婁永峰 歐陽承智 肖平江 袁婷婷

(1 江西省林業(yè)科學院 江西省植物生物技術重點實驗室 南昌 330013; 2 安福縣武功山林場 江西安福 343200; 3 國際竹藤中心竹藤資源基因科學研究所，國家林業(yè)和草原局/北京市竹藤科學與技術重點開放實驗室 北京100102)

1 材料與方法

1.1 植物材料

以室內(nèi)培養(yǎng)的盆栽毛竹實生苗為材料，培養(yǎng)條件：溫度為18～25 ℃，光周期為16 h光照/8 h黑暗，光強為250～350 μmol/(m2·s)。新生毛竹實生苗長至2個月大小時，取其根、莖、葉等組織，用液氮速凍后，置于-80 ℃保存，用于后續(xù)總RNA的提取。

1.2 RNA提取及cDNA合成

利用Invitrogen公司的Trizol reagent提取毛竹新鮮材料的總RNA[8]，并根據(jù)大連TaKaRa公司的反轉錄試劑盒方法合成cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PeAMT2;1基因克隆

用水稻OsAMT1;1(AAL05612)和OsAMT2;1(AB051864)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索，獲得毛竹相關序列cDNA(FP095543)，并根據(jù)該序列設計引物AMT-001：5′-ATGGCGGCGGCCGGCGCGTACG-3′和AMT-501：5′-CTACAACTGGATGGTGACGCCCCTG-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以毛竹cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系為20 μL：10 × LA Buffer 2.0 μL，dNTPs Mixture(2.5 mM each)2.0 μL，上下游引物(10 μM)各1.0 μL，cDNA 3.0 μL，LA Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，加水至總體積20 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 1 min，68 ℃ 2 min，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物電泳檢測后經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收，將回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，并轉化大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α菌株，篩選陽性克隆并鑒定，由生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序。

1.3 生物信息學分析

將測序得到的序列在NCBI進行Blastp分析，并用Clustal W進行多重序列比對，用MEGA 6.0軟件將其氨基酸序列與水稻等其他植物的AMT各亞類中的代表性成員進行聚類分析，構建系統(tǒng)進化樹。

1.4 PeAMT2;1的表達檢測

以毛竹根、莖、葉的cDNA為模板。根據(jù)克隆獲得PeAMT2;1基因序列設計定量引物，AMT-RT-001：5′-TGCCTCGACGTCATCTTCTT-3′和AMT-RT-501：5′-CGTCGACCTTCATGATCAGC-3′。采用半定量RT-PCR分析PeAMT2;1基因的組織表達特異性。反應體系如下：10 × PCR Buffer(Mg2+plus)2.0 mL，dNTP Mixture(2.5 mM each)2.0 μL，AMT-RT-001(10 μM)1.0 μL，AMT-RT-501(10 μM)1.0 μL，cDNA 2.0 μL，rTaq(5 U/μL)0.2 μL，H2O 11.8 μL。反應過程：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性 30 s，61 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，25個循環(huán)；72 ℃延伸，10 min。同時以PeActin基因為內(nèi)參對[9]。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，用ALPHAIMAGE 2000采集圖像進行分析。

2 結果和分析

2.1 PeAMT2;1基因克隆及序列分析

通過同源序列比對檢索，在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得了一條與水稻OsAMT2;1同源的毛竹基因序列(FP095543)，該序列全長1 776 bp，其中5′非編碼區(qū)(UTR)長66 bp，3′ UTR長252 bp，編碼區(qū)(ORF)長1 458 bp。在NCBI中進行進一步序列比對分析，發(fā)現(xiàn)該序列與水稻、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyum)、大麥(Hordeumvulgare)等單子葉植物的AMT2亞類序列具有較高同源性。以毛竹cDNA為模板，用引物AMT-001和AMT-501進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果獲得一條約1 400 bp的特異目的片段(圖1)。測序結果分析表明，該片段大小為1 458 bp，與FP095543的ORF序列的一致性為99.04%，僅有14個堿基位點存在差異，這表明獲得的目的片段為一個具有完整ORF的新毛竹基因的序列，因此命名為PeAMT2;1。

M：DNA分子量標準；1—3：PCR擴增產(chǎn)物。圖1 毛竹PeAMT2;1基因PCR擴增

序列分析表明，PeAMT2;1編碼一個含485個氨基酸的蛋白質(zhì)，預測蛋白分子量為51.62 kD，理論等電點為8.23。利用NCBI中的保守結構域數(shù)據(jù)庫對該蛋白的保守結構域進行預測，發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于典型的銨轉運蛋白。通過TM predict軟件對蛋白序列的跨膜區(qū)進行分析，發(fā)現(xiàn)PeAMT2;1蛋白具有11個跨膜區(qū)域，同時它們的N端和C端分別位于膜外側和內(nèi)側(圖2)。

At：擬南芥(Arabidopsis thaliana)；Bd：二穗短柄草(Brachypodium distachyum)；Pe：毛竹(Phyllostachys edulis)；Os：水稻(Oryza sativa)；TM1—TM11表示11個跨膜區(qū)域。圖2 PeAMT2;1氨基酸序列與其他其同源序列的比對

2.2 PeAMT2;1系統(tǒng)進化分析

從NCBI網(wǎng)站下載水稻、小麥、擬南芥等不同物種AMT基因編碼的氨基酸序列，利用Clustal X進行同源性比對分析，并用N-J法構建系統(tǒng)進化樹(圖3)。結果表明，所有物種的AMT家族成員被分為AMT1和AMT2兩個亞家族，其中PeAMT2;1屬于AMT2亞家族，且PeAMT2;1與水稻OsAMT2;1的親緣關系最近，并且二穗短柄草BdAMT2;1、玉米ZmAMT2;1和谷子SiAMT2;1等單子葉植物的ATM2成員聚類在同一進化分支上，而與ATM1亞家族的成員距離較遠。

At：擬南芥(Arabidopsis thaliana)；Bn：歐洲油菜；Bd：二穗短柄草(Brachypodium distachyum)；Lj：百脈根(Lotus japonicus)；Pe：毛竹(Phyllostachys edulis)；Pm：稷(Panicum miliaceum)；Os：水稻(Oryza sativa)；Ph：哈氏黍(Panicum hallii)；Si：谷子(Setaria italica)；Sl：番茄(Solanum lycopersicum)；Ta：小麥(Triticum aestivum)；Zm：玉米(Zea mays)。圖3 基于AMT基因編碼氨基酸序列構建的系統(tǒng)進化樹

2.3 PeAMT2;1表達分析

提取毛竹根、莖、葉等組織的總RNA，并將其反轉錄為cDNA作為模板，通過半定量RT-PCR檢測PeAMT2;1基因在毛竹不同組織的表達特性。結果表明(圖4)，PeAMT2;1在毛竹根、莖、成熟葉和未完全展開的新葉中均有表達，其中在根和莖中的表達相對高于葉中，而在未完全展開的新葉中相對表達量也高于成熟葉。

1：根；2：莖；3：成熟葉；4：未完全展開的新葉。圖4 PeAMT2;1在毛竹根、莖、葉中的RT-PCR分析

3 討論

植物中AMT家族依據(jù)其同源性特征，被劃分為AMT1和AMT2兩個亞家族，其中AMT1亞家族為植物所特有，該亞家族成員與擬南芥AtAMT1具有較高的同源性，而AMT2亞家族與原核生物的銨轉運蛋白具有較高的同源性，而與植物種屬AMT1亞家族的同源性較低[1, 10-11]。雖然AMT基因在多種植物中已被克隆和鑒定，但在竹類屬植物中尚未見報道。本研究先通過比對在NCBI中數(shù)據(jù)庫檢索得到了毛竹AMT同源基因序列，并根據(jù)該序列克隆了一個新的基因PeAMT2;1。氨基酸序列比對和系統(tǒng)進化樹分析表明，PeAMT2;1編碼的蛋白屬于植物銨轉運蛋白的AMT2亞家族，且與毛竹FP095543編碼蛋白的一致性為97.73%，是一個新的毛竹銨態(tài)氮轉運蛋白。

已有研究表明，水稻OsAMT2;1的表達在根系、葉片、葉鞘以及生殖器官的內(nèi)外稃中表達較強，而在莖稈中的表達較弱，且其根系與地上部的表達均受外界氮源(銨)的誘導[12]。PeAMT2;1與OsAMT2;1的一致性為87.42%，聚類分析中與OsAMT2;1聚類到最近的分支，表明它們可能具有相似的功能。半定量RT-PCR分析表明，PeAMT2;1在根、莖、葉等組織中均表達，且在根和莖中表達相對高于葉中，這與OsAMT2;1在各組織的表達特點基本一致，進一步支持了它們可能具有相似的功能。但是，同屬于AMT2亞家族的TaAMT2;3a在小麥葉中的表達顯著高于根、莖[13]，其原因有待進一步探究。此外，研究表明AtAMT2;1和OsAMT2;1等部分AMT2亞家族成員基因的表達受到外界氮源的影響[12,14]，而毛竹PeAMT2;1對外界氮源變化的應答模式則仍需進一步研究。