劉維　周智威　白婷　劉?！垏?guó)建　李洋　孫群

摘要：探究外源ATP處理對(duì)羊肚菌采后理化性質(zhì)和揮發(fā)性呈香物質(zhì)的影響，為羊肚菌保鮮方法的探索提供理論基礎(chǔ)。新鮮羊肚菌用0.5mmol/L和0.7mmol/L ATP溶液浸泡處理后4℃貯藏，測(cè)定儲(chǔ)藏期間水分活度、細(xì)菌總數(shù)、PPO酶活、還原性糖含量、脂質(zhì)氧化水平、揮發(fā)性呈香物質(zhì)。與對(duì)照相比，0.5mmol/L ATP處理組在儲(chǔ)藏期間的水分活度和菌落總數(shù)降低，還原糖含量減少，脂質(zhì)氧化程度降低。ATP處理可以提高羊肚菌關(guān)鍵揮發(fā)性呈香物質(zhì)的含量，如2-甲基丁醛、苯乙醛、反-2-辛烯醛、1-辛烯-3-醇、1，2-二甲基-3-辛酮。0.5mmol/L ATP處理可以較好地保持羊肚菌采后儲(chǔ)藏期間的生理特性和香味特征。

關(guān)鍵詞：羊肚菌;保鮮;三磷酸腺昔;脂質(zhì)氧化;揮發(fā)性呈香物質(zhì)

中圖分類號(hào)：TS255.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-5124（2019）08-0085-08

0 引言

羊肚菌，隸屬子囊菌亞門、盤菌綱、盤菌目、羊肚菌科、羊肚菌屬，因其菌蓋表面呈褶皺網(wǎng)狀、狀如羊肚而得名，主要分布在我國(guó)四川、青海、西藏、新疆等地。羊肚菌的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功效，使其商業(yè)化發(fā)展具有廣泛的市場(chǎng)前景。近年來(lái)，羊肚菌全國(guó)人工種植規(guī)模劇增，從2012年的0.3萬(wàn)畝發(fā)展至2017年7萬(wàn)畝（1畝=666.67m²），年總產(chǎn)量接近2萬(wàn)噸，在未來(lái)的兩三年內(nèi)羊肚菌的鮮貨銷售量預(yù)計(jì)將達(dá)到每日15～20噸。

新鮮羊肚菌采收時(shí)表面堅(jiān)挺，組織脆嫩，含水量高，表面沒(méi)有保護(hù)結(jié)構(gòu)，一般為白色或灰褐色。采后呼吸作用和新陳代謝仍然持續(xù)，水解酶和氧化酶酶活力升高，呼吸作用劇烈，在采收和運(yùn)輸過(guò)程中易受到機(jī)械損傷和微生物侵染，出現(xiàn)褐變、開(kāi)傘、皺縮、軟化等品質(zhì)劣變現(xiàn)象。新鮮羊肚菌對(duì)溫度極為敏感且具有特殊的中空結(jié)構(gòu)，目前最常用的保鮮方法是4～10℃冷庫(kù)儲(chǔ)藏，貨架期也只能延長(zhǎng)至3～5d;或者一20℃冷凍儲(chǔ)藏，貨架期可達(dá)到3個(gè)月以上，但是嚴(yán)重破壞羊肚菌的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味。目前關(guān)于羊肚菌其他有效的保鮮技術(shù)的研究報(bào)道甚少。

能量平衡在食用菌采后成熟和衰老過(guò)程中非常重要。三磷酸腺昔（adenosine triphosphate，ATP）是一種不穩(wěn)定的高能化合物，是生物體內(nèi)最直接的能量來(lái)源。有研究報(bào)道，外源ATP應(yīng)用于龍眼、荔枝和綠豆芽[1-3]等果蔬保鮮，提高采后果蔬所需能荷，避免果蔬呼吸消耗引起的能量匱缺，有利于保持較佳的感官品質(zhì)。果蔬采后會(huì)產(chǎn)生一系列的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）的積累，ROS的清除需要ATP供能，ATP的缺乏可能會(huì)造成ROS持續(xù)性積累，進(jìn)而使細(xì)胞膜氧化損傷，破壞膜脂結(jié)構(gòu)的完整性，加快果蔬的衰老過(guò)程。采后果蔬補(bǔ)給外源ATP可維持能量平衡，降低呼吸速率和有機(jī)物的消耗[1]。外源ATP也可作為信號(hào)分子，激活NO/Ca²⁺等第二信使，調(diào)節(jié)細(xì)胞壁多糖、果膠降解等相關(guān)基因的表達(dá)[3-4]，減緩采后果蔬的品質(zhì)劣變速度。本文首次嘗試將外源ATP應(yīng)用到羊肚菌保鮮研究中，探究ATP處理對(duì)羊肚菌理化性質(zhì)和揮發(fā)性呈香物質(zhì)的影響，為進(jìn)一步摸索羊肚菌保鮮方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人工種植梯棱羊肚菌Morchella importuna（購(gòu)于四川省甘孜藏族自治州康定市）;PE保鮮袋（購(gòu)于家樂(lè)福超市）;鄰苯二酚、三氯乙酸、沒(méi)食子酸、濃硫酸、硫酸亞鐵、二甲酚橙、BHT、F-C試劑、氯化鈉、過(guò)氧化氫、硫代巴比妥酸、三苯基膦（TPP），乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、甲醇、乙醇等試劑均為分析純（購(gòu)于成都鵬世達(dá)實(shí)驗(yàn)用品有限公司）。

1.2 儀器

DK-8數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;LabMaster neo控溫臺(tái)式水活度測(cè)定儀：瑞士NOVASINA公司;Micro2l R型高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司：AFZ-1002-U型超純水儀：美國(guó)Aquapro公司UV-2450紫外分光光度計(jì)：日本Shimadzu公司;島津氣質(zhì)聯(lián)用GC-MS QP2010：日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 羊肚菌處理方法

羊肚菌采收后用泥土覆蓋和冰盒低溫保存送至實(shí)驗(yàn)室，放在通風(fēng)處讓表面水分自然風(fēng)干，24h內(nèi)處理樣品。挑選大小一致品相優(yōu)良的羊肚菌隨機(jī)分成3組，分別用0.5mmol/L ATP溶液和0.7mmol/LATP溶液浸泡60s為處理組，純水浸泡60s為對(duì)照組，每組3個(gè)平行，PE保鮮袋包裝封口，4℃儲(chǔ)藏。第1，5，9天檢測(cè)指標(biāo)。

1.3.2 質(zhì)構(gòu)測(cè)定

測(cè)定時(shí)將羊肚菌菌柄切成1cm×1cm的正方形樣品。質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定模式：質(zhì)地多面分析（textureprofile analysis，TPA）;TPA參數(shù)設(shè)置：測(cè)試速率2.0mm/s，返回速度為4.5mm/s，形變量85%，停隔時(shí)間5 s，數(shù)據(jù)收集頻率100Hz;探頭類型：p/10直徑10mm的圓柱形探頭;測(cè)定指標(biāo)：硬度、粘性、彈性、內(nèi)聚性、咀嚼性和回復(fù)性。每個(gè)處理重復(fù)3次，求平均值。

1.3.3 水分活度測(cè)定方法

室溫下將羊肚菌柄和菌蓋連接處切成小圓柱形，稱取2.0g。Lab Master neo控溫臺(tái)式水活度儀測(cè)定水分活度。

1.3.4 菌落計(jì)數(shù)

采用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)羊肚菌儲(chǔ)藏過(guò)程中的菌落總數(shù)，方法參考GB 4789.2-2016（（食品微生物菌落總數(shù)的測(cè)定》。

1.3.5 多酚氧化酶活力測(cè)定方法

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力采用鄰苯二酚比色法測(cè)定[5]。取羊肚菌1.0g加入10mL預(yù)冷的pH6.80.05mol/L磷酸緩沖液（含1%PVPP），充分研磨，10000r/min離心10min，上清液備用。取試管A加入1.25mL pH6.8的磷酸緩沖液，在40℃溫浴10min，加入0.25mL 40℃預(yù)熱的樣液，立即加入0.25mL 20%的三氯乙酸溶液使酶失活，混勻，加入0.25mL 0.3mol/L鄰苯二酚，8000r/min離心5min，取上清，于波長(zhǎng)410nm處測(cè)定溶液吸光度A₁，此為反應(yīng)開(kāi)始時(shí)的數(shù)值。同時(shí)，以磷酸緩沖溶液替代樣液做相同處理，為空白對(duì)照。試管B加入1.25mL pH6.8的磷酸緩沖液，0.25mL0.3mol/L鄰苯二酚，搖勻，在40℃溫浴10min，加入0.25 n止預(yù)熱的樣液的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，3min后立即加入0.25mL 20%的三氯乙酸溶液，8000r/min離心5min，取上清，于波長(zhǎng)410nm處測(cè)溶液的吸光度A₂，此為反應(yīng)終止時(shí)的數(shù)值。其中A=A₂-A₁，以△A變化0.01為一個(gè)酶活力單位計(jì)算酶活。

1.3.6 還原糖含量測(cè)定方法

還原性糖含量測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸法[6]。取1.0g羊肚菌加入10mL預(yù)冷的pH 6.8 0.05mol/L磷酸緩沖液（含1% PVPP），充分研磨，80℃水浴30min使還原糖浸出，10000r/min離心10min，上清液備用。取0.5mL樣液，加入1.5mL3，5-二硝基水楊酸試劑，棍勻，沸水水浴5min，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，再以蒸餾水定容至10mL，混勻，于波長(zhǎng)540nm處測(cè)定吸光度。以緩沖溶液替代樣液做相同處理，作為空白對(duì)照。以0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/mL葡萄糖溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原性糖含量。

1.3.7 脂質(zhì)氧化水平檢測(cè)方法

過(guò)氧化脂質(zhì)（lipid peroxide，LPO）測(cè)定采用FOX 2法[7]。取1.0g羊肚菌加入10mL預(yù)冷的80%乙醇水溶液（含0.01%BHT），充分研磨，10000r/min離心10min，上清液備用。取0.5mL樣液，分別加入0.1mL 10mmol/L TPP（+TPP）和甲醇（-TPP），渦旋振蕩1min，室溫孵育30min，最后加入1mLFOX反應(yīng)液，室溫孵育30min，于波長(zhǎng)560nm處吸光度值A(chǔ)bs560[+TPP]和Abs560[-TPP]，Abs560LOOH=Abs560[-TPP]-Abs560[+TPP]。以濃度為0，5，10，15，20，25μmol/L H₂O₂繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品LPO含量。

脂質(zhì)氧化測(cè)定采用TBARS法[8]。取1.0g羊肚菌加入10mL預(yù)冷的TCA混合液（含7.5% TCA和0.1%EDTA-2Na），充分研磨，于55℃水浴30min，10000r/min離心10min，上清液備用。取1.0mL樣液，加入1.0mL 0.02mol/L硫代巴比妥酸溶液，混勻，于90℃水浴內(nèi)反應(yīng)20min。以TCA混合液為空白調(diào)零，于532nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。

1.3.8 揮發(fā)性呈香物質(zhì)檢測(cè)

頂空固相微萃取[9]條件：取2g樣品（切成2mm厚度的片狀）于20mL樣品瓶中密封，50℃平衡5min，SPME萃取頭頂空萃取40min，色譜條件：進(jìn)樣口溫度為250℃，不分流進(jìn)樣，解吸5min。載氣為高純氦氣，恒定流量1.0mL/min。采用程序升溫，初始溫度40℃，保持1min;然后以10℃/min的速度升至70℃，保持2min;以3℃/min的速度升至105℃，維持1min;最后以10℃/min的速度升至180℃，保持1min。質(zhì)譜條件：接口溫度280℃，離子源溫度230℃，發(fā)射電流70A，掃描范圍50～550m/z，

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌外觀變化

圖1是羊肚菌在儲(chǔ)藏過(guò)程中的外觀變化。由圖可知羊肚菌在儲(chǔ)藏過(guò)程中會(huì)發(fā)生不同程度的褐變，菌柄從白色逐漸變黃，0.7mmol/L ATP處理組的褐變現(xiàn)象最為明顯。第9天，對(duì)照組和0.7mmol/LATP處理組表面可以觀察到少量白色菌絲，失去食用價(jià)值;在第11天，對(duì)照組和0.7mmol/L ATP處理組表面的白色菌絲生長(zhǎng)明顯，0.5mmol/L ATP處理組的表面有少量白色菌絲開(kāi)始生長(zhǎng)。從表觀結(jié)果來(lái)看，0.5mmol/L ATP可以延緩羊肚菌表面菌絲的生長(zhǎng)。

2.2 羊肚菌質(zhì)構(gòu)變化

質(zhì)地是羊肚菌在儲(chǔ)藏過(guò)程中品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。TPA是模擬人口腔咀嚼的過(guò)程，可以從硬度、內(nèi)聚力、咀嚼性和彈性反應(yīng)羊肚菌的質(zhì)構(gòu)特征。羊肚菌采后的新陳代謝仍在進(jìn)行，蛋白、果膠和纖維素等細(xì)胞壁成分不斷降解，水分因呼吸作用而消耗，導(dǎo)致細(xì)胞膨壓降低，細(xì)胞結(jié)構(gòu)松弛疏散，羊肚菌硬度、咀嚼性和彈性就會(huì)隨之降低[10]。

表1列出了不同處理的羊肚菌在不同儲(chǔ)藏時(shí)間硬度、咀嚼性和彈性的變化。結(jié)果顯示，對(duì)照組的硬度和咀嚼性在整個(gè)儲(chǔ)藏期間呈先降低后增加的趨勢(shì)，而ATP處理組則是先增加后略微降低的趨勢(shì)，該結(jié)果與杏鮑菇的品質(zhì)變化趨勢(shì)相似[11]。對(duì)照組和處理組羊肚菌的彈性在整個(gè)儲(chǔ)藏期均沒(méi)有發(fā)生顯著性變化（P>0.05），可能是因?yàn)檠蚨蔷旧淼膹椥暂^小，相應(yīng)的變化也不明顯。對(duì)照組第5天的硬度與初始相比顯著降低（P<0.05），可能是羊肚菌采后細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)強(qiáng)度降低，第9天對(duì)照組的硬度咀嚼性又增加是因?yàn)樵趦?chǔ)藏后期羊肚菌失水過(guò)多，子實(shí)體表面皺縮變硬。ATP處理組在第5天的硬度和咀嚼性顯著高于對(duì)照組（P<0.05），第9天僅有輕微降低，可能是外源ATP為采后羊肚菌提供新陳代謝所需的能量，避免子實(shí)體蛋白等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解，同時(shí)還能促進(jìn)果膠和纖維素的形成，從而維持羊肚菌正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)。其中，0.5mmol/L ATP比0.7mmol/L ATP更能提高羊肚菌的硬度和咀嚼性?？傮w來(lái)看，0.5mmol/L ATP處理可以很好地維持羊肚菌質(zhì)地特征。

2.3 外源ATP對(duì)羊肚菌水分活度的影響

水分活度A_W值在食品保鮮研究中具有重要意義，可以用來(lái)預(yù)估和衡量食品中腐敗微生物的繁殖、代謝、抗性及生存等能力，較低的水分活度可以提高食品的穩(wěn)定性和防腐能力[12]。圖2是羊肚菌在儲(chǔ)存過(guò)程中的水分活度變化趨勢(shì)。由于羊肚菌本身屬于高水分食品（Aw_W=0.9～1.0），在儲(chǔ)藏期水分活度的變化較小。在儲(chǔ)藏末期ATP處理組的水分活度都顯著低于對(duì)照組（P<0.05），而0.5mmol/LATP處理組和0.7mmol/L ATP處理組之間沒(méi)有顯著差異（P>0.05）。結(jié)果表明外源ATP處理可以顯著抑制羊肚菌自由水含量的升高，在儲(chǔ)藏過(guò)程中對(duì)微生物侵染羊肚菌有一定的抑制作用。

2.4 外源ATP對(duì)羊肚菌微生物生長(zhǎng)的影響

食用菌采后容易受到微生物侵染而腐敗變質(zhì)，微生物生長(zhǎng)量是評(píng)價(jià)羊肚菌耐儲(chǔ)性的重要指標(biāo)。圖3是儲(chǔ)藏過(guò)程中對(duì)照組和處理組的微生物生長(zhǎng)量變化趨勢(shì)。儲(chǔ)藏過(guò)程中，對(duì)照組和處理組在第。一5天菌落總數(shù)顯著增加（P< 0.05），第5天和第9天，0.5mmol/L ATP處理組的菌落總數(shù)都顯著低于對(duì)照組（P<0.05），0.7mmol/L ATP處理組的菌落總數(shù)與對(duì)照相無(wú)顯著差異（P>0.05），表明 0.5mmol/LATP處理可以抑制羊肚菌表面微生物的生長(zhǎng)。

ATP處理可以進(jìn)一步提高了羊肚菌關(guān)鍵揮發(fā)性呈香物質(zhì)的含量且無(wú)劑量差異，如2-甲基丁醛、苯乙醛、反-2-辛烯醛、1-辛烯-3-醇、1，2-二甲基-3-辛酮，目前還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，猜想可能是因?yàn)锳TP處理可以使羊肚菌在一段時(shí)間內(nèi)正常生長(zhǎng)并成熟，使羊肚菌的香氣可以更加濃郁，具體的機(jī)制還有待研究。不過(guò)在其他食用菌保鮮研究中也有類似的報(bào)道，Clllere4[20]利用輻照對(duì)塊菌進(jìn)行保鮮處理，發(fā)現(xiàn)1.5K電子束輻照可以提高3-甲基丁醇等塊菌特征香氣物質(zhì)的含量，還發(fā)現(xiàn)電子束輻照比γ射線對(duì)塊菌香氣的影響更大，且表現(xiàn)為積極的影響。此外，研究報(bào)道ATP處理都能顯著緩解龍眼和綠豆芽[1，3]的褐變現(xiàn)象，但對(duì)羊肚菌的褐變并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的抑制效果。

4 結(jié)束語(yǔ)

0.5mmol/L ATP可以緩解羊肚菌的脂質(zhì)氧化程度，很好地保持羊肚菌采后儲(chǔ)藏過(guò)程中的理化性質(zhì)和香味特征，在羊肚菌保鮮研究中具有一定的應(yīng)用潛力。褐變是影響食用菌品質(zhì)的主要原因，是食用菌保鮮的重要指標(biāo)，0.5mmol/L ATP在本文結(jié)果中不能有效緩解羊肚菌褐變現(xiàn)象。因此，在后期研究中有必要嘗試用其他方法聯(lián)用，以期摸索出一種安全、有效、方便的羊肚菌保鮮方法，拓寬羊肚菌的銷路，促進(jìn)其商業(yè)發(fā)展。

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（編輯：莫婕）