毛娟，梁國平，盧世雄，馬宗桓，王萍，陳佰鴻*

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，甘肅蘭州 730070）

葡萄（Vitis vinifera）為葡萄科（Vitaceae）葡萄屬（VitisL）植物，漿果，多年生落葉木質(zhì)藤本[1]。目前，全世界保存的葡萄資源有5000～15 000個品種。分子標(biāo)記技術(shù)目前廣泛應(yīng)用于植物遺傳圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助選育、遺傳多樣性分析、基因定位、雜種純度及真?zhèn)舞b定等方面，分子標(biāo)記的類型也在不斷豐富，SSR標(biāo)記應(yīng)用尤其普遍，主要是由于其具有樣品信息量、多態(tài)性、重復(fù)性高的特點，另外操作較為簡單，具有共顯性和等位檢測成本低的優(yōu)勢。葡萄樹童期長、樹體大，是高度雜合體，因而遺傳學(xué)研究被限制，在遺傳育種中需要耗費大量的人力、物力及時間。分子標(biāo)記很大程度能夠提高育種選擇效率。表達(dá)序列標(biāo)簽微衛(wèi)星（EST-SSR）是建立在SSR標(biāo)記技術(shù)上的一種新型的分子標(biāo)記技術(shù)，利用EST-SSR構(gòu)建圖譜，可直接將與目標(biāo)性狀相關(guān)的EST標(biāo)記定位在不同的遺傳圖譜上，為進(jìn)一步進(jìn)行遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系和種質(zhì)資源鑒定、基因定位等方面的研究提供幫助[19]。

近年來，在葡萄中EST-SSR基因標(biāo)記研究已開始應(yīng)用，公共數(shù)據(jù)庫中葡萄EST的數(shù)量在不斷增加，這些EST資源豐富了葡萄的基因組序列信息，為大量SSR的開發(fā)提供便捷。SSR指以少數(shù)幾個核苷酸為單位多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列[2]，SSR相比于其他分子標(biāo)記技術(shù)具有明顯的特點，主要為多態(tài)性和重復(fù)性高、共顯性、易被PCR檢測、數(shù)量豐富和對基因組有很好的覆蓋性等[3]。基于EST開發(fā)的SSR標(biāo)記在蘿卜[4]、草莓[5]、梨[6]、刺梨[7]、胡桃[8]、芒果[9]、印度南瓜[10]、菜薹[11]、菊花[12]、中國櫻桃[13]、大豆[14]、小麥[15]、蕎麥[16]等許多植物種類中得到應(yīng)用。植物中開發(fā)的EST序列中SSR分布的頻率差異很大，但都包含2%～5%的SSR序列，生物技術(shù)的發(fā)展和試驗成本的降低，急劇增加了公共數(shù)據(jù)庫中EST數(shù)量，這為植物EST-SSR的開發(fā)提供了價值豐富的可利用資源。盡管葡萄的EST-SSR應(yīng)用已經(jīng)較為廣泛，但也存在一些不全面之處。郭磊等[17]對8925條葡萄EST進(jìn)行了SSR分析，驗證了所開發(fā)EST-SSR的真實性，但沒有對單核苷酸進(jìn)行分析。吳曼穎[18]對19份腺枝葡萄進(jìn)行EST-SSR標(biāo)記，探討了腺枝葡萄與其他葡萄品種之間的親緣關(guān)系，但是沒有對砧木進(jìn)行研究。王娟等[1]主要對野生種、半野生種到栽培品種演變過程進(jìn)行了遺傳標(biāo)記分析，通過聚類分析研究了62個葡萄品種之間的親緣關(guān)系，且驗證EST-SSR在葡萄種質(zhì)分類鑒定中的可行性，但選用的釀酒品種不是很多。

EST-SSR源自基因編碼序列，直接與功能基因相關(guān)。SSR位點多位于轉(zhuǎn)錄區(qū)，保守程度更高，轉(zhuǎn)移頻率較大，不同物種間有較好的通用性[20]。開發(fā)EST-SSR標(biāo)記可以通過幾個步驟：NCBI上EST序列的獲得，軟件搜尋SSR位點，引物的設(shè)計，SSR位點多態(tài)性與遺傳多樣性的驗證。本研究利用EST-SSR標(biāo)記對葡萄品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，為葡萄種質(zhì)資源合理利用及親本標(biāo)記提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

本試驗所用的52個葡萄樣品采自甘肅省蘭州、民勤、嘉峪關(guān)基地（表1）。于2017年4月—5月采集幼葉，藏于-80 ℃的冰箱冷藏備用。

1.2 葡萄EST序列的獲得及EST-SSR的發(fā)掘

從GenBank中以FASTA格式下載葡萄EST序列，用CD-HIT（http://www.bioinformatics.org/cd-hit/）在線軟件去冗余，SSR Server（http://www.rosaceae.org/cgi-bin/gdr/gdr_ssr）在線搜索SSR。搜索條件為：單、二、三核苷酸重復(fù)類型的最小重復(fù)數(shù)分別為20、6和5，四、五、六核苷酸重復(fù)類型的最小重復(fù)數(shù)均為4。

1.3 DNA的提取、PCR擴增與電泳檢測

1.3.1 DNA的提取

采用改進(jìn)的CTAB 法提取葡萄葉片DNA。

1.3.2 PCR擴增

PCR反應(yīng)體系10 μL，2×Taq PCR-supermix 5 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 2 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)； 72 ℃延伸7 min，最后4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，200 V電泳2.5 h。電泳結(jié)束后銀染顯色，銀染后在觀片箱上觀測電泳結(jié)果，并照相記錄。

1.4 EST-SSR數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)聚丙烯凝膠電泳圖譜中每個樣品的擴增結(jié)果按有或無條帶作記錄，擴增條帶存在賦值為1，否則賦值為0，獲得矩陣，利用NTSYS 2.10e數(shù)據(jù)軟件Qualitativedate程序計算相似系數(shù)，并獲得相似系數(shù)矩陣；利用Excel軟件進(jìn)行制圖；利用SHAN程序和UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，通過Tree-plot模塊生成聚類圖。

表1 供試葡萄（Vitis vinifera Linn）材料Table 1 Grape (Vitis vinifera Linn) accessions used for this study

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄基因組DNA的提取結(jié)果

采用改良的CTAB法提取了葡萄52個品種的基因組DNA，利用8%的瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測，52個品種的DNA條帶清楚、完整性好，可以進(jìn)行下一步的PCR擴增。

2.2 引物的篩選與擴增結(jié)果

2.2.1 葡萄EST-SSR出現(xiàn)的頻率及比例

從GenBank中以FASTA格式下載的葡萄EST序列220 547條，利用SSR Server在線搜索軟件共搜索到34 305條SSR序列，分別位于20 687條EST序列中，占EST總數(shù)的9.3%，表明葡萄EST中SSR含量比較豐富。

葡萄EST-SSR中出現(xiàn)最多的重復(fù)類型為單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸，三者共占EST-SSR總數(shù)的95.7%。其中單核苷酸占74.23%，二核苷酸占11.49%，三核苷酸占10.00%。而其余三種重復(fù)類型所占的比例很小，僅為4.26%。其中以四核苷酸所占的比例最多，占2.29%；其次是六核苷酸和五核苷酸，分別為1.10%和0.84%。

2.2.2 葡萄EST-SSR中的基元種類及比例

在葡萄EST-SSR中，共觀察到337種基元種類，單核苷酸至六核苷酸重復(fù)類型的基元種類分別為2、8、30、80、61和156，總體上隨核苷酸數(shù)的增大而增多，但五核苷酸例外（圖1）。

圖1 葡萄EST-SSR各重復(fù)類型包含的基元種類Figure 1 Kinds of motif in every repeat type of EST-SSRs in grape

從出現(xiàn)比例來看，出現(xiàn)最多的基元是A/T（17 164個，占72.35%），其次分別為TC/GA（975個，占4.11%）和CT/AG（931個，占3.92%）。

單核苷酸中，A/T占絕對優(yōu)勢（72.35%），而G/C很少（487個，占1.84%）。二核苷酸中，TC/GA所占比例最高（4.11%），其次為CT/AG（931個，占3.92%）、AT（363個，1.53%）。三核苷酸中，基元的比例呈逐漸降低的趨勢，TCT/AGA、TTC/GAA所占比例最高（0.96%、0.93%），其次為AAG/CTT（200個，占0.84%）和AGC/GCT（143個，占0.60%），GAT/ATC（132個，占0.56%）、TGG/CCA（130個，占0.55%）、TGC/GCA（126個，占0.53%）和TGA/TCA（125個，占0.52%）。四核苷酸中，比例最多的為AAAT/ATTT（74個，占0.31%），其次為TAAA/TTTA（52個，占0.22%）、TTTC/GAAA(41個，占0.17%)和TTAT/ATAA（33個，占0.14%）（圖2）。

五核苷酸中比例最多的是ATTTT/AAAAT（23個，占0.09%）。六核苷酸中比例最多的是CCCTGA/TCAGGG（10個，占0.04%），其它各類基元均在0.2%以下。

圖2 葡萄EST-SSR中主要基元及比例Figure 2 The major motif and their percentages of EST-SSRs in grape

2.2.3 葡萄EST-SSR中各類型不同重復(fù)次數(shù)的出現(xiàn)頻率

由表2可以看出，葡萄EST-SSR中各類型的不同重復(fù)次數(shù)的出現(xiàn)頻率相差很大，但總體上隨著重復(fù)次數(shù)的增多，其出現(xiàn)頻率逐漸降低。在單核苷酸中，出現(xiàn)頻率最高的重復(fù)次數(shù)為29，其次為20、21和22；二核苷酸中，出現(xiàn)頻率最高的重復(fù)次數(shù)為6，其次為7、8和9；三核苷酸中，出現(xiàn)頻率最高的重復(fù)次數(shù)為5，其次為6、7和8；四、五核苷酸中，不同重復(fù)次數(shù)出現(xiàn)頻率的趨勢基本相同，出現(xiàn)頻率最高的重復(fù)次數(shù)為4，其次為5、6和7；六核苷酸中，出現(xiàn)頻率最高的重復(fù)次數(shù)為4，其次為5、6和8。共設(shè)計出25對引物。

2.3 葡萄EST-SSR標(biāo)記的多態(tài)性及對品種的遺傳多樣性分析

25對葡萄EST-SSR在52份葡萄材料上的擴增結(jié)果表明，21對引物能擴增出明顯的條帶，引物的有效擴增率達(dá)84.0%，其中有14對引物擴增出明顯的多態(tài)性條帶，占有效擴增引物的66.7%。圖3和圖4分別為引物Z5M5和Z2M18在52份葡萄材料中部分?jǐn)U增的電泳圖。

25對引物中，有9對引物擴增出預(yù)期大小片段，另有7對引物擴增出大于預(yù)期長度的DNA片段，5對引物只擴增出小于預(yù)期長度的DNA片段，有4對引物幾乎沒有擴增出明顯的DNA片段。

2.4 聚類分析

利用軟件NTsystem統(tǒng)計EST-SSR數(shù)據(jù)，采用UPGMA法計算各品種間的遺傳距離，進(jìn)而得到樹型圖（圖5）。從圖5中可以看出，供試的52個葡萄品種在遺傳距離為0.67時，將‘294’和‘貝達(dá)’聚為Ⅰ類，其余聚為Ⅱ類。Ⅰ類約在0.91處將‘294’和‘貝達(dá)’區(qū)分開來，Ⅱ類約在0.71處將‘5A2’‘420A’‘101-14’‘黑292’和‘奧古斯特’聚為Ⅲ組，其余為Ⅳ組。其中Ⅲ組的‘5A2’和‘420A’又在0.77處區(qū)分開，‘奧古斯特’在0.87處區(qū)分出來。Ⅳ組在0.74處將5BB區(qū)分開來，在0.78處‘紅雙味’‘夏黑’等聚為一組，將‘龍紫旺’‘雷司令’和‘早熟無核’等聚為另一組，在0.84處將‘早熟無核’和‘里扎馬特’聚在一起，并區(qū)分開來?！墴o核’和‘3-1-1’在此聚類分析中并未區(qū)分開，它們可能是同物異名的品種。分析結(jié)果基本與形態(tài)學(xué)和生物學(xué)分類一致，表明本研究所開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記可用于葡萄種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。

表2 葡萄EST-SSR中各重復(fù)類型中不同重復(fù)次數(shù)的出現(xiàn)次數(shù)Table 2 The frequency of different repeat times in every repeat types of EST-SSRs in grape

表3 葡萄EST-SSR引物信息表Table 3 Information of EST-SSRs primers in grape

續(xù)表3 Continued table 3

圖3 引物Z5M5在28份葡萄材料上的PCR擴增圖Figure 3 PCR amplification profile of 28 varieties by primerZ5M5 in grape

3 討論與結(jié)論

本研究從220 547條葡萄EST序列中共搜索到20 687條至少含有一個SSR的EST序列，占EST總數(shù)的9.3%，高于郭磊等[17]對葡萄EST-SSR的搜索結(jié)果（6.5），這可能是由于搜索標(biāo)準(zhǔn)和數(shù)據(jù)庫大小的不同而造成的。研究表明，不同植物間EST的SSR分布頻率大不相同，如葡萄（9.3%）、蘿卜（6.4%）、草莓（2.67%）、梨（7.12%）[4-6]、小麥（2.52%）、辣椒（7.83%）、荔枝（8.99%）[15,21-22]的頻率較低，頻率較高的包括刺梨（20.37%）、中國櫻桃（15.62%）[7,13]、桃（20.76%）、黃皮（17.14%）、萬壽菊（28.29%）[23-25]。本研究25對引物中有9對引物擴增出預(yù)期大小片段，有12對引物擴增出大于或小于預(yù)期長度的DNA片段，有4對引物幾乎沒有擴增出明顯的DNA條帶，這可能是由于引物特異性不強，擴增出其它與引物同源的序列；擴增出大于預(yù)期長度的DNA片段是由于擴增出了包含外顯子和內(nèi)含子的DNA序列[26]。

表4 葡萄25對EST-SSR引物擴增出多態(tài)性條帶數(shù)Table 4 Grapes 25 to EST-SSRs primers amplification polymorphism bands

圖4 引物Z2M18在29份葡萄材料上的PCR擴增圖Figure 4 PCR amplification profile of 29 varieties by primer Z2M18 in grape

圖 5 25對EST-SSR 引物對52份葡萄材料的聚類圖Figure 5 Dend program of 25 varieties based on 52 EST-SSRs markers in grape

SSR側(cè)翼序列的保守程度和SSR本身進(jìn)化的穩(wěn)定性決定了一個物種的SSR引物在不同物種間的通用性[17]。SSR引物在不同物種間的通用可以顯著提高標(biāo)記的利用價值，從而有效地彌補物種分子標(biāo)記的不足，豐富標(biāo)記數(shù)量。來源于傳統(tǒng)基因組的SSR在物種之間的通用性很差，作為基因的一部分，EST-SSR的側(cè)翼序列在物種之間高度保守，因此EST-SSR引物在物種間具有較高的通用性[27]。

在大多數(shù)物種中二核苷酸和三核苷酸是最常見的EST或者轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)基序的類型[28-30]，但葡萄中豐富的SSR重復(fù)基序是六核苷酸重復(fù)，其次是四核苷酸重復(fù)，分別占SSR總數(shù)的46.29%和23.73%，合計占總SSR的70.02%，其次為18.10%的五核苷酸重復(fù)，最少的是單核苷酸和二核苷酸基序重復(fù)。葡萄中以六核苷酸和四核苷酸為主要SSR重復(fù)基序的情況與辣椒類似[26]。葡萄中以六核苷酸和四核苷酸SSR基序為主體，而單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸SSR基序的分布占少數(shù)，可能是自然選擇的結(jié)果。本研究結(jié)果表明，利用葡萄轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)SSR標(biāo)記具有可行性，同時這些標(biāo)記的開發(fā)為葡萄種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助育種、遺傳圖譜構(gòu)建和功能基因的挖掘等奠定了基礎(chǔ)。