韓躍輔 陳 東 彭 斂 黃洪才

廣東省粵北人民醫(yī)院泌尿外科一區(qū)，廣東韶關(guān) 512026

全球范圍內(nèi)，前列腺癌（PCa）是老年男性常見(jiàn)惡性腫瘤。2012 年全球男性PCa 的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中居第二位[1-2]。PCa 是激素依賴(lài)性的惡性腫瘤，經(jīng)雄激素剝奪治療一段時(shí)間后出現(xiàn)雄激素抵抗的現(xiàn)象，形成去勢(shì)抵抗PCa，可發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者不良的生存預(yù)后[3]。因此深入研究PCa 的病因及其發(fā)生發(fā)展機(jī)制，對(duì)于早期診斷及尋找有效的治療靶點(diǎn)具有重要意義。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C（VEGF-C）位于人類(lèi)染色體4q34.3，該基因編碼的VEGF-C 蛋白質(zhì)是血小板衍生生長(zhǎng)因子/VEGF 家族的成員，VEGF-C 的蛋白前體經(jīng)過(guò)裂解加工后，可結(jié)合并激活VEGF 受體2，促進(jìn)淋巴管生成與淋巴內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)[4-5]。B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-xl（Bcl-xl）基因編碼的蛋白是B 細(xì)胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）家族的抗凋亡蛋白。研究[6-7]表明，細(xì)胞外的整合素信號(hào)活化可通過(guò)活化核因子κB（NFκB）通路與Bcl-xl 增強(qiáng)促炎性趨化因子8（CXCL8）的分泌，參與促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展過(guò)程。本研究通過(guò)檢測(cè)PCa 組織中VEGF-C、Bcl-xl 的表達(dá)，研究?jī)烧唛g的關(guān)系及與臨床病理特征的關(guān)系，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014 年1 月～2016 年6 月就診于廣東省粵北人民醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“我院”）的132 例PCa 患者的臨床病理資料作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有PCa患者均經(jīng)穿刺活檢病理或術(shù)后病理檢查確診；②臨床病理及隨訪資料完整；③患者一般狀況良好，Karnofsky功能狀態(tài)評(píng)分（KPS 評(píng)分）≥80 分。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并急慢性前列腺炎、泌尿生殖系感染、呼吸道感染等疾病者；②合并其他器官系統(tǒng)的惡性腫瘤者；③合并心肝腎等重要臟器功能不全者；④患者近3 月有心腦血管疾病病史者；⑤既往接受過(guò)內(nèi)分泌、放射治療等抗腫瘤治療者。年齡50～75 歲，平均（61.8±7.2）歲。PCa 病理分級(jí)根據(jù)Gleason 評(píng)分系統(tǒng)具體分為Gleason 評(píng)分≤6 分61 例，Gleason 評(píng)分≥7 分71 例。腫瘤TNM分期參照《中國(guó)泌尿外科疾病診斷治療指南》[8]中推薦的標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ期82 例，Ⅲ～Ⅳ期50 例?；颊呷朐汉蟪跏佳迩傲邢偬禺愋钥乖≒SA）：8.1～190.0 ng/mL，中位PSA 為44.6 ng/mL，其中≤20.0 ng/mL 39 例，＞20.0 ng/mL 93 例。伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移31 例，不伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移101 例。所有PCa 患者的治療方案選擇參照《中國(guó)泌尿外科疾病診斷治療指南》[8]中首選的治療方案（推薦分級(jí)A）。選取我院同期手術(shù)治療的40 例良性前列腺增生（BPH）患者作為研究對(duì)象。年齡52～77 歲，平均（63.5±6.9）歲。BPH 患者為初次診斷，未接受過(guò)藥物、手術(shù)等其他治療，并排除其他惡性腫瘤。所有PCa患者均予以隨訪，自出院之日起開(kāi)始隨訪，隨訪期間無(wú)失訪病例，隨訪時(shí)間2～48 個(gè)月，中位隨訪時(shí)間35.1 個(gè)月，采用門(mén)診復(fù)查或電話方式進(jìn)行隨訪，隨訪內(nèi)容包括患者生存狀況等，隨訪終點(diǎn)為隨訪時(shí)間的結(jié)束或患者死亡，隨訪截至2019 年6 月。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，所有患者知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 組織中VEGF-C mRNA 和Bcl-xl mRNA 表達(dá)檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）法檢測(cè)組織中VEGF-C mRNA 和Bcl-xl mRNA 的表達(dá)。收集術(shù)中獲取的新鮮PCa 組織及BPH 組織，液氮速凍后轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，置于-80℃冰箱保存。取約100 mg 的組織，研缽研磨后應(yīng)用Trizol 法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)鑒定提取RNA 的濃度和純度。以2 μg 總RNA 為模板，用TaqMan 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，生產(chǎn)批號(hào)：20130726）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。VEGF-C 引物正向序列：5′-GAGGAGCAGTTACGGTCTGTG-3′，反向引物序列：5′-TCCTTTCCTTAGCTGACACTTGT-3′；Bclxl 引物正向序列：5′-G-GAGAGCGTTCAGTGATC-3′，反向引物序列：5′-GG-AGAGCGTTCAGTGATC-3′；內(nèi)參基因GAPDH 上游序列：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游序列：3′-GCCATCACGCCACAGTTTC-5′。PCR 總反應(yīng)體系為20 μL，包括2 μL 的模板cDNA，上游及下游引物各1 μL，Power SYBR Green Master Mix 試劑12.5 μL、ddH2O 補(bǔ)足體系至3.5 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s、60℃退火/延伸45 s，變性和退火/延伸步驟共40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3 次，最終結(jié)果取平均值。最終結(jié)果應(yīng)用2-ΔCt值表示，目的基因VEGF-C、Bcl-xl 的相對(duì)表達(dá)水平的計(jì)算公式為：ΔCt=CtVEGF-C/Bcl-xl-CtGAPDH。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。Pearson 線性相關(guān)分析VEGF-C mRNA 和Bcl-xl mRNA 表達(dá)之間的相關(guān)性。Kaplan-Meier 生存分析探究不同VEGF-C、Bcl-xl 表達(dá)患者生存預(yù)后差異。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCa 和BPH 組織中VEGF-C mRNA 和Bcl-xl mRNA 的表達(dá)比較

PCa 組織VEGF-C mRNA 的相對(duì)表達(dá)量（12.64±1.53）明顯高于BPH 組織（7.67±1.21），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.825，P=0.000）；PCa 組織Bcl-xl mRNA 的相對(duì)表達(dá)量（1.52±0.40）明顯高于BPH 組織（0.74±0.22），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.788，P=0.000）。Pearson 線性相關(guān)分析結(jié)果示，PCa 組織中VEGF-C mRNA 與Bcl-xl mRNA 的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.637，P=0.008）。

2.2 PCa 組織VEGF-C mRNA、Bcl-xl mRNA 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

不同年齡、Gleason 評(píng)分、入院PSA 的患者PCa組織中VEGF-C mRNA、Bcl-xl mRNA 表達(dá)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05）。不同TNM 分期及是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者PCa 組織中VEGF-C mRNA、Bcl-xl mRNA 表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。Ⅲ～Ⅳ期、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移PCa 組織中VEGF-C mRNA、Bcl-xl mRNA 表達(dá)明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者。見(jiàn)表1。

表1 患者臨床病理特征的關(guān)系與癌組織中VEGF-C mRNA、Bcl-xl mRNA 表達(dá)（）

表1 患者臨床病理特征的關(guān)系與癌組織中VEGF-C mRNA、Bcl-xl mRNA 表達(dá)（）

注：VEGF-C：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C；Bcl-xl：B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-xl；PSA：前列腺特異性抗原

2.3 VEGF-C mRNA、Bcl-xl mRNA 的表達(dá)與PCa患者預(yù)后關(guān)系

以VEGF-C mRNA 的均值12.64 為界，分為高VEGF-C mRNA 組（63 例）和低VEGF-C mRNA 組（69 例），兩組3 年總體生存率（OS）比較，高VEGF-C mRNA 組3 年OS（57.1%）明顯低于低VEGF-C mRNA 組（88.4%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.134，P=0.000）。以Bcl-xl mRNA 均值1.52 為界，分為高Bcl-xl mRNA組（65 例）和 低Bcl-xl mRNA 組（67 例），高Bcl-xl mRNA 組3 年OS（58.4%）明顯低于低Bcl-xl mRNA組（88.1%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.875，P=0.003）。見(jiàn)圖1。

3 討論

PCa 是男性中排第二位的常見(jiàn)的惡性腫瘤。目前研究已表明年齡、種族、遺傳和職業(yè)等因素均能夠影響PCa 疾病的發(fā)生和發(fā)展[9]。VEGF-C 在結(jié)合并激活血管內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞表面VEGFR-2 和VEGFR-3受體后，可促進(jìn)血管生成和腫瘤細(xì)胞的增殖，并有利于腫瘤細(xì)胞的血行轉(zhuǎn)移[10-11]。本研究中，PCa 組織中VEGF-C mRNA 表達(dá)明顯高于BPH 組織。其原因是正常狀態(tài)時(shí)上皮細(xì)胞膜蛋白-1（EMP-1）能夠抑制半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶和VEGF-C 蛋白的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞增殖發(fā)揮抑制負(fù)性調(diào)控作用，而PCa 組織中EMP-1 表達(dá)降低，抑制作用減弱，導(dǎo)致VEGF-C蛋白表達(dá)水平升高[12-13]。本研究中，不同TNM 分期及是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的的患者PCa 組織中VEGF-C mRNA 表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。其原因是腫瘤組織中VEGF-C mRNA 表達(dá)增加能夠促進(jìn)趨化因子受體7（CCR7）的表達(dá)增加和活化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，使腫瘤分期增高，而在干擾RNA轉(zhuǎn)染的PCa 細(xì)胞中敲低CCR7 的表達(dá)后，VEGF-C誘導(dǎo)PCa 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力顯著被抑制[14]。此外，伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者癌組織中VEGF-C mRNA 的表達(dá)較高，其機(jī)制是腫瘤微環(huán)境中VEGF-C mRNA 的表達(dá)增加后，通過(guò)旁分泌作用與血管內(nèi)皮細(xì)胞及淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管淋巴管的生成，并且由于新生血管基底膜不完整，腫瘤細(xì)胞易侵襲浸潤(rùn)至血管腔內(nèi)，進(jìn)而向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶轉(zhuǎn)移[15]。本研究中高VEGF-C mRNA 表達(dá)患者3 年OS 明顯較低，提示PCa 組織中VEGF-C mRNA 的表達(dá)有可能成為新的提示PCa 預(yù)后的分子標(biāo)志。

圖1 不同VEGF-C mRNA、Bcl-xl mRNA 表達(dá)水平與PCa 患者預(yù)后的關(guān)系

Bcl-xL 是Bcl-2 蛋白家族成員，當(dāng)DNA 損傷或大量蛋白質(zhì)聚集時(shí)，凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路激活，含BH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)如p53 激活細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子（PUMA），促凋亡蛋白從Bcl-xL 的結(jié)合中釋放，導(dǎo)致下游凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)[16]。抗凋亡蛋白在多種不同的實(shí)體腫瘤中過(guò)表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制其凋亡，并參與腫瘤的耐藥過(guò)程[17]。本研究中，PCa 組織中Bcl-xL mRNA 表達(dá)上調(diào)。其機(jī)制可能是調(diào)控其表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA-HEIH 表達(dá)升高后，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合并抑制mir-939 的表達(dá)，導(dǎo)致mir-939 對(duì)Bcl-xL表達(dá)抑制作用減弱[18]。本研究中，不同TNM 分期及是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的的患者PCa 組織中Bcl-xl mRNA表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。其原因除腫瘤細(xì)胞凋亡減少外，Bcl-xL 還具有促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用[19]。此外，Bcl-xL mRNA 高表達(dá)患者生存預(yù)后較差，表明Bcl-xL mRNA 亦可能成為PCa 預(yù)后的分子標(biāo)志。本研究中，PCa 組織中VEGF-C mRNA 與Bcl-xL mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)，可能是VEGF-C mRNA表達(dá)升高后結(jié)合細(xì)胞表面的VEGFR2，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)PI3K-Akt 信號(hào)通路的傳導(dǎo)，蛋白激酶B（PKB）磷酸化Bcl-2 相關(guān)的細(xì)胞死亡激動(dòng)劑（Bad）后，Bad 對(duì)Bcl-xL 表達(dá)的抑制作用降低。有報(bào)道[20]稱(chēng)靶向Y-盒結(jié)合蛋白1 的反義寡核苷酸能通過(guò)下調(diào)Bcl-xLVEGFR2 軸，發(fā)揮抑制腫瘤血管生成作用，證實(shí)VEGFC 與Bcl-xL 在腫瘤發(fā)生及血管生成過(guò)程中可能存在協(xié)同作用。

綜上所述，PCa 組織中VEGF-C mRNA 與Bcl-xL mRNA 均表達(dá)升高，兩者與PCa 的腫瘤TNM 分期、是否伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能均參與促進(jìn)PCa 的發(fā)展過(guò)程，但兩者的相互作用機(jī)制及臨床意義尚需要進(jìn)一步研究。