秦 艷 陳 瑩 劉小燕 彭 敏 周東華

1.南方醫(yī)科大學附屬佛山婦幼保健院病理科，廣東佛山 528000；2.南方醫(yī)科大學附屬佛山婦幼保健院婦科，廣東佛山 528000

子宮頸病變發(fā)展是從低級別鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL）到子宮頸癌相對緩慢的過程。LSIL 患者約57%～61%可自然消退，22%～32%長期持續(xù)在LSIL 狀態(tài)，1%～11%可進展為高級別鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL）和宮頸磷癌（squamous cell carcinoma，SCC）[1]。LSIL 本身是一種良性病變，不治療其自然消退率很高，進展率很低，然而其作為宮頸癌前病變，如不及時干預(yù)，部分患者可于7～10 年進展為宮頸癌。日前缺乏明確手段或技術(shù)去預(yù)測孰進孰退，臨床尚缺乏對LSIL 患者轉(zhuǎn)歸的細化方案。如何規(guī)范化處理LSIL 避免其治療過度或不足，是一個值得探討的問題。因此尋找有效的生物標志物來判斷LSIL的預(yù)后，以實現(xiàn)分類管理和治療是目前研究的熱點。本研究聯(lián)合檢測Cervista 高危HPV 分型（HR-HPV）與CK8/18、P120ctn 表達在預(yù)測LSIL 進展和轉(zhuǎn)歸中的價值，研究其與LSIL 的相關(guān)性，探討病變結(jié)局的好轉(zhuǎn)或惡化。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012 年12 月～2016 年12 月就診于南方醫(yī)科大學附屬佛山婦幼保健院同時行液基細胞學檢測及組織活檢確診為LSIL 患者119 例，年齡21～50 歲，平均（33.8±7.5）歲。其中進展組28 例，持續(xù)組41例，消退組50 例，所有病例追蹤隨訪時間均達2 年及以上。另收集HSILSCC 對照組20 例，正常宮頸（正常對照組）15 例。本研究經(jīng)我院相關(guān)醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 Cervista HR-HPV 檢測采用Cervista HRHPV DNA 檢測試劑盒（批號：20153404099，Hologic 公司)檢測14 種HR-HPV，嚴格依照試劑盒說明書步驟操作。

1.3 免疫組化結(jié)果判讀標準

CK8/18 染色陽性為胞漿內(nèi)見黃色顆粒，參照Carrilho 半定量評判標準[2]，按切片中陽性細胞占所觀察同類細胞數(shù)百分比，分3 類：＞75%為（+++），5%～75%為（+～++），無著色為（－）。P120ctn 正常表達定位于細胞膜，可少量胞漿表達，表現(xiàn)為棕褐色著色清楚為（+++），宮頸病變時，膜表達下降或缺失表現(xiàn)為細胞膜著色變淺或消失，出現(xiàn)胞漿或胞核染色為（+～++），表達缺失為（-）。

1.4 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LSIL 患者HR-HPV 分型比較

各組HR-HPV 分型比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=12.98，P ＜0.05）。進展組A9 型陽性率均高于A7 及A5/A6 型（χ2=15.33、20.31，P ＜0.05），高于持續(xù)組及消退組（χ2=14.67、34.61，P ＜0.05），其中混合感染包含兩型或以上同時感染。見表1。

表1 LSIL 患者各亞組HR-HPV 分型的陽性率比較[例（%）]

2.2 各組CK8/18 表達情況

CK8/18 在正常宮頸鱗狀上皮不表達；進展組總陽性率高于持續(xù)組及消退組（P ＜0.05）。在HSILSCC中有不同程度表達，表達強度隨病變級別增高而增強。LSIL 組間總陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=18.29，P ＜0.05）。LSIL 組總陽性率與HSILSCC 對照組、正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=29.33、94.50，P ＜0.05）。見表2，圖1（封四）。

表2 CK8/18 在各組中的表達情況

2.3 各組P120ctn 表達情況

P120ctn 在正常對照組陽性完全表達，消退組陽性表達率高于進展組及持續(xù)組（P ＞0.05）。LSIL 組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=11.84，P ＜0.05）。LSIL組總陽性率低于正常對照組，高于HSILSCC 對照組，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.19、15.08，P ＜0.05）。見表3、圖2（封四）。

表3 P120ctn 在各組中的表達情況

3 討論

子宮頸病變發(fā)展是從LSIL 到宮頸癌相對緩慢過程，早期處理診斷是預(yù)防宮頸癌的重要手段。臨床醫(yī)師每天需處理很多宮頸病變患者，尤其是LSIL，LSIL一般無明顯臨床癥狀，易被忽略，其自然病程可有3種結(jié)局，即消退、持續(xù)不變或進展，有些醫(yī)生為了避免LSIL 進展為HSIL，給患者提供LEEP 術(shù)。雖然LEEP術(shù)在切除病變的同時，能清除HPV 感染，降低LSIL進展概率，但這種處理方式對一過性感染HPV 患者造成過度治療、過度消耗醫(yī)療資源，并可能使患者發(fā)生醫(yī)源性并發(fā)癥[3-4]。但目前LSIL 缺乏明確、客觀、實用的評價指標，缺乏轉(zhuǎn)歸的細化方案。如何規(guī)范化處理LSIL 避免其治療過度或不足，是一個值得探討的問題。LSIL 特征是基底層/副基底層細胞增殖，可以是很輕微的增殖，最多不超過上皮下1/3 層。大多宮頸LSIL（80%～85%）是由于HR-HPV 的感染。其余的LSIL 為低危型HPV（LR-HPV）感染[5-6]。HPV 感染所引起疾病通常要經(jīng)過潛伏感染期、亞臨床感染期、臨床感染期和HPV 相關(guān)腫瘤期。并非所有的HPV 感染者均會發(fā)展為鱗狀上皮內(nèi)病變和癌癥，主要取決于病毒因素（HPV 首次感染時間、HPV 含量水平、HPVDNA 型別），宿主因素（激素和營養(yǎng)狀況、免疫功能，妊娠），環(huán)境協(xié)同因素（與宮頸癌的行為危險因素基本一致）等在多種因素協(xié)同下，持續(xù)HR-HPV 感染可導致HPV 負荷量的增加，高負荷量HPV 對于宮頸移行上皮細胞的局部長期刺激，從而促進病變的進展[7]。Cervista HR-HPV 篩查技術(shù)，初級反應(yīng)為探針寡核苷酸、Invader 寡核苷酸與DNA 目標序列結(jié)合進行切割，次級反應(yīng)切割片段與熒光素標記的寡核苷酸結(jié)合，再與Cleavase 酶識別結(jié)合，產(chǎn)生熒光放大信號，檢測HR-HPV 的L1、E6、E7 區(qū)[8]。每次檢測均設(shè)置內(nèi)部質(zhì)控人組蛋白Ⅱ基因特異的寡核苷酸，可消除因樣本量不足導致的假陰性結(jié)果；不與LR-HPV發(fā)生交叉反應(yīng)，避免假陽性結(jié)果。設(shè)立外部質(zhì)控（陰性對照和陽性對照），保證每次結(jié)果的準確性、特異性更高。該技術(shù)對宮頸病變的敏感度和陰性預(yù)測值均較高，能一次檢測由國際癌癥研究署確定的14 種HR-HPV，并區(qū)分A9、A7、A5/A6 三個型組。有研究表明A9 型組HR-HPV 感染者患宮頸癌或癌前病變的風險更高[9-12]。A9 型組有較高的致病性，較易導致宮頸癌的發(fā)生，應(yīng)對A9 型組HR-HPV 感染者高度重視，提高防治力度，可減少宮頸癌發(fā)生。

細胞角蛋白（CK）是一種細胞中間絲蛋白，是上皮性腫瘤較特異的免疫組織化學標志物，具有顯著的分子多樣性，不同上皮組織和細胞分化的不同階段表達不同的CK。正常宮頸組織中的各種細胞分別表達不同的CK，在正常宮頸組織向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)化的過程中，一些CK 表達會發(fā)生變化，并表現(xiàn)出一定規(guī)律性，因此CK 可能在宮頸癌診斷和預(yù)后判斷中發(fā)揮作用。目前在人類共發(fā)現(xiàn)有54 種基因型，但研究較多的是較早發(fā)現(xiàn)的20 種，其分子量為44～66 kDa。CK8 是單層上皮組織細胞內(nèi)重要的細胞骨架成分，是中間纖維絲蛋白家族的主要成員之一[13-17]。目前有關(guān)CK17、CK7、CK13 等在宮頸病變中表達研究較多，CK8/18 鮮有報道。本研究CK8/18 在宮頸組織中陽性表達定位于細胞漿，正常宮頸鱗狀上皮不表達；進展組高于持續(xù)組及消退組。LSIL 組間，LSIL 與HSILSCC 比較差異有統(tǒng)計學意義，提示CK8/18 表達升高在宮頸病變發(fā)生發(fā)展中可能存在重要作用，檢測CK8/18 可作為預(yù)測LSIL 是否進展的輔助手段之一。

P120ctn 為連環(huán)素家族成員之一，位于細胞間連接處和細胞核內(nèi)，能調(diào)節(jié)鈣黏蛋白更新和代謝，在細胞黏附、運動中起重要作用，與細胞遷移、侵襲等有密切關(guān)系。P120ctn 在鈣黏蛋白依賴性黏附中既有正性調(diào)節(jié)作用又有負性調(diào)節(jié)作用。它是鈣黏蛋白表達的感受器，是控制鈣黏蛋白作用的可變電阻器和調(diào)定點。有研究表明[18－20]，P120ctn 通過改變細胞間的粘黏、調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)細胞周期，影響腫瘤的生物學特性，涉及到細胞的增殖、分化、粘黏、浸潤等多個環(huán)節(jié)，參與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，從而影響患者的預(yù)后。目前，對在腫瘤的不同時期中，P120ctn 表達及作用途徑的差異研究還不十分充分。而這可能說明P120ctn 與腫瘤的分級和患者預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)，如果能進一步證實P120ctn 的異常表達是腫瘤進展的早期改變，對于宮頸病變是否進展的預(yù)測將對患者大有裨益。本研究LSIL 組中消退組P120ctn 陽性表達率高于進展組及持續(xù)組，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。提示P120ctn 表達降低在早期診斷和監(jiān)測宮頸病變發(fā)生發(fā)展中可能存在重要作用，檢測P120ctn 蛋白表達可作為預(yù)測LSIL 是否進展的輔助手段之一。

本研究為LSIL 患者尋找規(guī)范化治療提供客觀的科學依據(jù)，制訂出個體化治療或隨診方案，通過多種方法的聯(lián)合檢測，嘗試預(yù)測LSIL 的進展和轉(zhuǎn)歸，探討LSIL 的轉(zhuǎn)歸機制，對疾病進行早期診斷和規(guī)范化治療，減少患者心理恐慌和不必要的檢測次數(shù)及醫(yī)療費用，提高患者的依從性，避免其治療過度或不足，使更多的LSIL 患者獲益，為患者和國家節(jié)省后期的醫(yī)療費用開支及人力成本，具有良好的經(jīng)濟效益和社會效益。綜上所述，聯(lián)合分析Cervista 高危HPV 分型與檢測CK8/18、P120ctn 表達情況可能能夠預(yù)測LSIL 的預(yù)后，有助于LSIL 的分層分流管理診治。