董振杰，麥艷娜，夏 晴，馬 超，田修斌，李歡歡，劉文軒，宋玉立

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 河南 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所， 河南 鄭州 450002)

小麥全蝕病，又稱黑腳病或立枯病，是一種主要由禾頂囊殼小麥變種(Gaeumannomycesgraminisvar.tritici,Ggt)和禾谷變種(Gaeumannomycesgraminisvar.Graminis,Ggg)侵染引起的小麥毀滅性根部病害[1-2]。在我國，引起小麥全蝕病的主要是禾頂囊殼小麥變種Ggt。小麥全蝕病是一種典型的土傳病害，主要侵染小麥根部和莖基部的1～2節(jié)，在苗期和成株期均可發(fā)病。苗期發(fā)病后小麥植株矮小，分蘗少，下部葉片變黃，根和莖變褐、腐爛，抽穗后病株發(fā)黃，植株成簇或大片變白枯死，形成白穗，降低有效穗數(shù)、穗粒數(shù)及千粒質(zhì)量，導(dǎo)致小麥減產(chǎn)20%以上，甚至絕收[3-4]。我國小麥全蝕病最早在云南省、浙江省被發(fā)現(xiàn)，隨后在全國多個(gè)小麥種植區(qū)逐漸蔓延。近年來，小麥全蝕病已經(jīng)侵襲了大多數(shù)小麥種植區(qū)，尤其是在河南省、山東省等小麥主產(chǎn)區(qū)，該病有加重發(fā)生趨勢(shì)[5]。

抗病品種的選育和利用是防治病蟲危害、保障小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)最有效的方法。但是，目前小麥抗全蝕病基因資源匱乏，尚未發(fā)現(xiàn)高抗的小麥品種[6-9]。據(jù)報(bào)道，小麥親緣種屬中華山新麥草等極少數(shù)種屬能夠高抗小麥全蝕病[10-12]，但外源基因轉(zhuǎn)移到小麥費(fèi)時(shí)費(fèi)力，還存在將不良基因?qū)胄←湹娘L(fēng)險(xiǎn)。目前，小麥抗全蝕病育種進(jìn)展緩慢，小麥全蝕病的防治主要以禁止從病區(qū)引種、輪作倒茬以及化學(xué)藥物防治和生物防治為主[13-14]。近年來，基于RNA干涉(RNA interference, RNAi)的宿主誘導(dǎo)病原菌基因沉默(Host-induced gene silencing, HIGS)技術(shù)用于培育小麥抗病品種，從而為防治病原菌危害開辟了新途徑[15-16]。HIGS技術(shù)通過向宿主植物導(dǎo)入寄主病原菌致病或生長發(fā)育關(guān)鍵基因的RNAi載體，在宿主細(xì)胞產(chǎn)生病原菌基因雙鏈RNA，通過利用RNAi沉默病原菌基因，達(dá)到防治病原菌侵染和擴(kuò)展的目地。HIGS的關(guān)鍵技術(shù)之一是病原菌靶基因的選擇，而致病基因或生長發(fā)育關(guān)鍵基因都可以作為HIGS的靶基因[17]。

龍膽酸1，2-雙加氧酶(Gentisate 1,2-dioxygenase，GDO)是龍膽酸(2，5-二羥基苯甲酸)代謝途徑的第1個(gè)關(guān)鍵酶，能夠催化龍膽酸的開環(huán)反應(yīng)，產(chǎn)生反丁烯二酸或順丁烯二酸和丙酮酸，并進(jìn)入三羧酸循環(huán)。龍膽酸代謝途徑是細(xì)菌細(xì)胞中芳烴化合物代謝物進(jìn)入三羧酸循環(huán)的一條重要的途徑[18]。在小麥全蝕病菌禾頂囊殼菌等真菌細(xì)胞中也存在GDO，但目前尚不清楚其作用[14]。有人認(rèn)為，GDO可能通過催化原兒茶酸氧化環(huán)開環(huán)反應(yīng)，使得寄主細(xì)胞木質(zhì)素來源的芳香化合物降解成酚類物質(zhì)，從而分解木質(zhì)素[19-20]。木質(zhì)素代謝已經(jīng)被證明是植物抵御病原菌侵染的重要途徑，可以通過強(qiáng)化植物細(xì)胞壁，抵御病原菌對(duì)植物細(xì)胞成分的破壞[21]。

小麥抗生物脅迫種質(zhì)創(chuàng)新與利用課題組研究發(fā)現(xiàn)，在小麥全蝕病菌生長培養(yǎng)基中加入gdo基因雙鏈RNA能夠顯著抑制小麥全蝕病菌菌絲生長速率。在此基礎(chǔ)上，本研究構(gòu)建gdo基因的RNAi載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法對(duì)小麥全蝕病菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，以獲得gdoRNAi轉(zhuǎn)化子，探討gdo基因在小麥全蝕病菌生長發(fā)育和致病力中的作用。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料：供試小麥品種周麥18，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種植保存。

菌種：小麥全蝕病菌KX-7菌株，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所宋玉立研究員提供；根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105和大腸桿菌DH5α菌株在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)繁殖保存。

載體：真菌表達(dá)載體pBHt2-eGFP由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；植物RNAi載體pFGC5941由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)染色體與基因工程實(shí)驗(yàn)室保存；真菌RNAi表達(dá)載體(pBHt2-CHSA intron，10 568 bp)是通過將pFGC5941載體上的茶爾酮合成酶基因的內(nèi)含子(CHSA intron)及兩端多克隆位點(diǎn)取代真菌表達(dá)載體pBHt2-eGFP上的綠色熒光蛋白基因(eGFP)片段構(gòu)建而成，具有抗卡那霉素基因(nptⅡ) 和抗潮霉素基因(hptⅡ)2種抗生素選擇標(biāo)記。此外，CHSA intron上游連接NocⅠ、AscⅠ、SwaⅠ 3個(gè)酶識(shí)別位點(diǎn)，下游連接有BamHⅠ、XbaⅠ、PacⅠ、SmaⅠ 4個(gè)限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)；T載體(pMD20-T vector，編號(hào)6028)由Takara寶生物工程(大連)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1gdo基因片段 PCR擴(kuò)增 根據(jù)小麥全蝕病菌gdocDNA全長序列(GenBank accession: FJ717712.1)設(shè)計(jì)1對(duì)gdo基因特異引物(5′-ATGCTGGTGAACCCATCTCG-3′、5′-AGGTAGGGCA-

GAGTGGCATA-3′)。以全蝕病菌DNA為模板，利用特異引物擴(kuò)增gdo基因549 bp片段。PCR產(chǎn)物純化后連接到pMD20-T vector上，導(dǎo)入大腸桿菌DH5α中繁殖保存。

1.2.2 pBHt2-CHSA intron∶gdoRNAi載體構(gòu)建 分別通過無縫連接(In-fusion cloning)和雙酶切連接的方法在CHSA intron上游和下游插入兩段反方向序列的gdo基因PCR片段，構(gòu)建pBHt2-CHSA intron∶gdoRNAi載體。無縫連接用AscⅠ、SwaⅠ對(duì)載體進(jìn)行雙酶切，gdo基因PCR擴(kuò)增特異引物：5′-CAAACCATGGGGCGCGCCATGCTGGTGAACCCAT-

CTCG-3′、5′-AAATTCTTACACATTTAAATAGGTA-

GGGCAGAGTGGCATA-3′(下劃線部分為質(zhì)粒上的同源區(qū)段)，利用NovoRec?PCR一步定向克隆試劑盒(近岸蛋白質(zhì)科技有限公司)，將擴(kuò)增的gdo基因插入到CHSA intron上游；雙酶切連接則利用分別引入BamHⅠ和XbaⅠ識(shí)別序列的1對(duì)特異引物(5′-CGGGATCCCGAGGTAGGGCAGAGTGGCATA-3′、5′-GCTCTAGAGCATGCTGGTGAACCCATCTCG-3′)(下劃線部分為BamHⅠ和XbaⅠ識(shí)別序列及其保護(hù)堿基)擴(kuò)增的gdo基因反向片段，用BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切質(zhì)粒載體和PCR擴(kuò)增片段，將gdo基因反方向插入CHSA intron下游。將構(gòu)建成功的pBHt2-CHSA intron:gdo重組載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞。轉(zhuǎn)化子在含有卡那霉素(Kan)和利福平(Rif)的液體LB培養(yǎng)基中28 ℃、220 r/min培養(yǎng)、保存。

1.2.3 小麥全蝕病菌遺傳轉(zhuǎn)化 菌絲預(yù)處理：(1) 取0.3 g全蝕病菌新生菌絲于2.0 mL離心管中，加入1 mL滅菌的PDA液體培養(yǎng)基和2顆鋼珠，用振蕩器破碎菌體(破碎程度以200 μL槍頭可以輕松吸出并均勻懸浮為宜)，備用；(2) 將0.3 g左右的新生菌絲用1 mL的PDA液體培養(yǎng)基懸浮，加入12.5 U的溶壁酶，處理6 h后，用無菌水洗滌2次，重懸于1 mL的PDA液體培養(yǎng)基，備用。

全蝕病菌遺傳轉(zhuǎn)化：液體共培養(yǎng)，吸取50 μL預(yù)處理的菌絲懸浮液于2 mL含乙酰丁香酮(As) 400 μmol/L的pBHt2-CHSA intron質(zhì)粒農(nóng)桿菌LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、100 r/min避光共培養(yǎng)12 h；固體共培養(yǎng)，吸取50 μL預(yù)處理的菌絲懸浮液接種在預(yù)先涂布有根癌農(nóng)桿菌的Co-IM培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗條件下，連續(xù)培養(yǎng)7 d。

轉(zhuǎn)化子篩選鑒定：經(jīng)過液體共培養(yǎng)的菌絲直接涂布在含潮霉素B(Hyb) 200 μg/mL 和頭孢霉素(Cef) 300 μg/mL的固體PDA培養(yǎng)基中，25 ℃避光靜置培養(yǎng)。固體共培養(yǎng)的菌絲則用菌餅打孔器(直徑5 mm)取邊緣新菌絲餅塊接種到上述PDA平板上，除去根癌農(nóng)桿菌污染。培養(yǎng)7 d后，用打孔器選取邊緣新生菌絲，在含Hyb 200 μg/mL的固體PDA培養(yǎng)基上連續(xù)繼代篩選4次。將得到的轉(zhuǎn)化子提取DNA, 利用T-DNA左右邊界內(nèi)的htpⅡ基因特異引物 (5′-GCCCTTCCTCCCTTTATT-3′、5′-TCCATCACAGTTTGCCAGT-3′)和T-DNA區(qū)域外的nptⅡ基因特異引物(5′-TGTCATACCACTTGTCCGCC-3′、5′-ATCGAGCTGTATGCGGAGTG-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)htpⅡ和nptⅡ的特異PCR擴(kuò)增條帶(分別為549、328 bp)鑒定gdoRNAi轉(zhuǎn)化子的真實(shí)性。

1.2.4gdoRNAi轉(zhuǎn)化子生長速率分析 用打孔器選取gdoRNAi轉(zhuǎn)化子以及野生型全蝕病菌KX-7邊緣新生菌絲，接種到無抗生素的固體PDA培養(yǎng)基上，25 ℃下暗培養(yǎng)。第7天用十字交叉方法測(cè)量全蝕病菌轉(zhuǎn)化子的生長直徑(cm)，計(jì)算菌絲相對(duì)生長速率：相對(duì)生長速率=(轉(zhuǎn)化子菌落直徑/野生型菌落直徑)×100%。試驗(yàn)共分3組(批)，每組10個(gè)轉(zhuǎn)化子，每個(gè)轉(zhuǎn)化子重復(fù)4次。利用F測(cè)驗(yàn)分析各轉(zhuǎn)化子及野生型菌絲相對(duì)生長速率差異顯著性。

1.2.5 小麥全蝕病菌致病力接種鑒定 采用全蝕病菌菌餅接種法鑒定致病性。將轉(zhuǎn)化子和野生型全蝕病菌新鮮菌餅分別與蛭石混勻，在其中播種小麥周麥18。28 d后，將小麥拔出，洗掉蛭石，觀察小麥根部發(fā)病情況，測(cè)量株高，計(jì)算小麥全蝕病病情指數(shù)。病情指數(shù)=100×∑(發(fā)病級(jí)別×該級(jí)株數(shù))/(最高級(jí)別×總株數(shù))。其中，發(fā)病級(jí)別0代表無可見發(fā)病癥狀；發(fā)病級(jí)別1代表病根數(shù)占總根數(shù)<10%；發(fā)病級(jí)別3代表病根數(shù)占總根數(shù)10%～50%；發(fā)病級(jí)別5代表病根數(shù)占總根數(shù)50%～100%；發(fā)病級(jí)別7代表病根數(shù)占總根數(shù)100%，莖基部變褐，植株黃化矮化；發(fā)病級(jí)別9代表植株死亡。病情指數(shù)=0代表免疫(I)；病情指數(shù)≤20.0代表高抗(HR)；病情指數(shù)介于20.1～40.0代表抗病(R)；病情指數(shù)介于40.1～50.0代表中抗(MR)；病情指數(shù)介于50.1～60.0代表中感(MS)；病情指數(shù)介于60.1～80.0代表感病(S)；病情指數(shù)介于80.1～100.0代表高感(HS)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲預(yù)處理和根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)方式對(duì)全蝕病菌轉(zhuǎn)化率的影響

對(duì)菌絲進(jìn)行機(jī)械破碎預(yù)處理，共得到遺傳轉(zhuǎn)化后代(菌餅)302個(gè)，經(jīng)過連續(xù)4代含200 μg/mL Hyb的PDA平板篩選，得到gdoRNAi轉(zhuǎn)化子110個(gè)，轉(zhuǎn)化率為36.42%；而溶壁酶預(yù)處理菌絲，共得到遺傳轉(zhuǎn)化后代(菌餅)313個(gè)，轉(zhuǎn)化子116個(gè)，轉(zhuǎn)化率為37.06%。上述結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化前對(duì)全蝕病菌菌絲進(jìn)行破碎處理或溶壁酶處理對(duì)全蝕病菌轉(zhuǎn)化率影響不大，但機(jī)械破碎更經(jīng)濟(jì)便捷。

機(jī)械破碎預(yù)處理的全蝕病菌菌絲分別利用液體共培養(yǎng)體系和固體共培養(yǎng)體系進(jìn)行根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，固體共培養(yǎng)體系得到遺傳轉(zhuǎn)化后代279個(gè)，其中轉(zhuǎn)化子120個(gè)，轉(zhuǎn)化率為43.01%；液體共培養(yǎng)體系得到遺傳轉(zhuǎn)化后代246個(gè)，其中轉(zhuǎn)化子88個(gè)，轉(zhuǎn)化率為35.77%。上述結(jié)果表明，根癌農(nóng)桿菌固體共培養(yǎng)體系的轉(zhuǎn)化率優(yōu)于液體共培養(yǎng)體系(表1)。

表1 菌絲預(yù)處理和根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)小麥全蝕病菌轉(zhuǎn)化率Tab.1 Transformation rate of wheat take-all fungus of hypha pretreatment and Agrobacterium tumefaciens co-culture

2.2 轉(zhuǎn)化子菌絲生長情況分析

從434個(gè)(表1)gdoRNAi轉(zhuǎn)化子中隨機(jī)選取30個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行相對(duì)生長速率分析(表2)，所有g(shù)doRNAi轉(zhuǎn)化子菌絲相對(duì)生長速率都顯著小于野生菌KX-7。野生型菌落直徑平均為4.03 cm, 而30個(gè)轉(zhuǎn)化子的菌落直徑平均只有2.17 cm，菌絲相對(duì)生長速率為54.33%。上述結(jié)果表明，gdo基因沉默會(huì)明顯抑制全蝕病菌的菌絲生長速率。

從表2還可以看出，不同轉(zhuǎn)化子之間菌絲相對(duì)生長速率也有很大差異。其中轉(zhuǎn)化子M-7相對(duì)生長速率最慢，只有野生型相對(duì)生長速率的20.00%，L-5、M-5轉(zhuǎn)化子較慢；而S-4、S-7、L-1相對(duì)生長速率較快，達(dá)到了85.00%及以上，其中S-4、S-7達(dá)到了87.00%。

表2 gdo RNAi轉(zhuǎn)化子生長情況Tab.2 Growth of gdo RNAi transformants

注：同列數(shù)據(jù)后不同的小寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.01).

2.3 gdo基因RNAi對(duì)全蝕病菌致病力的影響

從上述30個(gè)gdoRNAi轉(zhuǎn)化子中隨機(jī)選取了L-4、L-2、M-5、S-6 4個(gè)轉(zhuǎn)化子和野生全蝕病菌KX-7進(jìn)行小麥苗期侵染試驗(yàn)。所用4個(gè)轉(zhuǎn)化子的菌絲相對(duì)生長速率為S-6 (59.00%)=L-2 (59.00%)>L-4 (42.00%)>M-5 (30.00%)。侵染試驗(yàn)開始前，分別利用hptⅡ和nptⅡ特異引物對(duì)這4個(gè)轉(zhuǎn)化子的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果均能擴(kuò)增出位于pBHt2-CHSA-Intron載體T-DNA區(qū)的hptⅡ基因特異條帶(549 bp)，而沒有T-DNA區(qū)域外nptⅡ基因的特異擴(kuò)增(圖1)。上述結(jié)果表明，全蝕病菌轉(zhuǎn)化子不含pBHt2-CHSA intron∶gdo完整重組載體，而是T-DNA整合到了轉(zhuǎn)化子基因組上，表明其是真正的gdoRNAi轉(zhuǎn)化子。

M：100 bp DNA ladder； P：空載體pBHt2-CHSA intron； W：無菌水

分別用4個(gè)轉(zhuǎn)化子和野生型全蝕病菌接種侵染小麥品種周麥18，接種28 d后，全蝕病菌gdoRNAi轉(zhuǎn)化子L-2和L-4侵染的小麥與未接種全蝕病菌的正常植株(CK)情況接近，根部呈白色，發(fā)根比較多；而M-5和S-6轉(zhuǎn)化子與野生全蝕病菌KX-7侵染的小麥根部發(fā)病情況類似，根部發(fā)黑嚴(yán)重，且根系短小稀疏(圖2)。

KX-7：野生全蝕病菌接種植株；L-2、 L-4、 S-6、 M-5：全蝕病菌轉(zhuǎn)化子侵染植株；CK：未接種全蝕病菌植株

接種28 d后測(cè)量小麥株高，并計(jì)算4種轉(zhuǎn)化子和野生全蝕病菌所侵染小麥的病害等級(jí)及病情指數(shù)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化子L-4和L-2所侵染的植株發(fā)病情況最輕，平均株高與未接種小麥植株(CK)接近，發(fā)病平均級(jí)別和病情指數(shù)明顯低于野生全蝕病菌KX-7，其中L-4病情指數(shù)(39.29)大大低于野生型對(duì)照(75.93)。轉(zhuǎn)化子M-5、S-6所侵染的植株株高比未接種小麥植株株高分別降低29.63%、30.72%，植株高度、發(fā)病級(jí)別和病情指數(shù)都與野生全蝕病菌KX-7非常接近(表3)。上述結(jié)果表明，gdo基因沉默后轉(zhuǎn)化子L-4和L-2的致病力比野生全蝕病菌KX-7明顯降低，而M-5和S-6轉(zhuǎn)化子的致病力沒有太大變化，受侵染小麥的病情指數(shù)表現(xiàn)為S-6(84.00)>M-5(77.08)>L-2(62.07)>L-4(39.29)。

表3 全蝕病菌接種28 d后小麥株高、發(fā)病級(jí)別及病情指數(shù)

3 結(jié)論與討論

小麥全蝕病菌在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)生的菌絲是多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在液體培養(yǎng)基中黏連成團(tuán)塊，不利于遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定。本研究在全蝕病菌遺傳轉(zhuǎn)化方面作了改進(jìn)，利用菌絲機(jī)械破碎和溶壁酶不完全消化預(yù)處理菌絲，可以獲得單細(xì)胞，并造成菌絲細(xì)胞的細(xì)胞壁創(chuàng)傷，有利于根癌農(nóng)桿菌的侵染與T-DNA向全蝕病菌細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移。此外，用菌餅打孔器取轉(zhuǎn)化后代新生菌絲，在含200 μg/mL Hyb的PDA培養(yǎng)基平板上連續(xù)4代繼代培養(yǎng)與選擇，有效去除了假陽性后代，獲得了大批全蝕病菌GgtgdoRNAi轉(zhuǎn)化子。本研究不僅為全蝕病菌提供了遺傳轉(zhuǎn)化改良方法，還為進(jìn)一步研究gdo基因在小麥全蝕病菌生長發(fā)育和致病力中的作用奠定了基礎(chǔ)。

gdo基因編碼的GDO是細(xì)菌芳香烴降解3個(gè)重要途徑中龍膽酸途徑的第1個(gè)關(guān)鍵酶，而龍膽酸代謝途徑是細(xì)菌細(xì)胞中芳烴化合物代謝進(jìn)入三羧酸循環(huán)的一條重要通路。gdo基因在全蝕病菌等病原真菌中的作用迄今尚不了解。有人推測(cè)病原真菌中g(shù)do基因可能通過催化原兒茶酸氧化環(huán)開環(huán)反應(yīng)，破壞寄主細(xì)胞木質(zhì)素，從而降低寄主抵御病原菌的能力[19-20]。本研究利用RNAi誘導(dǎo)全蝕病菌gdo基因沉默，發(fā)現(xiàn)該基因沉默導(dǎo)致全蝕病菌生長速率顯著減緩，轉(zhuǎn)化子致病力明顯下降，首次初步證實(shí)了gdo基因在全蝕病菌生長和致病方面都具有重要作用。

本研究利用T-DNA區(qū)域內(nèi)hptⅡ基因和T-DNA區(qū)域外的nptⅡ的特異引物對(duì)所用的4個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了真實(shí)性驗(yàn)證。這4個(gè)轉(zhuǎn)化子在無抗生素PDA平板上的菌絲相對(duì)生長速率為S-6(59.00%)=L-2(59.00%)>L-4(42.00%)>M-5(30.00%)。接種小麥后，L-4和L-2轉(zhuǎn)化子所侵染的植株發(fā)病情況最輕，根部呈白色，發(fā)根較多，平均株高、病情指數(shù)等與未接種全蝕病菌的小麥植株(CK)接近，病情指數(shù)明顯低于野生菌KX-7；而轉(zhuǎn)化子M-5、S-6則與野生全蝕病菌KX-7所侵染的植株病情指數(shù)相似，說明gdo基因沉默導(dǎo)致L-4和L-2轉(zhuǎn)化子致病能力大幅度下降，但對(duì)轉(zhuǎn)化子M-5、S-6的致病性影響不大。通過菌絲相對(duì)生長速率和致病性的比較分析發(fā)現(xiàn)，全蝕病菌菌絲相對(duì)生長速率和致病力兩者之間似乎并不存在對(duì)應(yīng)關(guān)系。例如，轉(zhuǎn)化子M-5菌絲相對(duì)生長速率低于L-4和L-2，但致病能力卻明顯高于后兩者。造成轉(zhuǎn)化子之間在生長和致病力方面差異較大的原因可能與T-DNA整合位置以及拷貝數(shù)有關(guān)。但是，本研究只是少量轉(zhuǎn)化子初步試驗(yàn)結(jié)果，后續(xù)研究需要利用更多轉(zhuǎn)化子侵染小麥進(jìn)行試驗(yàn)，并對(duì)轉(zhuǎn)化子gdoRNAi插入位置、拷貝數(shù)以及gdo基因沉默程度進(jìn)行系統(tǒng)分析，深入探討造成gdo基因沉默轉(zhuǎn)化子的菌絲生長速率和致病力差異的原因，進(jìn)一步明確gdo基因在Ggt病原菌生長發(fā)育和致病性方面的作用。

本研究通過構(gòu)建全蝕病菌gdo基因RNAi表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化全蝕病菌誘導(dǎo)gdo基因沉默，初步發(fā)現(xiàn)gdo基因與全蝕病菌生長和致病能力有關(guān)。但是，利用HIGS技術(shù)在小麥中誘導(dǎo)全蝕病菌gdo基因沉默的效果如何，尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。