調(diào)控元件(ABRE)。

M：Marker DL2000；1：以中國春cDNA為模板的擴增產(chǎn)物；2：以矮抗58 cDNA為模板的擴增產(chǎn)物；3～4：分別以中國春和矮抗58 DNA為模板克隆第一內(nèi)含子序列；5～6:分別以中國春和矮抗58 DNA為模板克隆第二、三內(nèi)含子序列；7～9：分別為中國春 A、B、D基因組中TaNRX1基因上游調(diào)控區(qū)的擴增；10～12：分別為矮抗58 A、B、D基因組中TaNRX1基因上游調(diào)控區(qū)的擴增；白色箭頭標(biāo)注為目的片段。

M:Marker DL2000;1: PCR product using cDNA of Chinese Spring as template; 2:PCR product using cDNA of Aikang 58 as template;3-4:Cloning the first intron from Chinese Spring and Aikang 58,respectively; 5-6:Cloning the 2nd and 3rd intron regions from Chinese Spring and Aikang 58,respectively; 7-9:Cloning the upstream sequence ofTaNRX1gene in A,B and D genome of Chinese Spring,respectively;10-12:Cloning the upstream sequence ofTaNRX1gene in A,B and D genome of Aikang 58,respectively; White arrows indicate objective fragments.

圖2TaNRX1基因DNA片段克隆

Fig.2 DNA amplification ofTaNRX1

2.2 TaNRX1蛋白特性分析

對TaNRX1的序列特性分析顯示，TaNRX1-2AL、-2BL和-2DL分別編碼576、580和577個氨基酸，推測分子量分別為63.71 kDa、63.81 kDa和63.69 kDa，等電點分別為4.82、4.78和4.84。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，3個部分同源基因編碼的蛋白序列高度一致(>97.76%)，在第1個TryX_like_TryX_NRX保守域內(nèi)， TaNRX1-2BL和TaNRX1-2AL相比存在6個氨基酸的差異，TaNRX1-2DL存在5個氨基酸差異；在第2個保守域內(nèi)，和TaNRX1-2AL相比，B和D分別有2個和1個氨基酸差異，在第3個保守域內(nèi)，分別存在5個和1個位點差異。依據(jù)擬南芥核氧還蛋白NRX1(O80763.1)的序列，通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對分析獲得了植物中NRX的蛋白序列，并利用軟件MEGA 6.0對所獲得蛋白進行聚類分析(圖4)。結(jié)果顯示，在分析的3類核氧還蛋白(I～Ⅲ)中，第I類包含的成員最多，包括擬南芥的NRX1(O80763.1)、玉米的NRX1(NP_001105407.2)、高粱的NRX1-1(XP_002467709.1)、水稻的NRX1-1(XP_015630417.1)和NRX1-2(XP_015630416.1)。小麥的TaNRX1-2AL和NRX蛋白(AHL29285.1)氨基酸序列存在9個位點的差異，一致性為97.59%，這可能與小麥不同品種間的差異有關(guān)；TaNRX1-2DL與粗山羊草的NRX 1-2(XP_020183276.1)僅存在1個氨基酸差異。

○代表“MeJA響應(yīng)元件”；●代表“光響應(yīng)元件”；□代表“MYB結(jié)合元件”；■代表“ABA響應(yīng)元件”；▲代表“順式調(diào)控元件”。

○: MeJA response elements;●:Light response elements; □:MYB binding elements;■:ABA response elements; ▲Cis regulatory elements.

圖3TaNRX1基因上游調(diào)控元件分析

Fig.3Upstream regulatory elements ofTaNRX1gene

I：植物NRX家族第I亞類；II：植物NRX家族第II亞類；III：植物NRX家族第III亞類；[Ata]:粗山羊草；[Tae]:普通小麥；[Bd]:二穗短柄草；[Sb]:高梁；[Zm]:玉米；[Os]:水稻；[At]:擬南芥；[Tu]:烏拉爾圖小麥。

I:Plant NRX subfamily I; II:Plant NRX subfamily II; III:Plant NRX subfamily III; [Ata]:Aegilopstauschiisubsp.Tauschii;[Tae]:Triticumaestivum;[Bd]:Brachypodiumdistachyon; [Sb]:Sorghumbicolor;[Zm]:Zeamays;[Os]:OryzasativaJaponicagroup;[At]:Arabidopsisthaliana;[Tu]:Triticumurartu.

圖4 TaNRX1蛋白的聚類分析

Fig.4 Phylogenetic analysis of TaNRX1 proteins

蛋白二級結(jié)構(gòu)分析顯示， TaNRX1包含30%～31.21%的α-螺旋、18.62%～19.97%的β-折疊和48.53%～48.97%的無規(guī)則卷曲；三級結(jié)構(gòu)分析顯示， TaNRX1可以折疊形成一個C型的特定空間結(jié)構(gòu)，包括4個結(jié)構(gòu)單元(I～IV)，每個單元均有反向平行的β-折疊和外圍包被的α-螺旋構(gòu)成。

2.3 籽粒發(fā)育進程中 TaNRX1的表達模式

利用qRT-PCR技術(shù)分析了籽粒發(fā)育過程中TaNRX1的表達模式，結(jié)果(圖5)表明，在中國春和矮抗58中該基因的表達模式存在一定差異。在中國春中，TaNRX1在籽粒發(fā)育過程中呈逐漸下調(diào)趨勢；而在矮抗58中該基因雖然整體上隨籽粒的發(fā)育進程而下調(diào)表達，但在授粉后15 d和 25 d時出現(xiàn)兩次表達量回升，這可能與矮抗58小麥品種在籽粒發(fā)育過程中具有較強的抗逆特性有關(guān)[16]。

圖5 小麥 TaNRX1在籽粒發(fā)育過程中的表達特性

2.4 TaNRX1基因的組織表達特性

通過檢測不同組織中TaNRX1的表達特性(圖6)發(fā)現(xiàn)，中國春中該基因在穗下節(jié)組織中的表達水平最高(為籽粒中的92倍)，在節(jié)間和節(jié)等組織中次之(為籽粒中的42倍以上)；在矮抗58中TaNRX1的組織表達模式與中國春相似，不過在所檢測組織中(除節(jié)間外)該基因的表達量均低于中國春。TaNRX1在不同組織間的差異表達預(yù)示著該基因在小麥發(fā)育調(diào)控過程中發(fā)揮重要功能，在節(jié)間中兩個品種間表達量的差異可能與品種的株高特性有關(guān)。

圖6 TaNRX1在不同組織中的表達特性

3 討 論

硫氧還蛋白是一類廣泛存在于植物中的氧化還原調(diào)控蛋白，在調(diào)節(jié)細胞體內(nèi)功能蛋白的氧化還原狀態(tài)、蛋白的空間結(jié)構(gòu)及活性等方面具有重要的生物學(xué)功能[17]。硫氧還蛋白超家族成員較多，依據(jù)其在細胞中的分布特點可分為位于葉綠體內(nèi)的Trx-m、Trx-f、Trx-y、Trx-x、Trx-z、位于線粒體內(nèi)的Trx-o、位于細胞質(zhì)內(nèi)的Trx-h以及位于細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)的核氧還蛋白NRX[18]等。植物中核氧還蛋白可分為3個亞類，小麥的TaNRX1屬于第I亞類，且在2AL、2BL和2DL位點存在3個成員；氨基酸序列特性分析顯示， TaNRX1-2AL、TaNRX1-2BL和TaNRX1-2DL均包含3個TryX_like_TryX_NRX結(jié)構(gòu)域，推測TaNRX1的3個成員間可能存在功能冗余；對TaNRX1蛋白C端氨基酸序列分析顯示，該區(qū)域為典型的C1保守域，可與兩個鋅離子結(jié)合形成鋅指結(jié)構(gòu)。

小麥籽粒發(fā)育進程直接決定了其產(chǎn)量和品質(zhì)[19]，而硫氧還蛋白可能參與了籽粒發(fā)育的調(diào)控過程[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，中國春和矮抗58小麥籽粒發(fā)育過程中TaNRX1逐漸下調(diào)表達，其表達水平與籽粒發(fā)育進程負相關(guān)；從TaNRX1的組織表達特性來看，該基因在快速生長的節(jié)間和節(jié)組織中表達水平最高，在生長緩慢的根和葉組織中表達水平次之，而在發(fā)育停滯的成熟種子中表達水平極低。由此推測，小麥TaNRX1基因在細胞分裂及發(fā)育調(diào)控過程中發(fā)揮重要功能。另外，序列分析表明TaNRX1的3個部分同源基因間在cDNA區(qū)域序列高度相似(98%)，均可編碼包含3個TryX_like_TryX_NRX保守結(jié)構(gòu)的典型核氧還蛋白，推測小麥TaNRX1的3個部分同源基因間存在功能冗余；不過，在上游調(diào)控區(qū)(特別是上游340～1 300 bp的區(qū)域內(nèi))3個部分同源基因間存在較大差異，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的類型、數(shù)量和位置均存在一定差異，預(yù)示著該基因3個部分同源基因間具有不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。關(guān)于該基因3個部分同源基因間的時空表達模式差異及調(diào)控機制有待于進一步研究。