劉 磊 曾 彬 廖小婷

武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科 武漢大學(xué)心血管病研究所 心血管病湖北省重點實驗室，湖北武漢 430060

三碘甲腺原氨酸（T3）是甲狀腺分泌的主要活性物質(zhì)之一，T3已經(jīng)證明可以改善心肌收縮功能，保護(hù)受損后心功能[1-2]。PI3K/Akt 信號通路參與心肌缺血再灌注損傷，且激活這一通道能減少缺血再灌注損傷，保護(hù)心肌[3]。T3可以激活A(yù)kt 信號通路從而發(fā)揮心臟保護(hù)作用，但T3對心肌細(xì)胞電生理的影響研究很少。本研究建立缺氧/復(fù)氧（H/R）模型，并用膜片鉗全細(xì)胞技術(shù)觀察T3對乳小鼠心室肌細(xì)胞L-型鈣離子通道電流（ICaL）的作用，旨在探討T3對心臟鈣離子通道的影響，并且驗證PI3K/Akt 信號通路是否在其中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 1～2 d 新生C57BL/6 小鼠20 只，雌雄不限，合格證號：SCXK（鄂）2015-0018，由湖北省實驗動物中心提供。

1.1.2 藥品和試劑 DMEM-F12 培養(yǎng)基（Hyclone 公司）；胎牛血清（Gibico 公司）；膠原酶Ⅱ、甲狀腺素T3、LY294002（Sigma 公司）；胰酶（Beyontime 公司）；兔抗鼠P-Akt、兔抗鼠P-PI3K（美國CST 公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（美國ASPEN 公司）；未注明者均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 溶液配制 記錄ICaL的細(xì)胞外液成分：氯化膽堿100 mmol/L，NaCl 35 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，MgCl21.0 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，NaH2PO40.33 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，BaCl20.1 mmol/L，4-氨基吡啶3 mmol/L，NaOH 調(diào)整pH 值到7.35。記錄ICaL電極內(nèi)液成分：CsCl2120 mmol/L，CaCl21.0 mmol/L，Na2ATP 5 mmol/L，MgCl25 mmol/L，EGTA 11 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，CSOH 調(diào)整pH 值到7.2。

1.2 方法

1.2.1 心肌細(xì)胞培養(yǎng) 參照之前的方法[4]，取20 只1～2 d 小鼠，將心臟置于預(yù)冷PBS 液中清洗，留取心室并將心室肌組織剪碎，吸入含10 mL 的0.125%胰酶的離心管中4℃過夜。后用含0.035%膠原酶Ⅱ的消化液于37℃水浴振搖消化，待液體變混濁后停止消化，重復(fù)消化6～7 次直至消化完全。將收集的上清液1000 r/min 離心10 min，用含15%胎牛血清的完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。接種于10 cm 培養(yǎng)皿中并置于培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中差速貼壁1 h，將細(xì)胞懸液種于35 mm（1×106/mL）培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

1.2.2 心肌細(xì)胞H/R 模型的建立及實驗分組 細(xì)胞貼壁完全且搏動良好后，將培養(yǎng)液換為2 mL PBS 液，于缺氧培養(yǎng)箱（94%N2，5%CO2，1%O2，37℃）中培養(yǎng)4 h。隨后吸去PBS 液，更換為完全培養(yǎng)液并放入普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，即完成H/R 過程。本實驗分為五組：正常對照（Control）組、H/R 組、T3+H/R 組、T3+H/R+LY 組、H/R+LY 組。T3（20 ng/mL）在H/R 前24 h 加入培養(yǎng)液中；LY294002（LY）為PI3K/Akt 通路阻滯劑[5]，在細(xì)胞H/R 前24 h 以10 μmol/L 加入培養(yǎng)液中。

1.2.3 ICaL的記錄 應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄細(xì)胞鈣離子通道電流，微電極充灌電極內(nèi)液后電阻在5～7 MΩ。室溫下，將細(xì)胞放入細(xì)胞槽內(nèi)，用電極外液以2～3 mL/min 的流速進(jìn)行灌流。選用大小相近、細(xì)胞狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實驗。待高阻封接形成后，負(fù)壓脈沖破膜，補(bǔ)償膜電容、串聯(lián)電阻及漏電流，形成全細(xì)胞記錄方式，平衡5 min，待電極內(nèi)液與細(xì)胞內(nèi)液交換充分后，進(jìn)行膜電流記錄。膜電流的大小以電流密度，即pA/pF 表示。

1.2.4 Western blot 測定PI3K/Akt 通路的蛋白表達(dá) 在培養(yǎng)皿中加入裂解液進(jìn)行蛋白提純，采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，然后用兔抗鼠P-Akt、兔抗鼠P-PI3K 抗體4℃孵育過夜。次日用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影。采用凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP 公司）進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin 條帶灰度值的比值反映P-Akt 和P-PI3K 的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T3對乳鼠心肌細(xì)胞H/R 損傷ICaL的影響

形成全細(xì)胞構(gòu)型后，在電壓鉗模式下記錄電流。鉗制電位固定于-40 mV，指令電壓從-50 mV 以10 mV為步階逐步階躍至+60 mV。各組電流-電壓（I-V）曲線形狀近似。與Control 組比較，H/R 組ICaL峰值電流減?。≒ ＜0.01），I-V 曲線上移；與H/R 組比較，T3+H/R 組ICaL峰值電流增大（P ＜0.01），T3能部分恢復(fù)H/R損傷引起的I-V 曲線上移，且T3+H/R 組I-V 曲線左移，峰值電位從+10 mV 減小至-10 mV；與H/R 組比較，H/R+LY 組ICaL峰值電流減?。≒ ＜0.01）；與T3+H/R 組比較，T3+H/R+LY 組ICaL峰值電流減小（P ＜0.01）。見圖1。

2.2 T3對H/R 乳鼠心室肌細(xì)胞ICaL穩(wěn)態(tài)失活曲線及穩(wěn)態(tài)激活曲線的影響

采用雙脈沖實驗方法測定失活曲線，鉗制電壓-40 mV，將保持電位維持在-50 mV，從-50 mV 增加到60 mV（躍階10 mV），記錄內(nèi)向峰電流，然后給測試電位0 mV，持續(xù)300 ms。以電流的相對值（I/Imax）對條件脈沖電壓作圖，得出ICaL穩(wěn)態(tài)失活曲線（圖2a）。依Boltzman 方程I/Imax=1/[1+exp（V-V1/2）/K]進(jìn)行擬合。式中Imax為最大膜電流，V1/2為半數(shù)失活電壓，K 為斜率參數(shù)。結(jié)果顯示，與Control 組比較，H/R 組V1/2減小[（-16.10±4.03）mV 比（-25.32±1.48）mV，P <0.05]，失活曲線右移，失活減慢。與H/R 組比較，T3+H/R組[（-24.49±1.58）mV]的V1/2增大（P <0.05），失活曲線左移，失活加快。各組K 值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P >0.05）。

將ICaL的I-V 曲線的結(jié)果轉(zhuǎn)化為膜電導(dǎo)（G），對條件刺激電壓作圖，采用Boltzman 方程G/Gmax=1/[1+exp（V-V1/2）/K]進(jìn)行擬合，得到ICaL穩(wěn)態(tài)激活曲線（圖2b）。Gmax為最大膜電導(dǎo)，V1/2為半數(shù)激活電壓，K 為斜率參數(shù)。結(jié)果顯示，與Control 組比較，H/R 組V1/2升高[（-24.20±0.35）mV 比（-10.04±0.33）mV，P <0.05]，激活曲線左移，激活加快；與H/R 組比較，T3+H/R 組[（-16.39±0.53）mV]的V1/2減?。≒<0.05），激活曲線右移，激活減慢。各組K 值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖2 各組乳小鼠心室肌細(xì)胞L-鈣離子通道穩(wěn)態(tài)失活曲線及穩(wěn)態(tài)激活曲線

2.3 PI3K/Akt 信號通路在T3對心肌細(xì)胞H/R 損傷中的作用

與Control 組比較，H/R 組心肌細(xì)胞P-PI3K 及P-Akt 表達(dá)減少（P <0.01）；與H/R 組比較，T3+H/R組心肌細(xì)胞P-PI3K 及P-Akt 表達(dá)增加（P ＜0.01），H/R+LY 組心肌細(xì)胞P-PI3K 及P-Akt 表達(dá)減少（P ＜0.01）；與T3+H/R 組比較，T3+H/R+LY 組心肌細(xì)胞P-PI3K及P-Akt 表達(dá)減少（P ＜0.01）。見圖3。

圖3 Western blot 檢測H/R 模型和T3對PI3K/Akt 信號通路表達(dá)的影響

3 討論

鈣離子作為第二信使，在細(xì)胞病理和生理過程中起著重要作用，心肌細(xì)胞鈣離子的轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)心肌收縮與舒張。本實驗利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，證實H/R可顯著降低ICaL。很多文獻(xiàn)已經(jīng)報道T3對心血管的保護(hù)作用[1-2]，本實驗發(fā)現(xiàn)T3可以有效抑制H/R 誘導(dǎo)的鈣離子通道損傷，保護(hù)心肌細(xì)胞L-型鈣離子通道，且保護(hù)作用可通過激活PI3K/Akt 信號通路來實現(xiàn)。

急性心肌梗死后容易并發(fā)缺血再灌注損傷，后者可以誘發(fā)一系列病理過程，如線粒體膜電位的損傷，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，氧化應(yīng)激產(chǎn)物的形成等，這些會誘導(dǎo)心律失常、微循環(huán)障礙的發(fā)生，甚至最終造成嚴(yán)重的心力衰竭[6-7]。有研究表明，胞漿鈣離子的釋放不僅通過心肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP 酶2a（SERCA2a），也通過Na+-Ca2+交換[8-9]。缺血再灌注損傷可導(dǎo)致Na+-Ca2+交換增加有關(guān)并誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣超載[6]。研究顯示，缺血再灌注損傷時心肌細(xì)胞動作電位時程縮短，導(dǎo)致心肌細(xì)胞動作電位的不均一性，誘發(fā)折返性心律失常[10]。本實驗利用膜片鉗技術(shù)記錄H/R 損傷后的細(xì)胞鈣離子，發(fā)現(xiàn)L-型鈣離子通道受到抑制，峰值電流較正常心肌細(xì)胞明顯下降，I-V 曲線上移，與之前的研究一致[10-12]。

甲狀腺激素可以調(diào)節(jié)心肌收縮蛋白及鈣處理蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞離子通道及交感神經(jīng)興奮系統(tǒng)在心血管系統(tǒng)中的表達(dá)[13]。既往有研究顯示，急性心肌梗死常伴隨著體內(nèi)甲狀腺激素水平的改變[13-14]，大量報道也證實，急性心肌梗死后運用低劑量T3可以促進(jìn)心功能恢復(fù)并減輕心室重塑[1-2]，T3可以激活A(yù)kt并保護(hù)心功能[15-18]。本實驗通過T3預(yù)處理證實T3可以減輕H/R 對ICaL的抑制，恢復(fù)部分上移的I-V 曲線，恢復(fù)左移的激活曲線，使激活減慢，恢復(fù)右移的失活曲線，使失活加快。PI3K/Akt 是細(xì)胞的重要信號通路，在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、自噬、分化等方面均發(fā)揮重要作用[3，19]，激活這一通道能保護(hù)心肌并減少缺血再灌注引起的損傷[3]。在本實驗中，H/R 損傷可減少PI3K/Akt 信號通路的激活，而T3預(yù)處理可顯著增加P-PI3K 和P-Akt 的表達(dá)。當(dāng)加入PI3K/Akt 特異性通道阻滯劑后，T3對ICaL的作用被明顯抑制，證明T3通過激活PI3K/Akt 信號通路發(fā)揮作用。有研究顯示，Akt 的激活可以增加ICaL[20]，本實驗通過抑制PI3K/Akt 信號通路發(fā)現(xiàn)T3對L-型鈣離子通道的作用可能是由PI3K/Akt 信號通路來發(fā)揮的。

綜上，H/R 損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞ICaL下降，T3可以保護(hù)L-型鈣離子通道，減少通道電流的下降，其可能是通過PI3K/Akt 信號通路來發(fā)揮作用的。