鄧紅，雷佳蕾，楊天歌，劉旻昊，孟永宏，郭玉蓉，薛佳

超高壓和高溫短時殺菌對NFC蘋果汁貯藏期品質(zhì)的影響

鄧紅1,2,3，雷佳蕾1，楊天歌1，劉旻昊1，孟永宏1,2,3，郭玉蓉1,2,3，薛佳1,2,3

（1陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安 710119；2國家蘋果加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，西安 710119；3西部果品資源高值利用教育部工程研究中心，西安 710119）

【】通過比較兩種不同殺菌處理（高溫短時High temperature short-time和超高壓Ultra-high pressure殺菌）的非濃縮還原（Not from concentrate，NFC）蘋果汁貯藏期品質(zhì)變化，為我國NFC果汁產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的制定和規(guī)范市場NFC果汁產(chǎn)品貨架期提供試驗依據(jù)。以‘紅富士’蘋果為原料制備NFC蘋果汁，采用高溫短時殺菌（HTST，98℃，50 s）和超高壓殺菌（UHP，400 MPa，15 min）處理后，在4℃條件下冷藏，利用微生物學(xué)、化學(xué)及主成分分析（PCA）等方法以及HPLC、GC-MS等手段研究兩種不同殺菌處理的NFC蘋果汁貯藏期微生物、理化指標(biāo)、多酚含量、酶（Polyphenol oxidase，PPO；Peroxidase，POD）活性、抗氧化活性、香氣成分的變化。HTST和UHP處理對細(xì)菌總數(shù)、大腸桿菌、霉菌與酵母的殺菌率均為100%，但貯藏第10、5周時果汁菌落總數(shù)分別呈顯著增加（89.15%、58.65%），大腸桿菌、霉菌與酵母增殖速度不明顯；貯藏期HTST和UHP兩種處理NFC蘋果汁微生物種群變化小，但優(yōu)勢菌屬不同。兩種處理的NFC蘋果汁貯藏期可溶性固形物、pH、總酸的變化不大，但總色差顯著增大（＜0.05）；貯藏期HTST和UHP處理NFC蘋果汁中表兒茶素分別下降了33%和53%，F(xiàn)RAP總抗氧化能力和DPPH自由基清除率分別保持在76%、73%和77%、76%，HTST處理NFC蘋果汁的多酚含量和抗氧化活性明顯高于UHP處理的樣品；HTST處理后貯藏期NFC蘋果汁的PPO與POD完全失活，但UHP處理樣品的酶活性呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢。HTST處理后果汁18種特征香味物質(zhì)總的保留率為52%，但貯藏期香氣成分保持穩(wěn)定；UHP處理NFC蘋果汁的香氣含量（57.75 mg/100 mL）接近對照樣品（57.17 mg/100 mL），但貯藏期香氣成分變化顯著，降低了26.13%。HTST和UHP殺菌處理的NFC蘋果汁在4℃可分別貯藏9、4周，貯藏期內(nèi)其品質(zhì)滿足商業(yè)要求，HTST處理NFC蘋果汁貨架期長于UHP處理。

NFC蘋果汁；超高壓處理；高溫短時滅菌；品質(zhì)；貯藏期

0 引言

【研究意義】中國的蘋果優(yōu)勢明顯，產(chǎn)量占世界各地蘋果總產(chǎn)量的47.8%，其中陜西2017年蘋果產(chǎn)量達(dá)到1.15×107t，居全國第一[1-2]，除鮮食外，蘋果汁是其重要的加工產(chǎn)品。按照加工工藝的不同，蘋果汁可分為非濃縮還原汁（Not from concentrate，簡稱NFC）和濃縮還原汁（From concentrate，簡稱FC）兩大類。NFC果汁具有新鮮水果的營養(yǎng)和口感，總體品質(zhì)均明顯高于FC果汁，符合人們健康保健的消費需求，具有極大的開發(fā)前景[3-4]。但是目前由于關(guān)鍵的殺菌工藝和設(shè)備不完善使得NFC果汁普遍存在保質(zhì)期相對較短、成本高等問題，限制了NFC果汁產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[5]。因此，研究不同殺菌方式對NFC蘋果汁貯藏品質(zhì)的影響，對延長NFC果汁貨架期、提高其市場價值有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】很多對NFC果汁的研究主要集中在非熱處理[6-8]（超高壓（Ultra-high pressure，UHP）、脈沖電場（Pulsed electric field，PEF）、高壓均質(zhì)（High pressure homogenization，HPH）等）技術(shù)與工藝參數(shù)、NFC果汁品質(zhì)分析[9]、NFC果汁鑒偽[10-11]等方面；如關(guān)云靜[12]研究了高壓均質(zhì)對NFC芒果汁微生物和品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)HPH可有效殺滅NFC芒果汁中自然菌群和接種的大腸桿菌，對理化性質(zhì)（pH、TSS和TA）和維生素C含量沒有顯著影響，但果汁懸浮穩(wěn)定性提高；茍小菊等[13]分析了16個蘋果品種非濃縮還原汁（NFC）的理化特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NFC蘋果汁可分為3大類，同一大類中各品種之間不同理化指標(biāo)差異較小，可作為NFC果汁生產(chǎn)和智能復(fù)配的可替代品種。目前在蘋果NFC果汁貯藏期品質(zhì)變化方面的研究不多見，CAO等[14]研究了高靜水壓加工混濁與澄清草莓汁貯藏過程中質(zhì)量的變化，KRYSTIAN等[15]研究了超臨界二氧化碳（SCCD，10—60 MPa/45℃/30 min）對蘋果濁汁的影響以及渾濁蘋果汁在4℃儲存10周其酶活（多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD））、酚類、維生素C、糖類、物理化學(xué)性質(zhì)的變化，發(fā)現(xiàn)糖和總多酚沒有顯著變化，但施加的壓力對多酚的降解有重要影響，且兩種酶與綠原酸、兒茶酚存在協(xié)同作用?！颈狙芯壳腥朦c】目前，我國NFC果汁產(chǎn)品缺少國家標(biāo)準(zhǔn)，市場已有產(chǎn)品由于生產(chǎn)工藝不同導(dǎo)致貨架期差異很大，消費者難以判斷品質(zhì)優(yōu)劣；同時也缺少關(guān)于不同殺菌方法對NFC蘋果汁貯藏品質(zhì)的影響以及貨架期預(yù)測方面的研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用化學(xué)、微生物學(xué)及主成分分析（PCA）等方法以及HPLC、GC-MS等手段研究兩種不同殺菌處理的NFC蘋果汁貯藏期微生物、理化指標(biāo)、多酚、抗氧化活性、香氣成分的變化，探明NFC果汁生產(chǎn)中兩種殺菌方法對品質(zhì)的影響，為我國NFC果汁產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2017年10月至2018年12月在陜西師范大學(xué)食品學(xué)院進行。

1.1 試驗材料

原材料：紅富士蘋果于2017年9月中旬購于華潤萬家超市，并于4℃冷藏保存。試劑：沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、4-羥基苯甲酸、兒茶素、表兒茶素、蘆丁、槲皮素、根皮苷，均為色譜純，Sigma-Aldrich（中國）有限公司；食品級抗壞血酸、氯化鈣、Trolox、TPTZ、DPPH、PVPP、乙酸、氯化鈉、乙酸鈉、鄰苯二酚、過氧化氫、愈創(chuàng)木酚、聚乙二醇6000、硫酸鐵、乙醇等其他化學(xué)品（分析純）購自天津福晨有限公司；2-辛醇、甲醇均為色譜級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；平板計數(shù)瓊脂、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂和孟加拉紅培養(yǎng)基均為生化試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HPP.L1-600MPa-10L超高壓處理裝置（天津華泰森宇生物工程技術(shù)有限公司），HU-780WN榨汁機（韓國首爾Hurom電器公司），Testo 106電子探針溫度計（德國Testo有限公司），PHS-3C pH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司），MASTER-53α手持折光儀（日本ATAGO（愛拓）公司），3k30超高速低溫離心機（美國Sigma公司），NS800色差儀（中國深圳3nh有限公司），1260 Infinity安捷倫高效液相色譜儀（上海安捷倫科技有限公司），C18液相色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，上海安捷倫科技有限公司），DYCP-32B瓊脂糖凝膠電泳儀（北京六一生物科技有限公司），GC/MS QP2010氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（東京島津電子有限公司），AOC 6000自動進樣器（東京島津電子有限公司），SPME萃取頭（50/30 μm，DVB/CAR/PDMS，1 cm，美國Supelco公司）等。

1.3 試驗方法

1.3.1 NFC蘋果汁的制備與殺菌處理

（1）NFC蘋果汁制備 選用新鮮的沒有機械損傷且成熟度好的‘紅富士’蘋果，用流動水洗凈果皮上的泥沙等雜質(zhì)，削皮去核后切塊，在護色液（0.5% VC+0.25% CaCl2）中浸泡30 s進行護色處理；后將蘋果塊投入HU-780WN榨汁機榨汁，用100目篩進行粗濾除雜，殺菌后灌裝封口，于4℃冷藏備用[9,13]。

（2）HTST殺菌處理 參照文獻[9,13]和預(yù)試驗結(jié)果確定條件進行殺菌，NFC蘋果汁用實驗室規(guī)模的巴氏滅菌器在98℃下巴氏滅菌50 s，使用電子探針溫度計在線監(jiān)控果汁的中心溫度，待果汁中心溫度達(dá)到要求后計時。將殺菌的果汁在汁溫不低于80℃條件下熱灌裝到滅菌過的玻璃瓶中并迅速封口，冷卻至低于40℃后在4℃冰箱冷藏保存。

（3）UHP殺菌處理 參照文獻[16]和預(yù)試驗結(jié)果確定條件進行殺菌，10 L UHP設(shè)備用于塑料瓶裝NFC蘋果汁UHP殺菌處理，蒸餾水用作壓力傳遞介質(zhì)。加壓速率約為120 MPa/min，減壓時間小于3 s。最終壓力400 MPa，處理時間15 min是壓力的持續(xù)時間，不包括壓力增加和釋放時間。樣品的初始溫度為10℃，整個處理過程中樣品溫度不超過25℃。

1.3.2 NFC蘋果汁品質(zhì)分析

（1）NFC蘋果汁理化指標(biāo)的檢測 NFC蘋果汁pH的測定、可溶性固形物（total soluble solid，TSS）的測定、可滴定酸度TA的檢測均與文獻[17]方法相同。

（2）NFC蘋果汁色澤和酶活性的檢測 使用NS800比色計測量NFC蘋果汁的色澤，其顏色表示為*（明度指數(shù)），*（紅值，當(dāng)其為正值時，數(shù)值越大，顏色越紅）和*（黃值，正值時數(shù)值越大，顏色越黃，*為負(fù)值時絕對值越大，顏色越藍(lán)）[17]。酶活性（多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD））的測定方法與文獻[18]方法相同。

（3）NFC蘋果汁抗氧化活性與多酚組分的檢測 參照文獻[19]的方法檢測NFC蘋果汁DPPH自由基清除率和FRAP總抗氧化活性。以綠原酸、表兒茶素、兒茶素、沒食子酸、4-羥基苯甲酸、咖啡酸、蘆丁、槲皮素和根皮苷為標(biāo)準(zhǔn)品，參照鄧紅等[20]的方法對多酚組分進行測定。

（4）NFC蘋果汁的香氣成分的檢測 采用頂空固相微萃取法（HS-SPME）富集提取蘋果汁中香氣成分，參考郭靜等[21]的方法，使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC/MS）檢測貯藏期NFC蘋果汁的香氣成分。GC/MS QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀與AOC 6000自動進樣器組合應(yīng)用于蘋果汁香氣成分的快速檢測和分析。

香氣成分的定性分析主要是根據(jù)氣相色譜-質(zhì)譜中NIST 14質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫、匹配度和保留時間對各個物質(zhì)進行檢索，選擇匹配度大于85%的物質(zhì)作為有效的香氣成分。香氣成分的定量分析方法是每次檢測均加入相同質(zhì)量濃度的2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)物進行定量，按式（1）計算蘋果汁中香氣物質(zhì)的含量，取3次檢測結(jié)果的平均值為最終分析結(jié)果。

香氣物質(zhì)含量=（各物質(zhì)的峰面積/內(nèi)標(biāo)物的峰面積）×內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度 （1）

（5）NFC蘋果汁的微生物指標(biāo)與細(xì)菌多樣性的檢測 菌落總數(shù)的測定、霉菌酵母的測定、大腸菌群的測定等參照國標(biāo)及文獻[22]進行，重復(fù)3次，取平均值。細(xì)菌多樣性的檢測方法[23-24]如下：

①基因組DNA的提取和PCR擴增 樣本的基因組DNA進行提取采用CTAB（Hexadecyl trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨）方法，之后檢測DNA的純度和濃度利用瓊脂糖凝膠電泳。不同區(qū)域的16S rRNA 均為擴增特異性引物。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)體系：15 μL Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix；0.2 μmol?L-1正向和反向引物，以及約10 ng模板DNA。PCR的擴增程序為：98℃1 min；98℃10 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)。最后72℃保持5 min。

②PCR產(chǎn)物的混樣、純化以及文庫構(gòu)建和測序 使用2%濃度的瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用1×TAE濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR產(chǎn)物，剪切回收目標(biāo)條帶。使用Thermofisher 公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測合格后，基于Thermofisher的Ion S5TMXL上機測序，進行單端測序。

對有效數(shù)據(jù)進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類和物種分類分析。一方面，為了得到樣本內(nèi)物種豐富度和均勻度信息，不同樣本或分組間的共有和特有OTUs信息，對OTUs進行豐度、Alpha多樣性計算、Venn圖和花瓣圖等分析。另一方面，可以對OTUs進行多序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，通過主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）、無度量多維標(biāo)定法（non-metric multi-dimensional scaling，NMDS）等降維分析和樣本聚類樹展示，可以探究不同樣本或組別間群落結(jié)構(gòu)的差異。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗均重復(fù)三次取平行樣進行分析。使用Origin 8.0和SPSS 12.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD），＜0.05被認(rèn)為是影響顯著。主成分分析（principal component analysis，PCA）被用作評估每個數(shù)據(jù)集以檢測潛在異常值的探索性技術(shù)。

2 結(jié)果

2.1 HTST和UHP兩種處理的NFC蘋果汁貯藏期pH、可溶性固形物和可滴定酸度的變化

由表1可知，兩種方法殺菌后NFC蘋果汁的pH、TA、TSS與對照基本無差異，貯藏期HTST和UHP處理后的NFC蘋果汁中的可溶性固形物沒有顯著變化，pH下降幅度稍大（＜0.05），可滴定酸度增大不明顯。

表1 超高壓與高溫短時殺菌處理的NFC蘋果汁4℃貯藏期pH、可滴定酸度、可溶性固形物的變化

UHP，超高壓殺菌處理；HTST，高溫短時殺菌處理?！啊北硎疚礄z測。Control為第1周第1天制備的NFC蘋果汁，未殺菌樣品的分析結(jié)果；其余均為NFC蘋果汁殺菌后貯藏期每周第1天的分析結(jié)果。同列不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）。下同

UHP indicate ultra-high pressure, and HTST indicate high temperature short-time; “—”indicate no detection. Control is the analysis results of NFC apple juice prepared on the first day of the first week. The other data are analysis results on the first day of every week after the sterilization of NFC apple juice during the storage period. Different letters of the same column data indicate significant differences (＜0.05). The same as below

2.2 兩種處理的NFC蘋果汁貯藏期色澤和酶活性的變化

2.2.1 兩種處理的NFC蘋果汁貯藏期色澤的變化 NFC蘋果汁在4℃貯藏期間的顏色參數(shù)（*、*、*值）如表2所示。與對照相比，HTST處理的NFC蘋果汁的*值（亮度）略有下降，UHP處理后蘋果汁的*值接近未殺菌處理的果汁，但貯藏期HTST處理的NFC蘋果汁*值（亮度）下降幅度小于UHP處理；兩種處理的NFC蘋果汁的*值（紅值）和*值（黃值）沒有顯著差異，但與對照相比，兩種處理之后*值和*值有明顯降低（＜0.05）；然而貯藏期*值和*值的變化不大，兩種處理的NFC蘋果汁顏色發(fā)生小幅變化，但仍在可接受范圍內(nèi)。

2.2.2 貯藏期兩種處理的NFC蘋果汁酶活性的變化 HTST處理可以完全殺滅NFC蘋果汁中PPO和POD酶的活性，且整個貯藏期均未檢測出來；但UHP處理后果汁中多酚氧化酶和過氧化氫酶的活性均升高（高于對照Control）；隨著貯藏時間的增加，UHP處理后NFC蘋果汁的酶活性略有下降，在貯藏期的第5周，PPO和POD活性與對照相比分別下降了17.4%和14.3%（表3）。

2.3 兩種處理的NFC蘋果汁貯藏期多酚組分和抗氧化活性的變化

2.3.1 兩種處理的NFC蘋果汁貯藏期多酚組分的變化 在本研究中，從NFC蘋果汁中成功分離出了9種酚類物質(zhì)，含量最高的兩個單酚被確定為綠原酸和表兒茶素，兩種處理的NFC蘋果汁在貯藏期間的HPLC色譜圖如圖1所示。通過HPLC檢測，對照樣品、HTST和UHP處理的蘋果汁的總多酚含量分別為224.80、173.80和127.68 μg?mL-1；在HTST和UHP處理后，與對照樣品相比，NFC蘋果汁中綠原酸和4-羥基苯甲酸的含量略有增加，兒茶素、表兒茶素、蘆丁和根皮苷的含量顯著下降；UHP處理后總酚類物質(zhì)顯著減少，一些單酚類物質(zhì)如表兒茶素、兒茶素、蘆丁和根皮苷在超高壓處理后顯著降低，可能是因為多酚氧化酶和過氧化物酶在超高壓處理后的NFC蘋果汁中具有較高的殘留活性，多酚氧化酶和過氧化氫酶等內(nèi)源酶暴露于其基質(zhì)中，這兩者都可以氧化并誘導(dǎo)單酚物質(zhì)的降解并形成聚合物。HTST處理后，NFC蘋果汁中綠原酸和表兒茶素的含量高于超高壓處理，可能是酚類物質(zhì)的提取性能因熱處理過程中植物細(xì)胞壁的破壞而發(fā)生變化，多酚物質(zhì)被釋放出來，導(dǎo)致其含量較高[25]。HTST和UHP處理的果汁中綠原酸分別從113.96、98.99 μg?mL-1降解至97.93和97.93 μg?mL-1；表兒茶素分別下降了33%和53%；4-羥基苯甲酸的降解率分別為0.05%和0.34%；槲皮素下降0.05%和0.50%；沒食子酸減少0.29%和0.34%。在貯藏期間，NFC蘋果汁中大多數(shù)多酚物質(zhì)的降解主要由非氧化反應(yīng)引起，槲皮素的降解可能是由于槲皮素糖苷的不穩(wěn)定性引起。

表2 超高壓與高溫短時殺菌處理的NFC蘋果汁4℃貯藏期色值的變化

表3 超高壓與高溫短時殺菌處理的NFC蘋果汁4℃貯藏期酶活（多酚氧化酶和過氧化氫酶）的變化

ND表示未檢測出PPO與POD酶活

ND indicated that enzyme activity of PPO and POD was not detected

A：超高壓處理的NFC蘋果汁第一周的HPLC色譜圖；B：高溫短時殺菌處理的NFC蘋果汁第一周HPLC色譜圖；C：貯藏期高溫短時殺菌處理的NFC蘋果汁的HPLC色譜圖；D：貯藏期超高壓處理的NFC蘋果汁的HPLC色譜圖。圖A、B中色譜峰上數(shù)字1-9分別表示沒食子酸、4-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、兒茶素、表兒茶素、蘆丁、槲皮素、根皮苷

2.3.2 兩種處理的NFC蘋果汁貯藏期抗氧化活性的變化 由圖2可知，UHP與HTST處理的NFC蘋果汁的DPPH自由基清除率和FRAP總抗氧化能力隨著貯存期的延長而降低；貯藏期結(jié)束時，F(xiàn)RAP總抗氧化能力分別保持在73%和76%，DPPH自由基清除率分別保持在76%和77%。

2.4 兩種處理的NFC蘋果汁貯藏期香氣成分的變化

通過SPME/GC-MS對UHP和HTST處理的NFC蘋果汁貯藏期香氣成分的變化進行分析，從貯藏期NFC蘋果汁的揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖（省略）中定量檢測到HTST、UHP處理的NFC蘋果汁中分別有54和44種芳香族化合物（表4）。其中，酯類物質(zhì)分別為36、24種，醇類物質(zhì)分別為6、7種，醛類物質(zhì)分別為7、6種，酮類物質(zhì)分別為2、2種，萜烯類物質(zhì)分別為1、4種，醚類物質(zhì)均為1種，其中酯類物質(zhì)占蘋果汁中總揮發(fā)性化合物的很大比例。通過UHP處理的蘋果汁中的芳烴化合物含量為酯（31.61 mg/100mL）＞醇（14.81 mg/100 mL）＞醛（14.48 mg/100 mL）＞萜烯類（1.73 mg/100 mL）＞酮（0.11 mg/100 mL）＞乙醚（0.066 mg/100 mL）；HTST處理的蘋果汁中的芳香化合物依次為酯（10.38 mg/100 mL）＞醛（9.36 mg/100 mL）＞醇（2.85 mg/100 mL）＞萜烯（1.50 mg/100 mL）＞酮（0.10 mg/100 mL）＞乙醚（0.04 mg/100 mL）。

為了評估這些化合物在4周儲存期間對HTST與UHP處理的蘋果汁質(zhì)量的影響，對18種關(guān)鍵化合物進行了主成分分析（PCA）。PC1和PC2的貢獻率分別為64.4%和21.1%，累積貢獻率大于70%，如分?jǐn)?shù)圖（圖3-A）和變量負(fù)荷圖（圖3-B）所示。由PC1和PC2定義的樣本越集中（圖3-C），相似性越高。未滅菌處理的果汁、UHP與HTST處理的果汁之間存在輕微分離。在4周的儲存期間，通過HTST處理的NFC蘋果汁，相對于UHP處理的NFC蘋果汁，在儲存期間香氣保持更穩(wěn)定。圖3-B顯示對PC1最重要的貢獻是己醛、（E）-2-己烯醛、乙酸丁酯、乙酸丙酯和丁酸丁酯，PC2的主要貢獻者是乙酸己酯。結(jié)合圖3-A和3-B，可以看出HTST處理的NFC蘋果汁與PC1呈負(fù)相關(guān)，因此，己醛、（E）-2-己烯醛、乙酸丁酯，乙酸丙酯和丁酸丁酯含量均較低。未殺菌處理和UHP處理的NFC蘋果汁與PC1呈正相關(guān)，表明己醛、（E）-2-己烯醛、乙酸丁酯、乙酸丙酯和丁酸丁酯含量均較高。未殺菌處理的NFC蘋果汁在PC1上得分最高，而UHP加工蘋果汁在第4周得分最低。結(jié)果表明，在4周貯藏期間，HTST處理的果汁中乙酸己酯含量沒有顯著變化，而UHP處理的果汁中乙酸己酯含量顯著下降。同時，熱圖可以更直觀地顯示18種關(guān)鍵香味物質(zhì)濃度水平，圖3-C顯示了在4周儲存期間未殺菌處理、HTST和UHP處理的NFC蘋果汁中18種主要香氣成分的含量變化。根據(jù)含量/顏色規(guī)則，可知HTST果汁的香氣成分的變化相對較小，并且在果汁中未檢測到乙醛。由于乙醛含量低，香氣值低，對香氣幾乎沒有影響。在UHP處理的果汁中，1-己醇在第2周顯著降低，之后變化穩(wěn)定，可能是由于酶促褐變過程產(chǎn)生的化合物與氣味活性化合物之間的相互作用，從而影響了揮發(fā)性釋放，導(dǎo)致氣味減弱?？傊A存期間，乙醛和乙酸己酯含量降低，丁酸2-甲基己酯含量增加，NFC蘋果汁的綠色氣味減少，甜味物質(zhì)增加。

A：主成分分析PCA評分圖；B：PCA負(fù)荷變量圖；C：兩個處理的蘋果汁在貯藏期間18種主要香氣成分變化的熱圖。Control：未處理的NFC蘋果汁；HHP1、2、3、4W：其超高壓處理的NFC蘋果汁貯藏1、2、3、4周；HTST1、2、3、4W：超高溫瞬時殺菌處理的NFC蘋果汁貯藏1、2、3、4周A: Principal component analysis PCA score map; B: PCA load variable map; C: Heat map of 18 major aroma components during storage of two treated apple juices. CK: Untreated NFC apple juice; HHP1, 2, 3, 4W: NFC apple juice treated with ultra-high pressure during storage 1, 2, 3 and 4 weeks; HTST1, 2, 3, 4W: NFC apple juice treated with ultra-high temperature instantaneous sterilization 1, 2, 3 and 4 weeks. (E)-2-己烯醛，Hexenal：己烯醛，Acetaldehyde：乙醛，1-hexanol：1-己醇，2-methyl-1-butanol：2-甲基-1-丁醇，1-butanol：1-丁醇，2-methyl butyrate：2-甲基-丁酯，Hexyl butyrate：丁酸己酯，Butyl 2-methyl butyrate：2-甲基丁酸丁酯，Hexyl acetate：乙酸己酯，Ethyl hexanoate：己酸乙酯，Butyl butyrate：丁酸丁酯，Butyl acetate：乙酸丁酯，Amyl acetate：乙酸戊酯，Isoamyl formate：甲酸異戊酯，Ethyl 2-methyl butyrate：2-甲基丁酸乙酯，Ethyl butyrate：丁酸乙酯，Propyl acetate：乙酸丙酯

表4 UHP與HTST殺菌的NFC蘋果汁貯藏期香氣成分的變化

Table 4 Changes of aroma content in NFC apple juice after HTST or UHP treatment during storage period at 4℃

續(xù)表4 Continued table 4

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續(xù)表4 Continued table 4

2.5 兩種處理的NFC蘋果汁貯藏期主要微生物指標(biāo)的變化與多樣性分析

2.5.1 主要微生物指標(biāo)的變化 在本研究中，HTST與UHP處理可使NFC蘋果汁中的菌落總數(shù)、霉菌酵母和大腸菌群完全失活。在4℃的儲存期間，大腸菌群的水平一直是低于檢測限，第5周超高壓處理的NFC蘋果汁的菌落總數(shù)數(shù)值為2 log CFU/mL（表5）。這表明在4周儲存期間由超高壓處理得到的NFC蘋果汁是微生物安全的，而在9周儲存期間通過高溫短時滅菌處理的NFC蘋果汁也是微生物安全的。目前已經(jīng)證明超高壓與高溫短時滅菌處理在減少食物中微生物數(shù)量方面的有效性，但是物理處理（熱、輻射等）和化學(xué)處理后的孢子很可能具有非常高的抗性休眠形式，并且它們的耐壓性隨著營養(yǎng)物質(zhì)豐富而增加，因此一些微生物將通過自我修復(fù)方式來恢復(fù)生長[26]，所以第5周和第10周NFC果汁菌落總數(shù)增殖明顯，分別達(dá)89.15%、58.65%。

2.5.2 細(xì)菌多樣性的分析 由圖4可知，檢測到未殺菌處理NFC蘋果汁的主要的分類單位（operational taxonomic units，OTU）是變形桿菌門（Proteobacteria，75.71%）、生氧光細(xì)菌門（Oxyphotobacteria，19.21%）、厚壁菌門（Firmicutes，0.49%）和其他類（4.24%）；檢測到超高壓NFC蘋果汁的主要OTU是變形桿菌門（Proteobacteria，75.03%）、生氧光細(xì)菌門（Oxyphotobacteria，19.90%）、厚壁菌門（Firmicutes，0.21%）和其他類（4.60%）；UHP處理NFC蘋果汁在貯藏期微生物種群的主要變化是第4周變形桿菌相對豐度變化劇烈，顯著增加，在貯藏期微生物種群基本沒有大的變化，其OTU保持相對穩(wěn)定。這一結(jié)果與PULIDO等[27]研究結(jié)果類似，他們對細(xì)菌群落的焦磷酸測序分析顯示，在貯藏期間，UHP處理的芒果果漿的放線菌門（45.63%）、厚壁菌門（42.55%）、變形菌門（10.68%）和擬桿菌門（1.0%）的起始對照樣品中的相對豐度發(fā)生了變化，UHP處理還誘導(dǎo)變形菌的強烈增加，然后是厚壁菌的晚期恢復(fù)和較小程度的放線菌的變化；他們還發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌是對照樣品在早期儲存期間和在晚期儲存期間在UHP處理的樣品中檢測到的主要OTU。試驗分析結(jié)果顯示HTST處理NFC蘋果汁的主要OTU是變形桿菌門（Proteobacteria，64.63%）、厚壁菌門（Firmicutes，20.91%）、生氧光細(xì)菌門（Oxyphotobacteria，10.46%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，1.60%）。

Control：未處理的NFC蘋果汁；HHP1、2、3、4、5：貯藏期超高壓處理的NFC蘋果汁1、2、3、4、5周；HTST1、3、5、7、10：超高溫瞬時殺菌處理的NFC蘋果汁1、3、5、7、10周。A-E依次是OTU按門、綱、目、科、屬分類水平分類 CK: Untreated NFC apple juice; HHP1, 2, 3, 4, 5: NFC apple juice treated with ultra-high pressure during storage 1, 2, 3, 4, and 5 weeks; HTST1, 3, 5, 7, 10: NFC apple juice treated with ultra-high temperature instantaneous sterilization 1, 3, 5, 7, and 10 weeks. A-E: OTU is classified according to the door, outline, purpose, and department, respectively

表5 超高壓與高溫短時滅菌處理的NFC蘋果汁4℃貯藏期微生物指標(biāo)的變化

未殺菌處理的果汁和貯藏期UHP處理的果汁中檢測到的優(yōu)勢菌屬為未確認(rèn)的立克次氏體目屬（unidentified），未確認(rèn)的生氧光細(xì)菌屬（unidentified），假單胞菌屬（）；HTST處理的果汁貯藏期檢測到的優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬（），未確認(rèn)的生氧光細(xì)菌屬（unidentified），微小桿菌屬（），未確認(rèn)的立克次氏體目屬（unidentified），鞘氨醇單胞菌屬（）。

3 討論

3.1 不同殺菌工藝對NFC蘋果汁理化指標(biāo)與色澤影響

前人研究已經(jīng)表明蘋果品種和成熟期對蘋果汁理化指標(biāo)有很大影響[9,13]，對同一個品種NFC蘋果汁，本試驗說明HTST與UHP殺菌處理對理化指標(biāo)則沒有明顯影響，此結(jié)果與關(guān)云靜[12]研究相似，CHEN等[28]研究了高靜水壓處理和超高溫處理對生姜濁汁和木瓜飲料質(zhì)量和貨架期的影響，發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果。其次，對果蔬汁的品質(zhì)進行評價時，pH作為一項重要指標(biāo)，對判斷果蔬汁的變質(zhì)有指示性作用；分析認(rèn)為貯藏期UHP和HTST處理的NFC蘋果汁pH的降低可能是由于乳酸菌、酵母菌等微生物隨著貯藏時間延長其代謝產(chǎn)生了酸性物質(zhì)，同時伴隨一系列生化反應(yīng)所導(dǎo)致。胡盼盼等[29]研究也發(fā)現(xiàn)HTST處理、巴氏殺菌和熱殺菌技術(shù)處理的鮮榨蘋果汁在貯藏期間pH均有不同程度的降低，而且HTST處理的蘋果汁在貯藏期間內(nèi)pH值變化幅度最小，與本試驗結(jié)果一致。

試驗發(fā)現(xiàn)HTST處理蘋果汁的亮度（*值）下降，其*值與未殺菌處理的NFC蘋果汁有顯著差異，可能是由于熱處理后NFC蘋果汁中的蛋白質(zhì)變性，生成了不溶性的變性蛋白質(zhì)[30]，所以導(dǎo)致其*值低于對照樣品。與HTST處理的果汁相比，UHP處理的NFC蘋果汁*值的降低程度較小，ZHOU[31]和WANG等[32]也有類似的發(fā)現(xiàn)，他們發(fā)現(xiàn)采用高靜水壓處理的紫甘薯花蜜和高靜水壓處理的桑椹汁的顏色與未經(jīng)處理的果汁沒有顯著差別。但貯藏期HTST處理的NFC蘋果汁*值的降幅低于UHP處理，可能是由于HTST殺滅了果汁中的過氧化物酶和多酚氧化酶等的活性，阻止了酶促褐變的發(fā)生，減緩了果汁的變色。LIU等[33]也發(fā)現(xiàn)UHP處理的黃瓜汁的*值在儲存20 d期間趨于降低，表明果汁色澤有所減弱。本試驗兩種處理后NFC蘋果汁的*和*值降低，其原因可能是由于HTST和UHP處理使細(xì)胞被裂解，色素分子逐步向外擴散滲漏到細(xì)胞間隙，使*和*值下降；Cao等[14]報道了混濁草莓汁的*、*和*值在儲存4個月期間趨于減少，這可能是由于非酶促反應(yīng)，如氨基和還原糖之間的美拉德反應(yīng)和抗壞血酸的降解所造成的。當(dāng)然，多酚氧化酶和過氧化氫酶殘留活性引起的酚類化合物的酶促褐變也會使*值降低。HUANG等[34]也獲得了類似的結(jié)果，HTST處理的杏花蜜中的多酚氧化酶和過氧化氫酶完全失活，酶促褐變受到抑制。

3.2 不同殺菌工藝對NFC蘋果汁抗氧化活性、酶活性、多酚的影響

在本試驗過程中發(fā)現(xiàn)，HTST處理的NFC蘋果汁在貯藏過程中抗氧化活性的損失低于UHP處理的蘋果汁，這可能是HTST處理的高溫降低了NFC蘋果汁中氧氣的溶解量；同時UHP與HTST處理的蘋果汁中多酚和抗壞血酸的降解[35]也是抗氧化活性降低的重要因素。PATRAS等[36]通過研究得到了相同的結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)熱殺菌處理（70℃/2 min）胡蘿卜泥的抗氧化活性高于未殺菌處理和超高壓（400 MPa/15 min/ 20℃）處理的樣品。本試驗中由于HTST處理的NFC蘋果汁的酶被完全鈍化，因此其抗氧化活性的降解主要是貯藏過程中自身的有氧降解和無氧降解造成的，在蘋果汁貯藏期最開始，包裝瓶中可能殘留的氧氣導(dǎo)致了有氧降解，當(dāng)果汁中的氧氣完全消耗完或低至某一濃度時，在酸性物質(zhì)的催化下就會發(fā)生無氧降解，且有氧降解的速率遠(yuǎn)高于無氧降解速率。殺菌工藝對蘋果汁酶活性的影響與他人[34]研究結(jié)論一致，HTST處理可使PPO和POD完全失活，UHP處理則有殘留活性，從而引起一些酶促褐變反應(yīng)發(fā)生。UHP處理后NFC蘋果汁酶活性的變化，可能是由于多酚氧化酶和過氧化氫酶不僅具有相當(dāng)高的耐高壓性，而且在壓力400 MPa的處理條件下，試驗中使用的VC和氯化鹽（CaCl2）組合護色劑對果汁中的PPO和POD有激活作用，在一定程度上提高了酶的活性，從而促進多酚氧化酶與酚類化合物的反應(yīng)，產(chǎn)生了酚類化合物的降解；其次是組合護色劑對酶的活力中心的結(jié)構(gòu)有較大影響[37]，這些酶的二級和三級結(jié)構(gòu)的變化以及UHP處理后NFC蘋果汁中酶的提取率增加也會引起酶活性提高，因為酶的構(gòu)象變化可通過改變其底物特異性和功能來增加或降低酶活性[38]。不同殺菌工藝對NFC蘋果汁多酚的影響試驗結(jié)果與KRYSTIAN等[15]的報道基本一致，超高壓力是多酚降解的主要原因；GLISZYNSKA -SWIGLO等[39]發(fā)現(xiàn)通過脈沖電場處理番茄汁后，在4℃下貯存56 d過程中，綠原酸、蘆丁和槲皮素含量均下降，咖啡酸濃度略有增加；在室溫下儲存11個月的商品蘋果汁中對香豆酸、阿魏酸、槲皮素和山奈酚的含量沒有顯著變化，而其他單酚物質(zhì)的含量下降，所有這些變化最終導(dǎo)致商業(yè)蘋果汁中總多酚含量的減少。

3.3 不同殺菌工藝對NFC蘋果汁香氣成分的影響

香氣是果汁產(chǎn)品可接受度的重要指標(biāo)，而殺菌工藝對NFC蘋果汁香氣成分的影響比較大。酯類和醛類是果汁中重要的風(fēng)味成分，本試驗保留了蘋果揮發(fā)物中的18種關(guān)鍵香氣活性物質(zhì)，包括乙酸丙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸丁酯、己酸乙酯、乙酸己酯、丁酸己酯，甲酸異戊酯、己醛、乙醛、（E）-2-己烯醛、1-丁醇、1-己醇、2-甲基-1-丁醇、乙酸戊酯、丁酸丁酯、2-甲基丁酸丁酯和2-甲基丁酸己酯；這與YI等[40]研究結(jié)果相似。香氣閾值最高的3種物質(zhì)是乙酸己酯、己醛和2-甲基乙基丁酸酯，香氣閾值分別為0.002、0.005和0.00013 mg?L-1，是蘋果汁中最重要的氣味來源[41]。HTST處理后，NFC蘋果汁中18種特征香味物質(zhì)總的保留率為52%，而UHP處理18種關(guān)鍵香氣物質(zhì)含量均有所增加，所以UHP處理能更好地保留NFC蘋果汁的果香。KAKIUCHI等[42]也發(fā)現(xiàn)熱殺菌后的蘋果汁中鑒定出39種揮發(fā)性化合物，特征芳香物質(zhì)含量顯著降低。但ZHAO等[43]的研究不同，他們發(fā)現(xiàn)在超濾和超高壓協(xié)同處理后的新鮮蘋果汁中7種主要的揮發(fā)性芳香族化合物無明顯變化。

3.4 不同殺菌工藝對NFC蘋果汁微生物的影響

本試驗HTST、UHP處理的NFC蘋果汁9/4周貯藏期均能保證其微生物安全性。LANDL等[44]報道通過超高壓（400 MPa/5 min/20℃）處理和巴氏滅菌（75℃/10 min）的Granny Smith蘋果醬的菌落總數(shù)和霉菌酵母的微生物計數(shù)均低于檢測限，可保質(zhì)21 d；PATTERSON等[45]也發(fā)現(xiàn)500 MPa和600 MPa（1 min/ 20℃）高壓處理下，胡蘿卜汁在4℃下儲存22 d，微生物的生長非常低。已有研究顯示UHP殺菌有局限性，其壓力、時間等條件對微生物生長影響較大，果汁不能長期貯藏的原因是UHP對某些孢子致死效果相對較差，需要進一步探討UHP與HTST等協(xié)同殺菌技術(shù)條件，發(fā)揮非熱殺菌的優(yōu)勢。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)高溫短時殺菌（HTST、98℃、50 s）和超高壓殺菌（UHP、400 MPa、15 min）兩種處理的非濃縮還原蘋果汁貯藏期有相似的理化穩(wěn)定性、感官品質(zhì)和抗氧化能力，但與對照相比，HTST處理的NFC蘋果汁在儲存期間具有更好的顏色穩(wěn)定性；UHP處理不能完全使NFC蘋果汁中的酶滅活，多酚氧化酶和過氧化物酶殘留活性高于HTST處理，從而誘導(dǎo)更多的酶促褐變過程與酚類化合物降解，HTST處理則可最大限度地減少顏色損失和酶促褐變。冷藏期間，HTST處理的NFC蘋果汁中的香氣成分含量比UPP處理變化顯著，而UHP處理顯著降低了NFC蘋果汁中總酚類物質(zhì)（127.68 μg?mL-1）的含量，且HTST和HPP處理后表兒茶素發(fā)生顯著降解。HTST和UHP處理完全滅活細(xì)菌、大腸桿菌、酵母和霉菌，但在儲存4、9周后，菌落總數(shù)顯著升高（分別升高89.15%、58.65%），而大腸桿菌、霉菌/酵母沒有顯著的生長。因此，在相同的儲存時間下，HTST處理的NFC蘋果汁的整體質(zhì)量特性優(yōu)于UHP處理；相同的品質(zhì)下，HTST處理后NFC蘋果汁的保質(zhì)期長于UHP。

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Effect of Ultra-high Pressure and High Temperature Short-time Sterilization on the Quality of NFC Apple Juice During Storage

DENG Hong1,2,3, LEI JiaLei1, YANG TianGe1, LIU MinHao1, MENG YongHong1,2,3, GUO YuRong1,2,3, XUE Jia1,2,3

(1College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119;2National Research & Development Center of Apple Processing Technology, Xi’an 710119;3Engineering Research Center of High Value Utilization of Western China Fruit Resources, Ministry of Education, Xi’an 710119)

【】 In order to provide an experimental basis for regulating the shelf life of not from concentrate (NFC) juice products in Chinese market and formulating standard of NFC juice products in China, the quality changes of NFC apple juice treated by different sterilization methods (e.g., high temperature short-time (HTST) and Ultra-high pressure (UHP)) during storage periods were compared. 【】 NFC apple juice was prepared by using Fuji apple as raw material and treated by HTST at 98℃ for 50 s and UHP at 400 MPa for 15 min, respectively, before refrigerated at 4℃. Then the changes of microbial, physical and chemical indicators, polyphenols, enzymes (polyphenol oxidase and peroxidase) activity, antioxidant activity and aroma components were studied using various methods (e.g., microbial and chemical methods, principal component analysis (PCA), instrumental analysis methods of HPLC, and GC-MS). 【】The sterilization rates of total bacteria,, mold and yeast in NFC apple juice were 100% through HTST and UHP treatment, however, the total number of colonies increased significantly (89.15%, 58.65%) at the 10thand5thweek of storage, respectively. No obvious proliferation of, mold and yeast was observed. The microbial communities of NFC apple juice treated by HTST and UHP during storage were of no significant changes, but the increases of dominant bacteria were different. The TSS, pH, TA, and the sensory quality (storage for 4 and 8 weeks) of NFC apple juices treated by HTST and UHP did not change significantly, but not the total color significantly (＜0.05). During the storage period, the content of epicatechin in NFC apple juice treated by HTST and UHP decreased by 33% and 53%, respectively. The total antioxidant capacity of FRAP, scavenging rate of DPPH free radical were kept at 76%, 73%, and 77%, 76%, respectively. PPO and POD of NFC apple juice were completely inactivated after HTST treatment, but the enzymes activity (PPO and POD) in samples processed by UHP showed a trend of first increasing and then decreasing. The polyphenol content and antioxidant activity of HTST treated NFC apple juice were significantly higher than those of UHP treated samples. The total retention rate of 18 characteristic aroma substances in HTST treated NFC apple juice was 52%, but the aroma components remained stable during storage. In contrast, the aroma content of UHP treated NFC apple juice (57.75 mg/100 mL) was close to the control sample (57.17 mg/100 mL), but the aroma components significantly changed and reduced by 26.13% during storage. 【】NFC apple juice with HTST and UHP sterilization could maintain the commercial quality stored at 4℃ for 9 and 4 weeks, respectively, but the shelf life of HTST treated NFC apple juice was longer than that treated by UHP.

NFC apple juice; ultra-high-pressure treatment; high-temperature short-time sterilization; quality; storage period

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.21.018

2019-04-29；

2019-09-03

國家重點研發(fā)計劃（2017YFD0400700）、農(nóng)業(yè)部蘋果產(chǎn)業(yè)體系項目（CARS-28）

鄧紅，Tel：029-85310517；E-mail：hongden@snnu.edu.cn。通信作者孟永宏，Tel：029-85310517；E-mail：mengyonghong@snnu.edu.cn。通信作者薛佳，Tel：029-85310517；E-mail：cathyxue0727@snnu.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）