王麗超，江世杰，黎先發(fā)

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010）

【研究意義】 目前我國(guó)對(duì)水冶過(guò)程中產(chǎn)生的廢棄物通常采用集中堆放在具備防滲漏措施的尾礦庫(kù)中的方式[1-2]。尾礦庫(kù)采取了一系列的保障措施來(lái)保障其安全[3]，即便如此，尾礦中的放射性核素仍會(huì)通過(guò)各種化學(xué)途徑具備溶解性，緩慢的向周邊的自然環(huán)境中釋放，給周邊生態(tài)環(huán)境和人類(lèi)健康帶來(lái)潛在的危害[4]，因此監(jiān)測(cè)及評(píng)估鈾尾礦周邊土壤的質(zhì)量具有非常重要的意義[5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】 土壤微生物作為土壤分解系統(tǒng)的主要組成部分，在生態(tài)系統(tǒng)循環(huán)中有著不可替代的重要地位[6]。土壤微生物生物量是土壤有機(jī)質(zhì)中最活躍、最敏感的部分，同時(shí)微生物生物量在維持土壤中大量酶過(guò)程和保護(hù)能量、營(yíng)養(yǎng)方面起到關(guān)鍵作用[7]?；谕寥牢⑸锛捌鋮⑴c的生化過(guò)程對(duì)污染物表現(xiàn)出的敏感性，可以采用微生物學(xué)指標(biāo)來(lái)預(yù)測(cè)土壤生態(tài)系統(tǒng)的變化特征[8]。將微生物的變化特征作為監(jiān)測(cè)土壤質(zhì)量變化、表征土壤生態(tài)系統(tǒng)群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，被人們?cè)谏鷳B(tài)學(xué)、土壤生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域廣泛接受和應(yīng)用[9-11]。另外，研究重金屬污染對(duì)土壤微生物多樣性的影響，一直以來(lái)都受到研究人員的青睞。通過(guò)研究重金屬脅迫對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的變化，以及微生物對(duì)重金屬的解毒機(jī)制，建立重金屬劑量與生物反應(yīng)的關(guān)系，為制定土壤重金屬污染閾值和修復(fù)指標(biāo)提供依據(jù)[12]。

【本研究切入點(diǎn)】 目前，國(guó)內(nèi)雖然已有關(guān)于鈾尾礦安全監(jiān)測(cè)方面的研究，但是大多數(shù)集中在鈾尾礦中核素遷移規(guī)律及遷移機(jī)理等方面的研究[13-15]，有關(guān)放射性污染對(duì)土壤微生物活性及多樣性的研究報(bào)道甚少。為此，本研究以我國(guó)某典型鈾尾礦庫(kù)中所取土壤為研究對(duì)象，使用微生物活性測(cè)定方法和Biolog-Eco技術(shù)對(duì)土壤微生物活性及群落功能多樣性進(jìn)行分析?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】 探討放射性污染劑量與微生物活性及群落功能多樣性的內(nèi)在聯(lián)系，從而為放射性污染土壤生物修復(fù)及構(gòu)建微生物土壤環(huán)境質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)土樣于2013年初采集于我國(guó)某典型尾礦庫(kù)地區(qū)。前期查閱大量環(huán)評(píng)資料及前期的研究基礎(chǔ)材料，按照放射性核素U的含量高低設(shè)置6個(gè)取樣區(qū)域。使用土樣采集器沿“S”型路線按0～15 cm土層深度取樣，土樣置于聚乙烯保鮮袋，24 h內(nèi)置于4℃冰箱保存。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，將土樣分為兩部分，分別測(cè)定微生物活性、土壤基本理化性質(zhì)、放射性核素含量等相關(guān)指標(biāo)（表1、表2）。選取遠(yuǎn)離鈾尾礦初期壩的上游土壤作為對(duì)照，設(shè)為1號(hào)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤微生物活性指標(biāo)測(cè)定 微生物基礎(chǔ)呼吸、土壤微生物量碳、氮含量測(cè)試方法參照文獻(xiàn)[16]。

1.2.2 土壤微生物群落功能多樣性測(cè)定 采用有96個(gè)孔、31種碳源、其中一組為對(duì)照的生態(tài)板（Biolog-ECO）分析微生物群落功能多樣性特征。ECO板接種液的制備參照李芳蘭等[17]的方法。先將待測(cè)土樣于25 ℃下預(yù)培養(yǎng)24 h，取等同于干重10 g土樣與90 mL 0.85 mol/L NaC1溶液混勻，250 r/min震蕩培養(yǎng)30 min，將上清液用NaC1溶液稀釋1 000倍。ECO板中各孔加樣量為150 uL，設(shè)置3個(gè)平行，25 ℃下恒溫培養(yǎng)8 d，分別在培養(yǎng)24、48、72、96、120、144、168、192 h， 波 長(zhǎng)為590 nm下讀數(shù)，ECO板使用前需預(yù)熱0.5 h。

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)Table1 Physical and chemical properties of soil samples

表2 土壤中放射性核素的含量Table2 Content of radioactive nuclides in soils

豐富度指數(shù)（S）指每孔中(Ci-R)的值大于0.25的孔數(shù)[8]，其中Ci為每個(gè)有培養(yǎng)基孔的光密度值；R為對(duì)照孔的光密度值；n為培養(yǎng)基碳源種類(lèi)，本研究中為31；Pi為(Ci -R) 的值大于0.25的孔數(shù)與整板總差的比值。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin7.5、SPSS20.0軟件進(jìn)行處理及作圖和統(tǒng)計(jì)分析[18-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同放射性污染土壤微生物活性變化 大量研究通過(guò)土壤微生物量、基礎(chǔ)呼吸、代謝熵以及微生物熵來(lái)解釋土壤污染程度，本試驗(yàn)的土壤微生物活性分析結(jié)果（表3）顯示，各指標(biāo)隨污染程度的變化存在一定程度上的差異。其中，微生物量碳（MBC）并不是簡(jiǎn)單隨著污染程度的增加而逐漸降低，相反3、5、6號(hào)土樣的微生物量碳（MBC）竟高于對(duì)照；各土樣的微生物量氮（MBN）相比對(duì)照下降了16.09%～32.90%，除3號(hào)土樣外，其他各取樣點(diǎn)的基礎(chǔ)呼吸和代謝熵相比對(duì)照分別下降16.49%～32.90%、2.01%～69.12%；各取樣點(diǎn)的微生物熵分別是對(duì)照的2.50～3.75倍。相關(guān)性分析結(jié)果（表4）表明，U、Ra與各指標(biāo)均呈負(fù)相關(guān)，但未達(dá)到顯著水平。土壤微生物活性指標(biāo)差異研究結(jié)果表明，2號(hào)取樣點(diǎn)MBC與其余各點(diǎn)差異顯著，1號(hào)取樣點(diǎn)MBN和微生物熵均表現(xiàn)出與其余各點(diǎn)差異顯著；對(duì)于微生物基礎(chǔ)呼吸來(lái)說(shuō)，除4號(hào)與6號(hào)取樣點(diǎn)間差異不顯著外，其余各點(diǎn)均表現(xiàn)為差異顯著；5號(hào)和3號(hào)取樣點(diǎn)微生物代謝熵與其余各點(diǎn)間差異顯著。

表3 土壤微生物活性指標(biāo)Table 3 Soil microbial activity indicators

表4 放射性核素與微生物參數(shù)的相關(guān)性Table 4 Correlation between radioactive nuclides and microbial parameters

2.2 不同放射性污染土壤中微生物群落功能多樣性的變化

2.2.1 微生物群落代謝剖面AWCD的變化 AWCD反映土壤微生物代謝活性，是測(cè)定土壤微生物碳源利用能力的重要指標(biāo)[18]。從圖1可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，AWCD值也呈現(xiàn)不同程度的增加。第一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)發(fā)生在培養(yǎng)48 h，1、6號(hào)土樣的AWCD呈明顯升高的趨勢(shì)；第二個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)發(fā)生在培養(yǎng)72 h，2、3、4號(hào)土樣AWCD持續(xù)升高直到培養(yǎng)144 h，這種變化趨于平穩(wěn)直到試驗(yàn)結(jié)束，除6號(hào)樣品外，其他各點(diǎn)的AWCD值變化速度(斜率)和最終AWCD值比對(duì)照均有不同程度的下降?？傮w來(lái)看，當(dāng)AWCD值開(kāi)始增加時(shí)，各樣品的AWCD值增加趨勢(shì)不同，對(duì)照和6號(hào)土樣的變化速率相對(duì)較快，其余各點(diǎn)在整個(gè)培養(yǎng)階段活性都處于一個(gè)較低的水平。表明6號(hào)土樣AWCD最大值及變化速度在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中都顯著高于對(duì)照1號(hào)土樣，其原因可能是低濃度的Ra造成的逆境，刺激微生物代謝增加的原因。

圖1 土壤微生物平均吸光值變化Fig.1 Changes in average well color development(AWCD) values of soil microbes

2.2.2 微生物對(duì)不同碳源的利用特征 根據(jù)化學(xué)基團(tuán)的性質(zhì)把生態(tài)板上的31種碳源分為6類(lèi)，即酚酸類(lèi)、碳水化合物類(lèi)、羧酸類(lèi)、氨基酸類(lèi)、碳水化合物類(lèi)胺類(lèi)[21]?？梢圆捎猛寥牢⑸镌谏鷳B(tài)板上培養(yǎng)168 h的數(shù)值進(jìn)行主成分分析，進(jìn)而比較土壤微生物對(duì)不同碳源的利用特征。31種因子中提取的5個(gè)主成分因子，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)99.290%，分別可以解釋所有變量方差的27.472%和25.901%、23.673%、12.860%、9.385%。不同程度污染土壤主成分分析結(jié)果（圖2）表明，各取樣點(diǎn)與對(duì)照點(diǎn)微生物群落有明顯的差別，說(shuō)明放射性污染使土壤微生物生理代謝產(chǎn)生了明顯的變化。從表5可以看出，PC1載荷表現(xiàn)較高的碳源共有9種，其中3種氨基酸，3種碳水化合物，2種羧酸類(lèi)，1種胺類(lèi)；PC2載荷表現(xiàn)較高的碳源共有9種，其中3種氨基酸，碳水化合物和羧酸類(lèi)各2種，多聚物和酚酸類(lèi)各1種；PC3載荷表現(xiàn)較高的碳源共有6種，其中3種碳水化合物，酚酸類(lèi)、胺類(lèi)、多聚物各1種，表明碳水化合物和氨基酸在PC1和PC2上的權(quán)重較大，在PC3上碳水化合物的權(quán)重較大。由此可見(jiàn)，各取樣點(diǎn)微生物群落代謝利用碳源差異主要表現(xiàn)在為碳水化合物類(lèi)，其次是氨基酸類(lèi)以及其他碳源類(lèi)型。

圖 2 土壤微生物碳源利用類(lèi)型的主成分分析Fig.2 Principal components analysis of carbon utilization by soil microbes

2.2.3 微生物多樣性指數(shù)分析 采用培養(yǎng)168 h的測(cè)定數(shù)據(jù)計(jì)算土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)，其中，Shannon多樣性指數(shù)表示在顏色變化率一致的情況下，整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)土壤微生物群落利用碳源類(lèi)型的多與少[22]。從表6可以看出，除6號(hào)土樣的各指標(biāo)較對(duì)照稍大，其他各點(diǎn)的Shannon指數(shù)（H）、Simpson 指數(shù)（D）、豐富度指數(shù)（S）與對(duì)照相比分別下降5.26%～30.53%、28.73%～90.55%、57.14%～100%，值得注意的是5號(hào)土樣，因其（C-R）＜0.25，故將其豐富度記作0。從相關(guān)性分析（表4）可以看出，放射性核素U與各功能指數(shù)的相關(guān)性不明顯，而Ra與Shannon指數(shù)（H）、豐富度指數(shù)（S）呈顯著負(fù)相關(guān)，以上結(jié)論可以從一定程度上說(shuō)明放射性核素對(duì)微生物多樣性產(chǎn)生了一定的影響。

表5 土壤微生物碳源利用主成分1、2、3載荷較高的碳源Table 5 Variable loading characteristics of high principal components for carbon source utilization by soil microbes

表6 土壤微生物功能多樣性指數(shù)Table 6 Functional diversity indicators of soil microbes

3 討論

土壤微生物生物量、基礎(chǔ)呼吸、代謝熵、微生物熵等微生物生理生態(tài)參數(shù)是近年來(lái)用的較多的評(píng)估土壤環(huán)境質(zhì)量的指標(biāo)。一般來(lái)說(shuō)，土壤微生物量與土壤污染元素呈顯著負(fù)相關(guān)，張涪平等[23]研究了藏中礦區(qū)重金屬對(duì)土壤微生物量的影響，結(jié)果表明土壤的微生物生物量受到重金屬污染的嚴(yán)重影響，隨著土壤重金屬含量的增加，土壤微生物量碳氮逐漸下降；也有研究稱(chēng)礦區(qū)周邊的中低濃度的區(qū)域微生物量也明顯減少[24]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示土壤微生物量與放射性核素的相關(guān)性不明顯，而且5號(hào)取樣點(diǎn)的土壤微生物量碳比對(duì)照高，可是Biolog結(jié)果顯示其活性較低，這一結(jié)果也明反映土壤放射性核素污染對(duì)土壤微生物活性的影響是復(fù)雜的，研究結(jié)果差異較大，有時(shí)甚至相互矛盾[25]，其具體原因有待進(jìn)一步探討。土壤基礎(chǔ)呼吸代表土壤碳素的周轉(zhuǎn)的速率及微生物的總體活性，與土壤環(huán)境質(zhì)量有著密切的關(guān)系；代謝熵把微生物生物量和微生物活性結(jié)合起來(lái)。本研究中供試土壤的基礎(chǔ)呼吸、代謝熵以及微生物熵都高于對(duì)照，可能是由于微生物可以保持極低的基質(zhì)利用率。相關(guān)性分析表明放射性核素與微生物熵呈正相關(guān)關(guān)系，在一定程度上說(shuō)明放射性核素對(duì)環(huán)境造成了脅迫效應(yīng)，使微生物活性發(fā)生了變化，從而改變了土壤的肥力和質(zhì)量，這與JúLIA等[26]的研究結(jié)果相似。

土壤微生物群落功能多樣性是反應(yīng)礦區(qū)生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定性的重要指示因子之一，污染程度不同的土壤微生物群落碳源利用的能力是不同，土壤微生物群落利用碳源類(lèi)型的多與少可以用各種的多樣性指數(shù)表示[27]。有研究指出，尾礦區(qū)土壤微生物群落代謝剖面( AWCD) 及群落豐富度、多樣性指數(shù)均顯著低于非礦區(qū)土壤[28]，本試驗(yàn)的研究結(jié)果與其基本相似，6號(hào)土樣在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中的AWCD值以及多樣性各指數(shù)都高于對(duì)照，可能是由于含水量以及微生物組成區(qū)系不同，也有可能是放射性核素長(zhǎng)期污染下，該環(huán)境更有利于微生物的更替，產(chǎn)生了抗脅迫能力較強(qiáng)的微生物種類(lèi)，具體原因還有待研究。值得指出的是本試驗(yàn)的各活性指標(biāo)以及多樣性指數(shù)均與U的相關(guān)性不強(qiáng)，可以說(shuō)明U在一定程度上未對(duì)土壤微生物造成影響或很少，而Ra與Shannon指數(shù)（H）、豐富度指數(shù)（S）呈顯著負(fù)相關(guān)，表明這2個(gè)多樣性指數(shù)能較真實(shí)地反映鈾尾礦周邊地區(qū)Ra污染狀況，但仍需對(duì)各多樣性指數(shù)的適用范圍和條件進(jìn)行研究，并對(duì)各指數(shù)的數(shù)學(xué)方法和生物學(xué)意義進(jìn)行深入研究，才能更好地了解尾礦庫(kù)微生物群落的多樣性。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)我國(guó)某典型鈾尾礦庫(kù)中放射性污染土壤微生物活性及功能多樣性特征進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)放射性污染會(huì)對(duì)土壤微生物活性產(chǎn)生影響，低濃度污染放射性污染造成的逆境會(huì)使微生物活性升高，但高濃度的放射性污染則會(huì)抑制微生物生長(zhǎng)。在放射性污染對(duì)微生物群落功能多樣性影響方面，放射性污染使土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，微生物對(duì)碳源的利用能力降低，物種豐富度下降，且這種變化主要是由Ra引起的。主成分分析（PCA）表明微生物對(duì)碳源的利用差異主要體現(xiàn)在碳水化合物上，其次是氨基酸及其他碳源。