陳洪鎖 年媛媛 孟憲梅 蘇日古格 任麗梅 王 晶

內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化病研究所(014030)

背景：酒精性肝病(ALD)的發(fā)病率逐年遞增，但缺乏特異性診斷指標(biāo)，探索ALD各階段的分子標(biāo)志物變化趨勢對其診斷和治療具有重要意義。目的：探討血清白細(xì)胞介素(IL)-12、糖缺失性轉(zhuǎn)鐵蛋白(CDT)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)和內(nèi)毒素在不同階段ALD中的水平及其診斷價值。方法：選取2017年7月—2018年1月包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院收治的19例酒精性肝硬化(AC)、14例酒精性肝炎(AH)、16例酒精性脂肪肝(AFL)、16例亞臨床患者，以15名體檢正常者作為健康對照。采用ELISA法檢測血清IL-12、CDT、HGF水平，鱟試驗(yàn)檢測內(nèi)毒素水平。以ROC曲線分析IL-12、CDT診斷ALD的價值。結(jié)果：AC、AH患者血清IL-12、內(nèi)毒素水平顯著高于AFL、亞臨床和健康對照組(P<0.05)，AC、AH、AFL和亞臨床組血清CDT水平均顯著高于健康對照組(P<0.05)，AC患者血清HGF水平顯著高于AH、AFL、亞臨床和健康對照組(P<0.05)。ALD患者血清IL-12、CDT、HGF與血清內(nèi)毒素呈正相關(guān)(P<0.05)。截?cái)嘀禐?5.06 pg/mL時，血清IL-12診斷ALD的敏感性和特異性分別為0.86和0.95；截?cái)嘀禐?54.41 pg/mL時，血清CDT診斷ALD的敏感性和特異性分別為0.67和0.88。結(jié)論：血清IL-12、CDT、HGF和內(nèi)毒素在ALD不同階段存在趨勢性變化，IL-12、CDT診斷ALD具有較高的敏感性和特異性，可作為ALD早期診斷的標(biāo)志物。血清HGF和內(nèi)毒素對評估ALD嚴(yán)重程度具有一定的價值。

酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)是由于長期過量攝入乙醇引起的一種慢性代謝紊亂性肝臟疾病。根據(jù)不同病理階段，ALD可分為酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver, AFL)、酒精性肝炎(alcoholic hepatitis, AH)和酒精性肝硬化(alcoholic cirrhosis, AC)。我國ALD尚缺乏全面的流行病學(xué)調(diào)查，但有研究顯示遺傳因素、性別、日飲酒量、飲酒年限、肥胖與ALD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]。提示個體異質(zhì)性在ALD發(fā)生中具有重要影響，單純依靠飲酒閾值、肝臟生化指標(biāo)以及影像學(xué)檢查結(jié)果診斷或鑒別診斷ALD具有局限性。

ALD是一種多因素參與、炎癥和免疫反應(yīng)介導(dǎo)的代謝性疾病，在其發(fā)生、發(fā)展過程中多種生物分子發(fā)生了改變[2]。但目前對ALD高危人群的篩查和早期診斷尚無可靠的檢測方法，因此探索ALD早期篩查、早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物具有重要的臨床和社會意義。有研究顯示白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-12可能參與ALD的早期免疫反應(yīng)[3]；糖缺失性轉(zhuǎn)鐵蛋白(carbohydrate-deficient transferrin, CDT)被認(rèn)為是診斷ALD較可靠的生物學(xué)標(biāo)志物，有研究提示CDT在肝移植患者復(fù)發(fā)ALD的診斷中具有重要意義[4]。過度飲酒者內(nèi)毒素血癥發(fā)生率明顯高于健康人群[5]。目前關(guān)于ALD患者中肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)表達(dá)情況及其作用的研究較少見。

本研究通過采用ELISA法和鱟試驗(yàn)分別檢測ALD不同階段患者血清IL-12、CDT、HGF和內(nèi)毒素水平，旨在分析各指標(biāo)在ALD不同階段的變化趨勢，探索其對各階段ALD的診斷價值。

對象與方法

一、研究對象

選取2017年7月—2018年1月包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化病研究所收治的ALD患者，診斷符合《酒精性肝病診療指南》的標(biāo)準(zhǔn)[6]：①患者有長期飲酒史，超過5年，折合成乙醇量，男性≥40 g/d，女性≥20 g/d，或2周內(nèi)有大量飲酒史，折合成乙醇量>80 g/d。乙醇量(g)=飲酒量(mL)×乙醇含量(%)×0.8；②臨床癥狀為非特異性，可無癥狀，或癥狀不明顯；③可有相關(guān)血清生化指標(biāo)異常；④影像學(xué)檢查(B超或CT)提示肝臟典型表現(xiàn)；⑤所有患者除外其他原因?qū)е碌母喂δ墚惓?如病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、藥物性肝炎等)，或患有其他慢性病(如肝臟、胃腸道病史、合并高血壓、糖尿病、肥胖癥等其他系統(tǒng)性疾病)。符合第1、2、3項(xiàng)和第5項(xiàng)或第1、2、4項(xiàng)和第5項(xiàng)可診斷為ALD；僅符合第1、2項(xiàng)和第5項(xiàng)可疑診ALD。ALD的臨床分型標(biāo)準(zhǔn)：①亞臨床：達(dá)到診斷ALD的飲酒閾值，而肝臟生化、影像學(xué)和組織病理學(xué)檢查基本正常；②AFL：影像學(xué)診斷符合脂肪肝標(biāo)準(zhǔn)，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)或谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-glutamyltransferase, GGT)可輕微異常；③AH：血清ALT、AST或GGT升高，可伴有血清總膽紅素(total bilirubin, TBIL)增高。重癥AH系指出現(xiàn)肝功能衰竭的表現(xiàn)，如凝血機(jī)制障礙、黃疸、肝性腦病、急性腎衰竭、上消化道出血等，常伴有內(nèi)毒素血癥；④AC：有肝硬化的臨床表現(xiàn)和血清生化指標(biāo)的改變。且影像學(xué)B超或CT提示肝硬化，并除外其他原因所致的肝硬化。同時納入同期性別和年齡相匹配的行常規(guī)體檢的志愿者作為健康對照組。本研究方案由包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

二、研究方法

1. 肝功能、血脂的檢測：登記患者的性別、年齡、體重指數(shù)(body mass index, BMI)。留取晨起空腹靜脈血，4 ℃ 3 000 r/min離心15 min，嚴(yán)格無菌操作檢測肝功能、血脂指標(biāo)，包括TBIL、直接膽紅素(direct bilirubin, DBIL)、間接膽紅素(indirect bilirubin, IBIL)、總蛋白(total protein, TP)、白蛋白(albumin, ALB)、球蛋白(globulin, GLO)、ALT、AST、GGT、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、三酰甘油(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)。

2. 血清IL-12、CDT、HGF水平的檢測：采用ELISA法(試劑購自武漢華美生物工程有限公司)。采用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，依次向包被抗IL-12/p70、CDT、HGF抗體的微孔中加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗IL-12/p70、CDT、HGF抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，經(jīng)徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色深淺與樣本中IL-12/p70、CDT、HGF呈正相關(guān)。利用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度值，計(jì)算樣本濃度。

3. 內(nèi)毒素水平的檢測：采用鱟試驗(yàn)(試劑購自廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司)。取無熱原試管，加入100 μL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液或供試品。再加入100 μL鱟試劑溶液，混勻，37 ℃溫育1 min。加入100 μL顯色基質(zhì)溶液，混勻，37 ℃溫育2 min。加入500 μL偶氮化試劑1溶液，混勻，加入500 μL偶氮化試劑2溶液，混勻加入500 μL偶氮化試劑3溶液，混勻，靜置5 min，于545 nm波長處讀取吸光度值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般資料

在規(guī)定的研究期間，共納入AC患者19例、AH患者14例、AFL患者16例、亞臨床患者16例和健康對照組15例。各組性別構(gòu)成、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AC組、健康對照組BMI顯著低于AH組、AFL組(P<0.05)(表1)。

二、肝功能、血脂水平比較

與AH組、AFL組、亞臨床組和健康對照組相比，AC組TBIL、DBIL、IBIL、AST、GGT水平顯著升高(P<0.05)，TP、ALB、HDL-C顯著降低(P<0.05)。AC組GLO顯著高于健康對照組、亞臨床組、AFL組和AH組(P<0.05)。AC組、AH組LDL-C顯著低于健康對照組、亞臨床組和AFL組(P<0.05)。AFL組TG顯著高于健康對照組和亞臨床組(P<0.05)。各組ALT、TC相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

三、血清IL-12、CDT、HGF和內(nèi)毒素水平

健康對照組、亞臨床組、AFL、AH、AC患者血清IL-12、CDT、HGF和內(nèi)毒素呈逐漸升高的趨勢。 AC、AH患者血清IL-12、內(nèi)毒素水平均顯著高于AFL、亞臨床和健康對照組(P<0.05)，AC、AH、AFL和亞臨床組血清CDT水平均顯著高于健康對照組(P<0.05)，AC患者血清HGF水平顯著高于AH、AFL、亞臨床和健康對照組(P<0.05)(表3)。

四、相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示，ALD患者血清IL-12、CDT、HGF與血清內(nèi)毒素呈正相關(guān)(r分別為 0.61、0.57、0.51，P<0.05)。

五、血清IL-12、CDT的診斷價值

ROC曲線分析顯示，截?cái)嘀禐?5.06 pg/mL時，IL-12鑒別ALD和健康對照組的敏感性和特異性分別為0.86和0.95，AUC為0.94；截?cái)嘀禐?2.05 pg/mL時，IL-12鑒別亞臨床和AFL的敏感性和特異性分別為1.00和0.86，AUC為0.92(圖1)；截?cái)嘀禐?1.84 pg/mL時，IL-12鑒別AFL和AH的敏感性和特異性分別為0.86和1.00，AUC為0.87；截?cái)嘀禐?26.42 pg/mL時，IL-12鑒別AH和AC的敏感性和特異性分別為0.82和0.67，AUC為0.65(表4)。

表1 AC、AH、AFL、亞臨床和健康對照組的一般資料

截?cái)嘀禐?54.41 pg/mL時，血清CDT診斷ALD的AUC為0.81(95% CI: 0.69～0.94)，敏感性為0.67，特異性為0.88。

討 論

目前臨床主要依靠飲酒閾值、肝臟生化指標(biāo)和影像學(xué)結(jié)果診斷或鑒別診斷ALD，但具有一定的局限性。有必要探尋ALD早期篩查、早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。

持續(xù)飲酒可改變腸道滲透性，從而導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥的發(fā)生[7]。內(nèi)毒素通過刺激Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生IL-12，引起γ-干擾素的產(chǎn)生和Th1型免疫應(yīng)答[8]。而血清IL-12誘導(dǎo)的γ-干擾素可在T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞中導(dǎo)致巨噬細(xì)胞活化和進(jìn)一步的炎癥反應(yīng)[9-10]。Laso等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，無肝病的嗜酒者IL-12水平顯著高于對照組；患有AC的嗜酒者血清IL-12水平隨乙醇攝入量的不同而不同，持續(xù)攝入乙醇者IL-12水平明顯升高，而戒酒一年以上者的IL-12水平可下降或恢復(fù)至正常。說明IL-12在誘導(dǎo)慢性酒精中毒患者體內(nèi)免疫紊亂中起有重要作用。Tung等[12]的研究結(jié)果顯示，AFL、AH、AC組血清IL-12水平均顯著高于正常對照組，且AH患者血清IL-12水平顯著高于AFL、AC組；患者戒酒9個月后，AFL血清IL-12水平與正常對照組無明顯差異，而AC組和AH組仍顯著高于正常對照組；持續(xù)飲酒的AFL、AH、AC患者血清IL-12水平顯著高于相應(yīng)的戒酒者。說明血清IL-12可有效反映患者的持續(xù)飲酒狀態(tài)，有助于臨床醫(yī)師了解患者的飲酒狀態(tài)以及更好地評估預(yù)后，有望作為ALD的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，血清IL-12在AC、AH、AFL、亞臨床和健康對照組中存在趨勢性變化，其中AC組、AH組IL-12水平顯著高于AFL組、亞臨床組和健康對照組(P<0.05)。

表2 AC、AH、AFL、亞臨床和健康對照組肝功能和血脂水平

表3 各組血清IL-12、CDT、HGF和內(nèi)毒素水平

*與健康對照組比較，P<0.05；#與亞臨床組比較，P<0.05；&與AFL組比較，P<0.05；▲與AH組比較，P<0.05

表4 血清IL-12的診斷價值分析

圖1 IL-12診斷亞臨床組和AFL的ROC曲線圖

臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)相當(dāng)一部分人群飲酒量達(dá)到ALD的診斷閾值，但缺乏臨床表現(xiàn)或生化指標(biāo)異常，即處于亞臨床狀態(tài)。對于此類患者，乙醇攝入是否具有病理意義，目前尚無相關(guān)報道。本研究中，亞臨床組血清IL-12水平高于健康對照者。提示無論是否有臨床表現(xiàn)或常規(guī)生化指標(biāo)的異常，攝入乙醇會促進(jìn)人體炎癥反應(yīng)。

此外，當(dāng)血清IL-12鑒別亞臨床組與AFL組、AFL組與AH組、AH組與AC組以及ALD與健康對照組的截?cái)嘀捣謩e為42.05 pg/mL、91.84 pg/mL、126.42 pg/mL、55.06 pg/mL時，其敏感性和特異性均較高。Tung等[12]的研究結(jié)果亦顯示，截?cái)嘀禐?4 pg/mL時，IL-12診斷ALD具有良好的敏感性和特異性。由此可見，血清IL-12可用于ALD易感患者的篩查、ALD的早期診斷，有助于對ALD患者進(jìn)行干預(yù)治療。

歐洲國家將CDT廣泛用于診斷ALD，但長期酗酒者血清CDT升高的機(jī)制目前并不十分清楚，可能與乙醇及其代謝產(chǎn)物對肝臟中糖蛋白的合成、分泌和清除等階段的影響有關(guān)[13]。有研究[14]表明CDT或%CDT排除診斷ALD具有較高的準(zhǔn)確性。本研究結(jié)果顯示，AC、AH、AFL組和亞臨床組CDT水平均顯著高于健康對照組(P<0.05)。當(dāng)截?cái)嘀禐?54.41 pg/mL時，CDT診斷ALD的AUC為0.81。但目前CDT的檢測方法和診斷閾值尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，仍需行進(jìn)一步大樣本研究明確其對ALD的診斷價值。

HGF最初被認(rèn)為是肝細(xì)胞的有效生長因子，通過誘導(dǎo)谷胱甘肽參與肝臟抗氧化反應(yīng)從而減少肝臟脂肪堆積[15]。最新研究發(fā)現(xiàn)，HGF不僅能通過炎癥介質(zhì)降低急性胰腺炎的氧化應(yīng)激、水腫和炎癥反應(yīng)[16]，還可能通過刺激機(jī)體產(chǎn)生間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子從而抑制胃癌細(xì)胞的表達(dá)[17]。胡杰等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，隨著肝纖維化的進(jìn)展，HGF在肝細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中的數(shù)量和分布逐漸增多，提示HGF可能與肝纖維化進(jìn)展相關(guān)。Prystupa等[15]對不同Child-Turcotte-Pugh分級AC患者的研究發(fā)現(xiàn)，HGF隨著肝硬化進(jìn)展而顯著升高，且血清HGF與患者預(yù)后和生存期具有負(fù)相關(guān)性。本研究中，隨著ALD病情進(jìn)展，HGF水平逐漸升高，AC組HGF水平顯著高于AH組、AFL組、亞臨床組和健康對照組(P<0.05)。說明HGF可能可作為評估ALD患者病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)，

機(jī)體攝入的乙醇絕大部分在肝臟代謝，慢性嗜酒者腸道屏障功能減弱，內(nèi)毒素平衡機(jī)制被破壞，產(chǎn)生內(nèi)毒素血癥，進(jìn)而釋放一系列炎性因子[19]。本研究顯示，AC、AH患者內(nèi)毒素水平顯著高于AFL、亞臨床和健康對照組(P<0.05)；且ALD患者血清IL-12、HGF和CDT與血清內(nèi)毒素水平呈正相關(guān)。說明內(nèi)毒素對評估ALD病情嚴(yán)重程度可能有一定的價值。

本實(shí)驗(yàn)存在一些不足之處，如樣本量較小、存在性別偏倚、混雜因素等，可能對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響，后續(xù)仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步完善研究結(jié)果，并評估血清IL-12、CDT在普通人群中篩查和早期診斷ALD的臨床效能。

綜上所述，血清IL-12、CDT、HGF和內(nèi)毒素在ALD不同階段存在趨勢性變化，血清IL-12、CDT具有較高的敏感性和特異性，可作為ALD早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物，血清HGF和內(nèi)毒素對評估ALD嚴(yán)重程度具有一定的價值。但研究結(jié)論仍需行進(jìn)一步研究證實(shí)。