梁穎博，李澤，邱德文，曾洪梅，李廣悅，楊秀芬

本生煙響應(yīng)蛋白激發(fā)子PevD1的差異表達(dá)基因鑒定與分析

梁穎博，李澤，邱德文，曾洪梅，李廣悅，楊秀芬

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

【】通過(guò)RNA-Seq篩選本生煙（）響應(yīng)大麗輪枝菌（）蛋白激發(fā)子PevD1的差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG），分析PevD1誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性的潛在分子機(jī)制。用10 μmol·L-1的PevD1蛋白液滲入4周齡的本生煙葉片，分別在處理后6、12和24 h取樣提取RNA，構(gòu)建mRNA文庫(kù)后采用BGISEQ-500平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。篩選各時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG分析；重點(diǎn)分析與誘導(dǎo)抗病相關(guān)的富含亮氨酸重復(fù)序列類受體蛋白激酶（leucine-rich repeats RLKs，LRR-RLKs）、轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）以及病程相關(guān)蛋白（pathogenesis related protein，PR蛋白）家族差異表達(dá)基因；采用qRT-PCR對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行定量驗(yàn)證。GO功能富集以及KEGG通路富集分析表明，PevD1誘導(dǎo)6 h后的差異表達(dá)基因主要與細(xì)胞識(shí)別、光合作用、光收割等功能相關(guān)，顯著富集在光合作用-天線蛋白通路、萜類化合物合成通路、黃酮和黃酮醇等次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)通路中；12 h和24 h的差異表達(dá)基因主要與細(xì)胞識(shí)別和胞內(nèi)激酶等生物學(xué)功能相關(guān)，顯著富集在植物-病原互作通路、倍半萜和三萜生物合成通路、黃酮和黃酮醇生物合成通路、亞麻酸代謝等次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)通路中。與光合作用相關(guān)的差異表達(dá)基因主要呈下調(diào)趨勢(shì)，與萜類、黃酮類等抗病相關(guān)次生代謝產(chǎn)物合成通路相關(guān)的差異表達(dá)基因主要呈上調(diào)趨勢(shì)。PevD1誘導(dǎo)后大量的LRR-RLKs、TF以及PR蛋白家族基因顯著上調(diào)表達(dá)，這些基因與激發(fā)子識(shí)別、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和抗病性相關(guān)。經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證后，所檢測(cè)基因的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。PevD1誘導(dǎo)本生煙中大量基因轉(zhuǎn)錄重排，大量LRR-RLKs、TF和PR蛋白家族基因上調(diào)表達(dá)，激活了植物免疫系統(tǒng)，使植物產(chǎn)生抗病性。研究結(jié)果可為今后深入探討PevD1誘導(dǎo)植物免疫的機(jī)理提供依據(jù)。

本生煙；大麗輪枝菌；蛋白激發(fā)子PevD1；RNA-Seq；LRR-RLKs；轉(zhuǎn)錄因子；PR蛋白

0 引言

【研究意義】植物為了抵御環(huán)境中各種不良因素的危害形成了復(fù)雜有序的免疫調(diào)控機(jī)制。研究植物響應(yīng)脅迫的分子機(jī)理，不僅能為農(nóng)作物抗病育種提供有價(jià)值的基因資源，同時(shí)可為研究植物誘導(dǎo)性免疫反應(yīng)的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。采用模式植物本生煙（）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，比較蛋白激發(fā)子PevD1處理前后差異表達(dá)基因（DEG）的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況，并對(duì)這些差異基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，可為闡述PevD1激發(fā)植物免疫的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】大麗輪枝菌（）能引起多種植物的黃萎病，寄主植物超過(guò)400種，常年對(duì)棉花、馬鈴薯、茄子、番茄、辣椒、甘藍(lán)、黃瓜和西瓜等造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前在生產(chǎn)上主要依賴化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，缺乏有效的抗/耐病品種[1-3]。利用植物自身免疫系統(tǒng)減輕病害發(fā)生是未來(lái)植物病害綠色防控的重要途徑之一[4]。PevD1是筆者實(shí)驗(yàn)室分離自大麗輪枝菌的蛋白激發(fā)子，能夠誘導(dǎo)植物葉片產(chǎn)生超敏反應(yīng)（HR），激發(fā)植物早期防御反應(yīng)（NO、H2O2，細(xì)胞外培養(yǎng)基的堿化），引起胼胝質(zhì)、酚類化合物及木質(zhì)素的積累，提高植物葉片中的過(guò)氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）等防御相關(guān)酶的活性，誘導(dǎo)棉花和煙草系統(tǒng)抗病性[5-7]。近期研究表明，在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)包含信號(hào)肽的PevD1重組蛋白能夠引起強(qiáng)烈的細(xì)胞壞死反應(yīng)，相比之下，切除信號(hào)肽的PevD1重組蛋白引起的細(xì)胞壞死反應(yīng)則明顯減弱[8]，說(shuō)明植物細(xì)胞對(duì)PevD1的識(shí)別過(guò)程可能主要位于細(xì)胞間質(zhì)中，PevD1很可能作為真菌PAMP激發(fā)植物的PTI反應(yīng)，但具體的作用機(jī)制尚不清楚?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】PevD1誘導(dǎo)植物抗病性的過(guò)程會(huì)引起大量抗病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，近年來(lái)飛速發(fā)展的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)為全面研究植物免疫機(jī)制提供了豐富的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。本研究以本生煙為材料，篩選PevD1誘導(dǎo)本生煙前后的差異表達(dá)基因，分析PevD1誘導(dǎo)本生煙抗病性的潛在機(jī)制。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)RNA-Seq技術(shù)篩選本生煙中響應(yīng)PevD1的差異表達(dá)基因并分析這些基因的主要富集途徑，綜合分析PevD1誘導(dǎo)本生煙的抗病機(jī)制。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年5月至2019年3月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所蛋白農(nóng)藥組完成。

1.1 材料

重組蛋白激發(fā)子PevD1表達(dá)與純化的方法參照文獻(xiàn)[8]；本生煙種子由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 樣品準(zhǔn)備 將純化的激發(fā)子PevD1蛋白液稀釋成10 μmol·L-1后，取4周齡的本生煙植株，分別用無(wú)針的注射器在本生煙葉片背部滲透注射，每個(gè)葉片注射20 μL，以等量的Tris-HCl（pH 8.0）為對(duì)照。分別在處理后6、12、24 h對(duì)葉片取樣，液氮速凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 BGISEQ-500平臺(tái)測(cè)序 提取上述樣品總RNA，質(zhì)檢合格后采用華大BGISEQ-500平臺(tái)進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序。

1.2.3 差異表達(dá)基因的篩選 使用DEGseq算法進(jìn)行差異表達(dá)基因檢測(cè)，DEGseq方法基于泊松分布[9]。為了提高準(zhǔn)確性，將差異倍數(shù)為兩倍以上（fold change，F(xiàn)C≥2）并且Q-value≤0.001（adjusted-value≤0.001）的基因篩選為顯著差異表達(dá)基因。

1.2.4 差異表達(dá)基因GO及KEGG富集分析 根據(jù)官方Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)分類（http://www.geneontology. org/），使用R軟件中的phyper函數(shù)將差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析。根據(jù)KEGG注釋結(jié)果以及官方分類，使用R軟件中的phyper函數(shù)將差異表達(dá)基因進(jìn)行生物通路富集分析。

1.2.5 差異表達(dá)基因的qRT-PCR檢測(cè) 參考茄科數(shù)據(jù)庫(kù)（https://solgenomics.net/）的目的基因序列，使用Beacon Designer 8.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。以上述樣品提取的RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，以為內(nèi)參基因，采用熒光定量試劑盒（北京全式金）特異性擴(kuò)增各個(gè)目的基因。參照2-ΔΔCt計(jì)算方法，分別對(duì)mRNA進(jìn)行相對(duì)定量分析[10]。

表1 待測(cè)差異表達(dá)基因的定量驗(yàn)證引物

2 結(jié)果

2.1 PevD1誘導(dǎo)本生煙的差異表達(dá)基因篩選

為了明確PevD1的誘導(dǎo)對(duì)本生煙基因轉(zhuǎn)錄的影響，在差異表達(dá)倍數(shù)FC≥2及Q-value≤0.001的條件下對(duì)PevD1處理組與對(duì)照組的差異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選。PevD1處理6 h時(shí)，共篩選到4 053個(gè)差異表達(dá)基因，其中2 911個(gè)上調(diào)，1 142個(gè)下調(diào)；PevD1處理12 h時(shí)，共篩選到5 180個(gè)差異表達(dá)基因，其中4 183個(gè)上調(diào)，997個(gè)下調(diào)；PevD1處理24 h時(shí)，共篩選到4 202個(gè)差異表達(dá)基因，其中3 082個(gè)上調(diào)，1 120個(gè)下調(diào)。這些差異表達(dá)基因反映了本生煙受PevD1誘導(dǎo)后產(chǎn)生的應(yīng)答反應(yīng)，有助于分析PevD1誘導(dǎo)本生煙產(chǎn)生抗性的機(jī)制。

2.2 差異表達(dá)基因的功能富集分析

對(duì)上述篩選到的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析。結(jié)果表明，PevD1誘導(dǎo)6—12 h后，差異表達(dá)基因主要與碳水化合物的結(jié)合活性、蛋白激酶活性、光合作用以及細(xì)胞間的識(shí)別作用相關(guān)（圖1-A、1-B）；PevD1誘導(dǎo)24 h后，差異表達(dá)基因主要與細(xì)胞識(shí)別及細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程相關(guān)（圖1-C）。

KEGG通路富集分析顯示，PevD1誘導(dǎo)6 h后，差異表達(dá)基因主要富集在植物-病原互作和光合作用-天線蛋白通路（圖2-A）；PevD1誘導(dǎo)12—24 h后，差異表達(dá)基因主要富集在植物-病原互作通路、MAPK信號(hào)通路、苯丙素生物合成和萜類化合物合成通路（圖2-B、2-C）。在以上顯著富集的通路中，光合作用-天線蛋白通路相關(guān)的差異表達(dá)基因主要呈下調(diào)趨勢(shì)，而植物-病原互作、MAPK信號(hào)通路、苯丙素生物合成和萜類化合物合成通路相關(guān)的差異表達(dá)基因主要呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。

A、B、C分別代表差異表達(dá)基因在6、12、24 h各時(shí)間點(diǎn)的GO富集結(jié)果，結(jié)果僅顯示Q-value值最小的前20個(gè)富集條目。紅圈標(biāo)注的通路為Rich factor＞0.2和Q-value＜0.05的閾值下顯著富集的條目

圖2 各時(shí)間點(diǎn)差異表達(dá)基因的KEGG富集

2.3 LRR-RLKs分析

植物免疫識(shí)別系統(tǒng)是激活植物免疫反應(yīng)的開關(guān)，通常包括位于細(xì)胞表面的膜識(shí)別受體PRRs（pattern- recognition receptors）和位于細(xì)胞質(zhì)的胞內(nèi)識(shí)別受體[11-12]。本研究根據(jù)PRG（plant resistance gene）數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)序列比對(duì)預(yù)測(cè)的方法，對(duì)每組差異表達(dá)基因進(jìn)行抗病基因分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因中有大量的RLP和RLK被誘導(dǎo)表達(dá)（圖3），說(shuō)明這些基因有可能參與了植物的早期識(shí)別反應(yīng)。大量研究表明，LRR-RLKs（leucine-rich repeat receptor-like protein kinases）是植物受體激酶中研究較多的一類家族。進(jìn)一步通過(guò)在線Blast的方法獲取差異表達(dá)基因中的LRR-RLKs。結(jié)果表明，在所有的差異表達(dá)基因中共鑒定到109個(gè)LRR-RLKs，其中有27個(gè)在檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)內(nèi)有極顯著變化（FC≥4）（表2）。鑒定這些基因能夠更好地揭示植物對(duì)蛋白激發(fā)子PevD1的識(shí)別機(jī)制。

2.4 轉(zhuǎn)錄因子分析

轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物抗病性的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，它們通過(guò)與啟動(dòng)子上特定的DNA序列結(jié)合來(lái)激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。本研究對(duì)差異表達(dá)基因所屬的轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行了分類統(tǒng)計(jì)。結(jié)果如圖4所示，PevD1誘導(dǎo)后的各時(shí)間點(diǎn)均檢測(cè)到大量差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，其中以AP2-EREBP、WRKY、MYB和NAC為主，并且這些轉(zhuǎn)錄因子主要呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)。

表2 差異表達(dá)基因中LRR-RLKs的篩選

圖3 PevD1處理后各時(shí)間點(diǎn)差異表達(dá)基因注釋到PRG的數(shù)目

圖4 轉(zhuǎn)錄因子分析

2.5 病程相關(guān)蛋白家族差異表達(dá)基因分析

病程相關(guān)蛋白（pathogenesis related protein，PR蛋白）的誘導(dǎo)和積累是植物產(chǎn)生防御反應(yīng)的另一個(gè)重要特征，同時(shí)也是植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性（systemic acquired resistance，SAR）的重要組成部分?；跓煵葜幸延邢嚓P(guān)報(bào)道的PR家族基因序列，通過(guò)在線BLAST的方法從差異表達(dá)基因中共鑒定到了29個(gè)PR基因，包括、、、、、、、和，并且發(fā)現(xiàn)這些PR基因呈現(xiàn)顯著性上調(diào)趨勢(shì)（表3）。

表3 PevD1誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白家族差異表達(dá)基因的篩選

2.6 差異表達(dá)基因的RT-qPCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證本研究中轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性，選取12個(gè)與上述分析結(jié)果密切相關(guān)的基因用于qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明這些基因表達(dá)模式與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致（圖5）。

圖5 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

3 討論

PevD1是從大麗輪枝菌發(fā)酵液中分離得到的蛋白激發(fā)子。前期研究表明，重組表達(dá)的PevD1蛋白能夠誘導(dǎo)煙草和棉花產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，并能誘導(dǎo)NO和H2O2的積累、細(xì)胞外培養(yǎng)基的堿化、胼胝質(zhì)的沉積、酚類化合物及木質(zhì)素的合成等[5-7]，但對(duì)于PevD1誘導(dǎo)植物產(chǎn)生免疫反應(yīng)的作用機(jī)理仍有待探索。目前，RNA-Seq技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于植物抗病機(jī)制的相關(guān)研究中，該技術(shù)可為研究提供大量的基因表達(dá)信息，從基因轉(zhuǎn)錄的差異入手，有助于更好地挖掘抗病相關(guān)的基因信息以及相關(guān)的代謝通路，從而更好地理解植物免疫反應(yīng)的相關(guān)機(jī)理。

對(duì)本生煙響應(yīng)PevD1誘導(dǎo)后的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，其結(jié)果體現(xiàn)了本生煙受PevD1誘導(dǎo)后的免疫應(yīng)答規(guī)律。本研究中，光合作用-天線蛋白通路相關(guān)的差異表達(dá)基因主要呈下調(diào)趨勢(shì)，而植物-病原互作、MAPK信號(hào)通路、苯丙素生物合成和萜類化合物合成通路相關(guān)的差異表達(dá)基因主要呈上調(diào)趨勢(shì)。由于植物免疫系統(tǒng)的啟動(dòng)涉及到大量基因的轉(zhuǎn)錄重編程過(guò)程，該過(guò)程需要植物耗費(fèi)大量能量。已有研究表明，植物在產(chǎn)生免疫反應(yīng)的過(guò)程中，能夠通過(guò)MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)主動(dòng)抑制光合作用從而使免疫反應(yīng)更為高效[13]。因此推測(cè)，在PevD1誘導(dǎo)初期，植物首先啟動(dòng)與細(xì)胞識(shí)別相關(guān)的基因，調(diào)整能量代謝，使得大量與光合作用相關(guān)的基因下調(diào)表達(dá)。隨著植物免疫應(yīng)答反應(yīng)的持續(xù)，植物與病原互作相關(guān)通路的基因被逐步激活，進(jìn)而引起抗病相關(guān)的次生代謝產(chǎn)物的積累，全面啟動(dòng)免疫應(yīng)答反應(yīng)。

LRR-RLKs在植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答的過(guò)程中起著重要的作用。擬南芥的受體類激酶FLS2能夠識(shí)別細(xì)菌的鞭毛蛋白Flg22，進(jìn)而與BAK1形成復(fù)合體共同激活下游的植物免疫信號(hào)[14-15]；SOBIR1和BAK1都能夠與受體類蛋白（LRR-RLPs）形成復(fù)合體，從而激活下游的植物免疫信號(hào)[16]；擬南芥中的細(xì)菌延伸因子（EF-Tu）受體EFR能夠特異性的識(shí)別EF-Tu，從而快速激活植物的PTI反應(yīng)[17]。本研究中有27個(gè)LRR-RLKs基因被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，表明LRR-RLKs在PevD1對(duì)本生煙免疫系統(tǒng)的激活中起到了極其重要的作用。

植物中存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，相關(guān)報(bào)道表明AP2-EREBP（APETALA2/ethylene-responsive element binding protein）、WRKY、MYB、NAC家族的轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病防御反應(yīng)的調(diào)控中起著重要的作用[18]。AP2-EREBP家族的轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育以及脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[19]；擬南芥中的APD1作為AP2-EREBP家族的成員，能夠正調(diào)節(jié)水楊酸（SA）的合成，在防御細(xì)菌性病原物的過(guò)程中起著重要作用[20]；OsERF101是水稻生殖和營(yíng)養(yǎng)階段對(duì)干旱脅迫產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)的重要正調(diào)控因子[21]；WRKY家族的轉(zhuǎn)錄因子能夠與多種植物防御反應(yīng)基因啟動(dòng)子序列中的W-box順式作用元件相結(jié)合，從而啟動(dòng)相應(yīng)抗病基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[22]；AtWRKY33能夠正調(diào)控?cái)M南芥對(duì)壞死型真菌的免疫反應(yīng)[23]；OsWRKY53對(duì)水稻的基礎(chǔ)免疫起正調(diào)控作用，在水稻中過(guò)表達(dá)能夠提高水稻對(duì)稻瘟病的抗性[24]；MYB家族轉(zhuǎn)錄因子在苯丙烷類衍生物的合成代謝中發(fā)揮著重要的作用[25-26]；在煙草中過(guò)表達(dá)能夠檢測(cè)到煙草葉片中黃酮含量增加，但總木質(zhì)素水平降低，表明的過(guò)表達(dá)可能導(dǎo)致代謝通量從木質(zhì)素合成途徑定向到類黃酮合成途徑[27]；NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)生物和非生物脅迫中充當(dāng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)[28]，油菜中的NAC87能夠調(diào)控細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生并介導(dǎo)細(xì)胞的壞死反應(yīng)，同時(shí)伴隨著細(xì)胞形態(tài)學(xué)水平的典型變化[29]；在煙草中過(guò)表達(dá)番茄的能夠促進(jìn)干旱和鹽脅迫下的根生長(zhǎng)和發(fā)育，同時(shí)能夠提高轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)細(xì)菌病原體的抗性[30]。本研究中，筆者篩選到了大量差異表達(dá)的AP2-EREBP、WRKY、MYB、NAC家族的轉(zhuǎn)錄因子，表明這些轉(zhuǎn)錄因子在一定程度上參與了PevD1誘導(dǎo)植物免疫的過(guò)程。

PR蛋白的產(chǎn)生和積累是植物產(chǎn)生免疫反應(yīng)的一個(gè)重要特征，也是植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）的重要組成部分[31]。在目前的研究中，PR蛋白可分為17個(gè)家族，其中PR-1、PR-2、PR-3、PR-4、PR-5、PR-10、PR-11、PR-17被報(bào)道與植物的SAR相關(guān)[32-37]。本研究基于在線Blast以及序列比對(duì)的方法鑒定到了29個(gè)PR基因，它們的表達(dá)水平在PevD1誘導(dǎo)后被顯著上調(diào)，推測(cè)這些PR蛋白可能在PevD1誘導(dǎo)本生煙的防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。

4 結(jié)論

本生煙經(jīng)PevD1誘導(dǎo)后，分別在6、12、24 h檢測(cè)到了4 053、5 180和4 202個(gè)差異表達(dá)基因。對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)光合作用-天線蛋白通路相關(guān)的差異表達(dá)基因主要呈下調(diào)趨勢(shì)，而植物-病原互作通路、MAPK信號(hào)通路、苯丙素生物合成和萜類化合物合成通路相關(guān)的差異表達(dá)基因主要呈上調(diào)趨勢(shì)，推測(cè)PevD1誘導(dǎo)本生煙免疫反應(yīng)的初期可能通過(guò)降低光合作用以應(yīng)對(duì)脅迫，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，與植物免疫相關(guān)的大量基因上調(diào)表達(dá)，免疫系統(tǒng)激活。進(jìn)一步對(duì)LRR-RLKs、轉(zhuǎn)錄因子和PR蛋白家族的基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些與免疫識(shí)別、信號(hào)傳遞和抗性相關(guān)的基因PevD1誘導(dǎo)后主要呈上調(diào)趨勢(shì)，推測(cè)本生煙通過(guò)這些防御相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活來(lái)響應(yīng)PevD1的刺激，最終產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。

[1] BARBARA D J, CLEWES E. Plant pathogenicspecies: How many of them are there?, 2003, 4(4): 297-305.

[2] DURESSA D, ANCHIETA A, CHEN D, KLIMES A, GARCIA- PEDRAJAS M D, DOBINSON K F, KLOSTERMAN S J. RNA-seq analyses of gene expression in the microsclerotia of., 2013, 14: 607.

[3] CARROLL C L, CARTER C A, GOODHUE R E, LAWELL C c l, SUBBARAO K V. A review of control options and externalities forwilts.,2018, 108(2): 160-171.

[4] 邱德文. 我國(guó)植物病害生物防治的現(xiàn)狀及發(fā)展策略. 植物保護(hù),2010, 36(4): 15-18.

QIU D W. Current status and development strategy for biological control of plant diseases in China., 2010, 36(4): 15-18. (in Chinese)

[5] WANG B, YANG X, ZENG H, LIU H, ZHOU T, TAN B, YUAN J, GUO L, QIU D. The purification and characterization of a novel hypersensitive-like response-inducing elicitor fromthat induces resistance responses in tobacco.,2012, 93(1): 191-201.

[6] 王炳楠, 楊秀芬, 曾洪梅, 邱德文. 大麗輪枝菌分泌蛋白激發(fā)子的分離純化及生物功能研究. 生物技術(shù)通報(bào),2011(11): 166-171.

WANG B N, YANG X F, ZENG H M, QIU D W. Purification and its bioassay of secreted elicitor protein from., 2011(11): 166-171 (in Chinese)

[7] 卜冰武, 邱德文, 曾洪梅, 郭立華, 袁京京, 楊秀芬. 大麗輪枝菌蛋白激發(fā)子PevD1誘導(dǎo)棉花抗病性及作用機(jī)理. 植物病理學(xué)報(bào),2014, 44(3): 254-264.

BU B W, QIU D W, ZENG H M, GUO L H, YUAN J J, YANG X F. Induced resistance and mechanism of protein elicitor PevD1 againstin cotton., 2014, 44(3): 254-264. (in Chinese)

[8] ZHANG Y, GAO Y, LIANG Y, DONG Y, YANG X, QIU D.PevD1, an Alt a 1-like protein, targets cotton PR5-like protein and promotes fungal infection., 2019, 70(2): 613-626.

[9] WANG L K, FENG Z X, WANG X, WANG X W, ZHANG X G. DEGseq: an R package for identifying differentially expressed genes from RNA-seq data.,2010, 26(1): 136-138.

[10] SCHMITTGEN T D, LEE E J, JIANG J. High-throughput real-time PCR.,2008, 429: 89-98.

[11] SAIJO Y, LOO E P, YASUDA S. Pattern recognition receptors and signaling in plant-microbe interactions.,2018, 93(4): 592-613.

[12] LIANG X, ZHOU J M. Receptor-like cytoplasmic kinases: Central players in plant receptor kinase-mediated signaling.,2018, 69: 267-299.

[13] SU J, YANG L, ZHU Q, WU H, HE Y, LIU Y, XU J, JIANG D, ZHANG S. Active photosynthetic inhibition mediated by MPK3/MPK6 is critical to effector-triggered immunity., 2018, 16(5): e2004122.

[14] Chinchilla D, Zipfel C, Robatzek S, Kemmerling B,Nürnberger T, Jones J D, Felix G, Boller T. A flagellin- induced complex of the receptor FLS2 and BAK1 initiates plant defence.,2007, 448(7152): 497-500.

[15] Schulze B, Mentzel T, Jehle A K, Mueller K, Beeler S, Boller T, Felix G, Chinchilla D. Rapid heteromerization and phosphorylation of ligand-activated plant transmembrane receptors and their associated kinase BAK1.,2010, 285(13): 9444-9451.

[16] LIEBRAND T W, VAN DEN BURG H A, JOOSTEN M H. Two for all: receptor-associated kinases SOBIR1 and BAK1.,2014, 19(2): 123-132.

[17] Zipfel C, Kunze G, Chinchilla D, Caniard A, Jones J D, Boller T, Felix G. Perception of the bacterial PAMP EF-Tu by the receptor EFR restricts-mediated transformation.,2006, 125(4): 749-760.

[18] NG D W K, ABEYSINGHE J K, KAMALI M. Regulating the regulators: The control of transcription factors in plant defense signaling.,2018, 19(12): 3737.

[19] DIETZ K J, VOGEL M O, VIEHHAUSER A. AP2/EREBP transcription factors are part of gene regulatory networks and integrate metabolic, hormonal and environmental signals in stress acclimation and retrograde signalling.,2010, 245(1/4): 3-14.

[20] GAUTAM J K, NANDI A K. APD1, the unique member ofAP2 family influences systemic acquired resistance and ethylene-jasmonic acid signaling.,2018, 133: 92-99.

[21] JIN Y, PAN W, ZHENG X, CHENG X, LIU M, MA H, GE X., an ERF family transcription factor, regulates drought stress response in reproductive tissues.,2018, 98(1/2): 51-65.

[22] PANDEY S P, SOMSSICH I E. The role of WRKY transcription factors in plant immunity.,2009, 150(4): 1648-1655.

[23] Zheng Z, Qamar S A, Chen Z, Mengiste T.WRKY33 transcription factor is required for resistance to necrotrophic fungal pathogens.,2006, 48(4): 592-605.

[24] CHUJO T, TAKAI R, AKIMOTO-TOMIYAMA C, ANDO S, MINAMIE, NAGAMURA Y, KAKU H, SHIBUYA N, YASUDA M, NAKASHITA H, Umemura K, Okada A, Okada K, Nojiri H, Yamane H. Involvement of the elicitor-induced gene,2007, 1769(7/8): 497-505.

[25] DUBOS C, STRACKE R, GROTEWOLD E, WEISSHAAR B, MARTIN C, LEPINIEC L. MYB transcription factors in.,2010, 15(10): 573-581.

[26] LIU J, OSBOURN A, MA P. MYB transcription factors as regulators of phenylpropanoid metabolism in plants.,2015, 8(5): 689-708.

[27] MA Q H, WANG C, ZHU H H.cloned from wheat regulates lignin biosynthesis through negatively controlling the transcripts of both cinnamyl alcohol dehydrogenase and cinnamoyl-CoA reductase genes.,2011, 93(7): 1179-1186.

[28] HUANG Y, LI T, XU Z S, WANG F, XIONG A S, HUANG Y, LI T, XU Z S, WANG F, XIONG A S. Six NAC transcription factors involved in response to TYLCV infection in resistant and susceptible tomato cultivars.,2017, 120: 61-74.

[29] YAN J, TONG T, LI X, CHEN Q, DAI M, NIU F, YANG M, DEYHOLOS M K, YANG B, JIANG Y Q. A novel NAC-type transcription factor, NAC87, from oilseed rape modulates reactive oxygen species accumulation and cell death.,2018, 59(2): 290-303.

[30] WANG G, ZHANG S, MA X, WANG Y, KONG F, MENG Q. A stress-associated NAC transcription factor (SlNAC35) from tomato plays a positive role in biotic and abiotic stresses.,2016, 158(1): 45-64.

[31] VAN LOON L C, REP M, PIETERSE C M J. Significance of inducible defense-related proteins in infected plants.,2006, 44: 135-162.

[32] ANTONIW J F, RITTER C E, PIERPONT W S, VAN LOON L C. Comparison of three pathogenesis-related proteins from plants of two cultivars of tobacco infected with TMV., 1980, 47(1): 79-87.

[33] VAN LOON L C. Regulation of changes in proteins and enzymes associated with active defence against virus infection//, 1982, 37: 247-273.

[34] LAGRIMINI L M, BURKHART W, MOYER M, ROTHSTEIN S. Molecular cloning of complementary DNA encoding the lignin- forming peroxidase from tobacco: Molecular analysis and tissue- specific expression.,1987, 84(21): 7542-7546.

[35] 李瑞博, 崔秀明, 劉玉忠, 吳志剛, 林淑芳, 申業(yè), 黃璐琦. 三七病程相關(guān)蛋白1基因的克隆與表達(dá)分析. 藥學(xué)學(xué)報(bào),2014, 49(1): 124-130.

LI R B, CUI X M, LIU Y Z, WU Z G, LIN S F, SHEN Y, HUANG L Q. Cloning and expression analysis of pathogenesis-related protein 1 gene of.,2014, 49(1): 124-130. (in Chinese)

[36] MELCHERS L S, APOTHEKER-DE GROOT M, VAN DER KNAAP J A, PONSTEIN A S, SELA-BUURLAGE M B, BOL J F, CORNELISSEN B J, VAN DEN ELZEN P J, LINTHORST H J. A new class of tobacco chitinases homologous to bacterial exo-chitinases displays antifungal activity., 1994, 5(4): 469-480.

[37] OKUSHIMA Y, KOIZUMI N, KUSANO T, SANO H. Secreted proteins of tobacco cultured BY2 cells: identification of a new member of pathogenesis-related proteins.,2000, 42(3): 479-488.

Identification and Analysis of Differentially Expressed Genes Induced by Protein Elicitor PevD1 in

Liang Yingbo, Li Ze, Qiu Dewen, Zeng Hongmei, Li Guangyue, Yang Xiufen

(State Key Laboratory for Biology of Plant Disease and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)

【】The objective of this study is to screen the differentially expressed genes (DEGs) induced by protein elicitor PevD1 ofinby RNA-Seq, and to analyzethe potential mechanism of PevD1-induced disease resistance. 【】Leaves of 4-week-oldwere infiltrated with 10 μmol·L-1PevD1 solution, and samples were taken at 6, 12 and 24 h after PevD1 treatment, then RNA was extracted. The mRNAlibraries were constructed and sequenced by BGISEQ-500 platform. The DEGs at each time point were screened for GO and KEGG analysis. The leucine-rich repeat receptor-like kinases (LRR-RLKs), transcription factors (TFs) and pathogenesis-related (PR) proteins family in DEGs were analyzed, and qRT-PCR was used to verify the expression levels of relevant DEGs.【】GO functional enrichment and KEGG pathway enrichment analysis indicated that the DEGs at 6 h post infiltration (hpi) were mainlyrelated to cell recognition, photosynthesis, light-harvesting, and were significantlyenriched in photosynthesis-antenna protein pathways, terpenoid synthesis pathway, flavonoid and flavonol, and other secondary metabolite synthesis pathways. The DEGs at 12 hpi and 24 hpi were mainly associated with cell recognition and biological functions such as intracellular kinase activity, and were significantly enriched in plant-pathogen interaction pathway, sesquiterpene and triterpenoid biosynthetic pathway, flavonoid and flavonol biosynthetic pathway, linolenic acid metabolism. The unigenes in photosynthesis-antenna proteins, photosynthesis and porphyrin, chlorophyll metabolism pathway were mainly down-regulated, and the unigenes in sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis, flavone and flavonol biosynthesis, plant-pathogen interaction, phenylpropanoid biosynthesis and terpenoid backbone biosynthesis pathway were mainly up-regulated. after PevD1 induction, a large number of LRR-RLKs,TFsand PR proteins family genes weresignificantly up-regulated, which were related to elicitor recognition, gene transcriptional regulation and disease resistance. qRT-PCR analysis showed that the expression pattern of the detected DEGswas consistent with the RNA-Seq results.【】PevD1 induced a large number of gene transcriptional rearrangements in. Lots of LRR-RLKs, TFs and PR proteins family genes were up-regulated, which activated the plant immune system and conferred to plants disease resistant.These results can provide a basis for further study on the mechanism of PevD1-induced immunity in the future.

;; protein elicitor PevD1; RNA-Seq; LRR-RLKs; transcription factor; PR protein

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.21.008

2019-05-22；

2019-06-28

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFD0201101）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31772151）

梁穎博，E-mail：Lyingbo16@163.com。通信作者楊秀芬，E-mail：yangxiufen@caas.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）