李甘，李勇，王創(chuàng)建，杜芳芳，雙少敏*

(1.山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 環(huán)境科學(xué)研究所，山西 太原 030006)

0 引言

黑豆(Glycinemax)又稱烏豆，是我國(guó)傳統(tǒng)種植的農(nóng)作物。黑豆不但營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，而且具有藥用價(jià)值[1]。《本草綱目》中記載：“常食黑豆，可百病不生”，具有滋補(bǔ)肝腎，軟化血管等功效[2-3]。

黑豆種皮中因含有豐富的花色苷類物質(zhì)而呈現(xiàn)黑色?；ㄉ帐琴x予植物顏色的天然水溶性色素，屬于類黃酮化合物。研究報(bào)道已從黑豆皮中分離得到了多種花色苷，其中矢車菊素 3-O-葡萄糖苷是黑豆皮中最主要的活性成分之一[4-6]。花色苷作為黑豆皮色素的主要成分，除了具有很強(qiáng)的抗氧化能力[7]，能有效清除體內(nèi)自由基，還有降血糖[8]、抗癌[9]、抑制脂肪[10-11]等活性，其中降血糖作用引起了學(xué)者們的高度關(guān)注。研究糖尿病的過程中發(fā)現(xiàn)，α-葡萄糖苷酶抑制劑在2型糖尿病的治療過程中發(fā)揮著重要作用，是近年來糖尿病藥物開發(fā)研究的一個(gè)熱點(diǎn)[12]。

近年來，醋泡黑豆作為一種功能性保健食品引起廣泛關(guān)注，因其集合了黑豆和陳醋的營(yíng)養(yǎng)和保健作用。有關(guān)醋泡黑豆的制備條件和功能特性變化方面的研究已有報(bào)道[13-15]。熊太銀等[13]采用正交試驗(yàn)和改良試驗(yàn)探索醋泡黑豆的最佳工藝參數(shù)，研制出適合大眾口味的黑豆休閑食品。張?jiān)聢A等[16]研究醋浸可改變黑豆各蛋白組分的含量和對(duì)應(yīng)多肽的ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)抑制活性。江帆等[15]表明醋泡黑豆制備條件對(duì)醋泡黑豆的抗氧化特性有顯著影響。但有關(guān)醋泡黑豆皮的研究尚少見報(bào)道。本文研究了醋泡方法對(duì)黑豆皮中矢車菊素3-O-葡萄糖苷的提取量及黑豆皮提取物的抗氧化能力和對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力的影響，為黑豆皮花色苷的開發(fā)利用提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆皮、白醋選購(gòu)于太原市藍(lán)海農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

花色苷標(biāo)準(zhǔn)品：矢車菊素3-O-葡萄糖苷(Cy3-O-glu)購(gòu)于挪威多酚公司；乙醇、甲醇、鹽酸、石油醚、乙酸乙酯，均為分析純。高效液相色譜(HPLC)所用甲醇(色譜級(jí))，2, 2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)，1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)，阿卡波糖水合物購(gòu)于阿拉丁公司。α-D-葡萄糖苷酶[EC 3.2.1.20]，4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷(4-MUG)購(gòu)自西格瑪奧德里奇公司。

1.2 儀器

安捷倫HPLC-1200高效液相色譜儀(配有四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器和色譜工作站)，熒光光度計(jì)(英國(guó)，愛丁堡公司)，紫外-可見分光光度計(jì)(珀金埃爾默儀器上海有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph/G3)，超聲波清洗器(天鵬電子新技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 矢車菊素3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品花色苷Cy 3-O-glu 2.00 mg，將其溶于2.00 mL 含體積分?jǐn)?shù)為1%鹽酸的甲醇溶液中，配成1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。從標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中吸取一定量，用體積分?jǐn)?shù)為1%鹽酸的去離子水溶液稀釋成：5、50、100、250、500 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)液，用0.45 μm濾膜過濾，取20 μL上樣。

1.3.2 花色苷的提取

1.3.2.1 黑豆皮花色苷的提取

稱取黑豆皮樣品20 g，加入200 mL含體積分?jǐn)?shù)為1%鹽酸的乙醇溶液，室溫下超聲處理3次，每次15 min；布氏漏斗過濾，得濾液。濾渣再用200 mL體積分?jǐn)?shù)為1%鹽酸的乙醇溶液重復(fù)提取2次，將3次濾液合并，40℃下真空濃縮去除乙醇，然后用體積分?jǐn)?shù)為1%鹽酸的去離子水定容至5 mL，于冰箱中冷藏備用。

1.3.2.2 醋泡黑豆皮花色苷的提取

稱取黑豆皮樣品20 g，使用白醋浸泡2 d[13]。重復(fù)以上提取步驟，最終用體積分?jǐn)?shù)為1%鹽酸的去離子水定容至5 mL，于冰箱中冷藏備用。

1.3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

用體積分?jǐn)?shù)為1%鹽酸水溶液配制少量黑豆皮提取液，用紫外可見分光光度計(jì)200 nm～800 nm的范圍內(nèi)對(duì)其進(jìn)行掃描，得黑豆皮提取液的吸收光譜圖。同時(shí)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品花色苷溶液，用紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描，得到花色苷Cy 3-O-glu吸收光譜圖，確定其最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.4 色譜條件

色譜條件：色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)。流動(dòng)相A為水(含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸)，流動(dòng)相B為甲醇。流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)520 nm。梯度條件：0～50 min，5%～100%B；50～60 min，100%B 沖柱。

1.3.5 加標(biāo)回收率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取已知花色苷Cy 3-O-glu含量的黑豆皮原料20 g，準(zhǔn)確稱取3份，分別加入與供試樣品中花青素含量相同的花色苷Cy 3-O-glu對(duì)照品，按1.3.2中花色苷的制備方法制備，按 1.3.4中確定的方法準(zhǔn)確測(cè)定，計(jì)算平均回收率。

1.4 生物活性的測(cè)定

1.4.1 抗氧化活性-ABTS法

ABTS在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS+，在抗氧化物存在時(shí)ABTS+的產(chǎn)生會(huì)被抑制，因其在734 nm或405 nm有最大吸收，所以一般選擇734 nm或405 nm測(cè)定ABTS的吸光度即可測(cè)定并計(jì)算出樣品的總抗氧化能力。

參照Bellumori等[17]的方法使用ABTS+模型測(cè)定黑豆皮花色苷的抗氧化活性。取100 μL的樣品溶液加入2 mL ABTS溶液避光反應(yīng)2 min，空白實(shí)驗(yàn)取100 μL水加入2 mL ABTS溶液避光反應(yīng)2 min，然后測(cè)定在734 nm處吸光度值。以維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)不同濃度的樣品的清除率可計(jì)算出半抑制濃度IC50。

依據(jù)公式(1)，可以計(jì)算出ABTS+的清除率：

(1)

A0為空白溶液的吸光度值，At為樣品與ABTS 反應(yīng)后的吸光度值。

ABTS溶液的配置：稱取54.8 g ABTS溶于20 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)，加入1 g的MnO2，活化20 min。取2 mL活化好的溶液離心，用磷酸緩沖溶液稀釋上清液，使其A734(t0)=0.800±0.02 nm。

1.4.2 抗氧化活性-DPPH法

1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，當(dāng)有自由基清除劑的存在時(shí)，由于與其單電子配對(duì)而使其在517 nm處的吸收消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可使用分光光度計(jì)進(jìn)行快速定量分析。

參考Zill-E-Huma[18]的方法使用DPPH+模型測(cè)定黑豆皮花色苷的抗氧化活性。稱取40 mg的DPPH溶于100 mL的甲醇中，50 μL的樣品溶液與2 mL的DPPH溶液避光反應(yīng)30 min，空白實(shí)驗(yàn)取50 μL水與2 mL DPPH溶液避光反應(yīng)30 min。在517 nm處測(cè)量吸光度值，以維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)不同濃度的樣品的清除率可計(jì)算出IC50。

依據(jù)公式(2)，可以計(jì)算出DPPH+的清除率：

(2)

A0為空白溶液的吸光度值，At為樣品與DPPH 反應(yīng)后的吸光度值。

1.4.3α-葡萄糖苷酶的抑制作用

以4-MUG為反應(yīng)底物，4-MUG被α-葡萄糖苷酶水解后產(chǎn)生的4-甲基傘形酮(4-MU)具有熒光，可被檢測(cè)。而α-葡萄糖苷酶抑制劑的存在會(huì)抑制4-MUG的水解，減少4-MU的產(chǎn)生。通過測(cè)定樣品加入前后熒光變化可以判斷出黑豆皮提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響[12,19]。

按照廖暉等[12,20]的方法測(cè)定樣品的α-葡萄糖苷酶的抑制作用。將黑豆皮花色苷提取物20 μL與40 μL制備的1 μg/mL酶溶液和50 μL 10 mmoL/L 4-MUG溶液在Tris緩沖液(pH 6.9)。將混合物搖勻，在37℃溫育20 min。在λex380 nm，λem400 nm處測(cè)定熒光值。α-葡萄糖苷酶對(duì)照組含有緩沖液20 μL，底物溶液50 μL和酶溶液40 μL；空白組含有黑豆皮花色苷提取物20 μL，緩沖液20 μL和酶溶液40 μL，而空白對(duì)照組含有緩沖液和酶溶液。阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)不同濃度的樣品的抑制率可計(jì)算出IC50。

依據(jù)公式(3)，可以計(jì)算出α-葡萄糖苷酶的抑制率：

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

圖1a是標(biāo)準(zhǔn)品Cy 3-O-glu在體積分?jǐn)?shù)為1%鹽酸水溶液中的吸收光譜圖，從譜圖中可以發(fā)現(xiàn)其在 520、360、280 nm處有吸收峰。圖1b是黑豆皮提取物在體積分?jǐn)?shù)為1%鹽酸水溶液中的吸收光譜圖，從譜圖中可以看出黑豆皮提取物分別在520、360、280 nm處有吸收峰，而 520 nm為花青素類色素的特征吸收峰。因此，選擇520 nm作為黑豆皮提取物中花色苷HPLC的檢測(cè)波長(zhǎng)。

Fig.1 UV-visible absorption spectrogram of Cy 3-O-glu (a), black soya bean hulls extraction (b)圖1 標(biāo)準(zhǔn)品花色苷Cy 3-O-glu(a)，黑豆皮提取液(b)的紫外-可見吸收光譜圖

2.2 黑豆皮花色苷的鑒定

圖2為醋泡前后黑豆皮花色苷提取物以及標(biāo)準(zhǔn)品Cy 3-O-glu的HPLC譜圖。經(jīng)HPLC譜圖分析，并與標(biāo)準(zhǔn)品(圖2a)進(jìn)行對(duì)比，確定峰1為Cy 3-O-glu。

Fig.2 HPLC chromatograms of Cy 3-O-glu (a), untreated soybean skin (b) and vinegar soak black soybean hulls (c)圖2 標(biāo)準(zhǔn)品花色苷Cy 3-O-glu(a)，未處理黑豆皮(b)及醋泡黑豆皮(c)的HPLC色譜圖

2.3 方法性能指標(biāo)

2.3.1 線性關(guān)系與檢測(cè)限

由1.3.1配置的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液在1.3.4的色譜條件下，經(jīng)HPLC測(cè)得Cy 3-O-glu的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的色譜峰的峰面積。以Cy 3-O-glu的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明Cy 3-O-glu在5 μg/mL～500 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=29.668x+125.96，R2=0.999 1，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。

經(jīng)HPLC測(cè)定，當(dāng)花色苷Cy 3-O-glu峰高為儀器響應(yīng)噪聲的3倍量時(shí)，檢測(cè)限為50 ng/mL( S/N=3)。

2.3.2 精密度的測(cè)定

取濃度為100 μg/mL標(biāo)品待測(cè)液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣20 μL。通過HPLC測(cè)得的花色苷Cy 3-O-glu的峰面積，計(jì)算RSD為0.6%。結(jié)果說明儀器具有良好的精密度。

2.3.3 穩(wěn)定性的測(cè)定

取黑豆皮提取液分別于放置0、2、4、8、12 h后各進(jìn)樣一次，通過HPLC測(cè)得的花色苷Cy 3-O-glu的峰面積，計(jì)算RSD為0.6%。結(jié)果表明在12 h內(nèi)樣品具有很好的穩(wěn)定性。

Fig.3 Standard curve of Cy 3-O-glu圖3 花色苷Cy 3-O-glu標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.4 重復(fù)性的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取同一批黑豆皮5份，每份均為20 g。重復(fù)樣品的提取操作，即1.3.2.1的操作。通過HPLC測(cè)得的花色苷Cy 3-O-glu的峰面積，計(jì)算RSD為2.8%。結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)具有良好的重現(xiàn)性。

2.3.5 加標(biāo)回收的測(cè)定

按1.3.2中花色苷的制備方法制備并測(cè)定。平均回收率為96.47%，計(jì)算RSD為1.25%，結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)回收率良好。

2.4 醋泡黑豆皮前后花色苷的含量測(cè)定

黑豆皮花青素提取液按1.3.2 中樣品處理方法制備，通過HPLC測(cè)定醋泡前后2個(gè)供試樣品，可以得到花色苷Cy 3-O-glu的峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品中花色苷Cy 3-O-glu的含量，結(jié)果見表2。此外，通過色譜譜圖分析，醋泡黑豆皮(圖2c)峰1的峰面積比未處理的黑豆皮(圖2b)的峰1峰面積高出很多。結(jié)果表明，醋泡方法可以提高黑豆皮花色苷提取物中Cy 3-O-glu的含量。

表1 樣品回收率的測(cè)定(n=3)

表2 不同工藝的黑豆皮花色苷Cy 3-O-glu含量的測(cè)定(n=3)

2.5 生物活性的測(cè)定及比較

2.5.1 醋泡前后黑豆皮提取液抗氧化活性的測(cè)定及比較

通過測(cè)定某物質(zhì)清除自由基的能力，即可表征其抗氧化活性強(qiáng)弱[21-22]。由于同一種具有抗氧化活性的物質(zhì)在不同的抗氧化測(cè)定體系中表現(xiàn)出的抗氧化活性不同，因此全面地評(píng)價(jià)一種物質(zhì)的抗氧化能力不能只采用一種評(píng)價(jià)方法。因此，采用了ABTS，DPPH兩種方法進(jìn)行抗氧化活性的分析。

圖4、圖5分別顯示了醋泡處理前后黑豆皮花色苷提取物及對(duì)照品維生素C對(duì)ABTS+和DPPH+的清除效果。黑豆皮花青素提取物和維生素C對(duì)ABTS+，DPPH+均有清除作用，且清除率與質(zhì)量濃度均呈線性相關(guān)，即隨著質(zhì)量濃度的增加，自由基的清除能力增強(qiáng)。樣品以及對(duì)照品對(duì)兩種自由基清除能力的半抑制量IC50通過回歸方程得到，列于表3中。

Fig.4 ABTS radical scavenging activities of anthocyanins fromblack soybean hulls with different technologies (a) and vitamin C (b)圖4 不同工藝黑豆皮花青素以及維生素C的ABTS自由基清除能力

Fig.5 DPPH radical scavenging activities of anthocyanins fromblack soybean hulls with different technologies (a) and vitamin C (b)圖5 不同工藝黑豆皮花青素以及維生素C的DPPH自由基清除能力

Fig.6 Inhibition of a-glucosidase of anthocyanins fromblack soybean hulls with different processes (a) and acarbose (b)圖6 不同工藝黑豆皮花青素以及阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力

表3 不同工藝的黑豆皮花色苷生物活性的IC50值

兩種自由基的清除作用均有以下的趨勢(shì)，IC50值從小到大為：醋泡黑豆皮<未經(jīng)處理黑豆皮<維生素C。醋泡黑豆皮花青素提取物對(duì)ABTS+，DPPH+清除能力的IC50分別為陽(yáng)性對(duì)照的5.92和1.83倍。結(jié)果顯示DPPH法的清除能力低于ABTS法，這是由于DPPH比ABTS有更強(qiáng)的選擇性，它不與B環(huán)上無羥基的黃酮類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。綜上分析，兩種自由基清除的結(jié)果說明黑豆皮花色苷的抗氧化能力遠(yuǎn)高于維生素C，且醋泡黑豆皮極大提高了其抗氧化能力。

2.5.2α-葡萄糖苷酶抑制能力的測(cè)定及比較

黑豆皮花色苷提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響結(jié)果如圖6所示。醋泡處理前后黑豆皮花色苷提取物及對(duì)照品阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶均有抑制的效果，且抑制率與質(zhì)量濃度均呈線性相關(guān)，即隨著質(zhì)量濃度的增加，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力增強(qiáng)。樣品以及對(duì)照品對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力的IC50通過回歸方程得到，列于表3中。IC50值從小到大依次為：阿卡波糖<醋泡黑豆皮<未經(jīng)處理黑豆皮。醋泡前后黑豆皮花色苷提取物的IC50值低于阿卡波糖，可能因?yàn)楹诙蛊せㄇ嗨靥崛∥镂唇?jīng)純化，存在其他物質(zhì)影響了其抑制能力。結(jié)果說明黑豆皮花色苷有作為α-葡萄糖苷酶的抑制劑的潛力，而較于未處理的黑豆皮，醋泡黑豆皮可顯著提高對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力。

3 結(jié)論

本文研究了醋泡對(duì)黑豆皮中花色苷Cy 3-O-glu提取量的影響及對(duì)花色苷提取物生物活性的影響。結(jié)果表明，Cy 3-O-glu為黑豆皮提取物中的主要活性成分之一，醋泡黑豆皮可提高提取物中Cy 3-O-glu的含量。生物活性測(cè)定的結(jié)果表明，與未醋泡的黑豆皮相比，醋泡黑豆皮提取物對(duì)自由基清除能力和α-葡萄糖苷酶抑制能力較強(qiáng)。綜上所述，醋泡黑豆皮可極大提高抗氧化能力和對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制能力，可作為一種潛在的天然抗氧化和降血糖資源，具有開發(fā)為預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥的保健品的潛力。