宮文龍，王贊，趙桂琴*，馬琳，韋寶，龔攀，劉希強(qiáng)

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院, 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

沙打旺(Astragalusadsurgens)原產(chǎn)于黃河故道地區(qū)，是一種多年生二倍體(2n=2x=16)異花授粉豆科牧草。常生長(zhǎng)于陽坡和林緣灌叢中，主要分布在中國(guó)、前蘇聯(lián)、蒙古和北美等地[1]。因其優(yōu)異的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、較高的生物量和良好的適口性，現(xiàn)已成為我國(guó)東北、華北和西北等地區(qū)廣泛種植的牧草作物[2]。沙打旺還兼有較強(qiáng)的適應(yīng)性、抗旱性和固沙能力等優(yōu)良特性，使其在干旱、半干旱地區(qū)防止土壤侵蝕、保護(hù)自然環(huán)境和生態(tài)恢復(fù)等方面發(fā)揮越來越重要的作用[3-4]。近年來，關(guān)于沙打旺的研究主要集中在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和細(xì)胞學(xué)等方面[5-8]。由于受限于較長(zhǎng)的生長(zhǎng)周期，種質(zhì)資源的遺傳改良仍為基于生長(zhǎng)習(xí)性的表型選擇[9]。分子標(biāo)記的缺乏對(duì)沙打旺種質(zhì)改良和遺傳多樣性分析產(chǎn)生了很大限制。Huang等[10]利用19個(gè)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA, RAPD)標(biāo)記和96個(gè)簡(jiǎn)單序列間重復(fù)(inter-simple sequence repeat, ISSR)標(biāo)記對(duì)22個(gè)沙打旺種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行了綜合分析，證明了ISSR作為分析沙打旺種質(zhì)遺傳多樣性的分子標(biāo)記具有比RAPD更高的準(zhǔn)確性。李瑞芬等[11]利用RAPD標(biāo)記對(duì)13份不同進(jìn)化狀態(tài)沙打旺種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行了調(diào)查研究，結(jié)果表明沙打旺野生材料的遺傳多樣性均高于育成品種和地方材料。然而，目前開發(fā)的有限沙打旺分子標(biāo)記仍然難以滿足標(biāo)記輔助育種的要求。因此，大量開發(fā)用于改良沙打旺種質(zhì)的高度多態(tài)性的分子標(biāo)記是十分必要的。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat, SSR)，也稱微衛(wèi)星序列，是廣泛分布于真核生物基因組中的分子標(biāo)記。按來源不同可將其分為基因組SSR和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR (EST-SSR), 由轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的EST-SSR分子標(biāo)記具有共顯性遺傳、多態(tài)性高、位點(diǎn)特異性和易檢測(cè)等優(yōu)于其他分子標(biāo)記的多種特點(diǎn)[12-13]，因此廣泛應(yīng)用于許多物種分子標(biāo)記的開發(fā)和利用。劉歡等[14]通過聚丙烯酰胺凝膠電泳及毛細(xì)管法從200對(duì)多花黑麥草(Loliummultiflorum) EST-SSR引物中篩選出25對(duì)擴(kuò)增穩(wěn)定的熒光引物。剡轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)等[15]通過白花草木樨(Melilotusalbus)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)了18182對(duì)EST-SSR引物并對(duì)所開發(fā)的引物進(jìn)行了篩選，為草木樨屬種質(zhì)資源的遺傳改良及分子輔助育種的研究奠定了基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的EST-SSR標(biāo)記開發(fā)方法不僅效率低，而且操作復(fù)雜且成本較高，不利于大量分子標(biāo)記的開發(fā)。近年來，隨著測(cè)序成本的降低，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序成為EST-SSR分子標(biāo)記開發(fā)過程中可行且重要的工具[16-18]。隨著基因編碼區(qū)中大量表達(dá)序列標(biāo)簽的測(cè)定，所得到的標(biāo)記不僅具有基因組SSR的特征，而且其多態(tài)性可能與基因功能直接相關(guān)[19-21]。SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳是一種基于DNA測(cè)序儀平臺(tái)的基因分型方法，與傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳相比，具有快速、高效、自動(dòng)化、成本低、靈敏度和準(zhǔn)確度高等優(yōu)勢(shì)[22]，廣泛應(yīng)用于大量分子標(biāo)記的開發(fā)和利用。

本研究基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)開發(fā)和驗(yàn)證不同沙打旺種質(zhì)中的多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記，并利用這些多態(tài)性分子標(biāo)記對(duì)不同沙打旺種質(zhì)的遺傳多樣性和遺傳關(guān)系進(jìn)行初步研究，以期為沙打旺育種及種質(zhì)改良提供良好的分析基礎(chǔ)和豐富的參考資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料與DNA提取

本研究使用的27個(gè)沙打旺種質(zhì)均由中國(guó)國(guó)家牧草種質(zhì)庫(北京)提供(表1)。所有材料均于2017年5月種植在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所昌平試驗(yàn)基地。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，小區(qū)面積20 m2(4 m×5 m), 每小區(qū)種植一份材料，每份材料20株。植株生長(zhǎng)6周后每份材料隨機(jī)選取5個(gè)單株幼嫩葉片組織等量混合進(jìn)行DNA提取，幼葉基因組DNA采用新型植物基因組DNA提取試劑盒(天根，北京)根據(jù)說明書進(jìn)行提取。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提DNA質(zhì)量，將所得模板DNA用ddH2O稀釋至50 ng·μL-1，置于-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試沙打旺種質(zhì)Table 1 List of all the accessions used in this study

1.2 RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建和測(cè)序、De novo轉(zhuǎn)錄組組裝和SSR位點(diǎn)鑒定

使用兩個(gè)沙打旺種質(zhì)(CF019650, CF020070)進(jìn)行RNA-seq試驗(yàn)(表1)。植株生長(zhǎng)6周后收集幼葉和莖的混合樣品(每個(gè)樣品3次重復(fù))，立即置于液氮中并儲(chǔ)存于-80 ℃。使用植物總RNA提取試劑盒(天根，北京)按照說明書進(jìn)行樣品總RNA提取。采用多功能酶標(biāo)儀(Spectra Max i3, 北京)檢測(cè)所提RNA濃度，濃度大于600 ng·μL-1的樣品用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

使用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，在適溫下加入打斷試劑將mRNA打斷成短片段。使用隨機(jī)六聚體引物以打斷后的mRNA為模板合成第一鏈cDNA。利用緩沖液、dNTP、RNaseH和DNA聚合酶I合成第二鏈cDNA。采用Min Elute PCR純化試劑盒(天根，北京)進(jìn)行純化回收、粘性末端修復(fù)和3′端加A處理。連接測(cè)序接頭，通過1%瓊脂糖凝膠電泳選擇合適大小的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。最后，通過壹基因公司(北京)的Illumina HiseqTM2000測(cè)序平臺(tái)對(duì)構(gòu)建好的cDNA文庫進(jìn)行測(cè)序。再通過堿基調(diào)用圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為測(cè)序讀數(shù)后獲得原始reads。對(duì)reads進(jìn)行過濾并去除污染序列和含有未知核苷酸比率>5%的reads從而獲得高質(zhì)量的clean reads。使用默認(rèn)參數(shù)的短序列裝配程序Trinity (http://sourceforge.net/projects/trinityrnaseq)進(jìn)行Denovo轉(zhuǎn)錄組組裝。本研究獲得的原始序列數(shù)據(jù)已上傳至中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所BIG數(shù)據(jù)中心基因組序列數(shù)據(jù)庫，登記號(hào)為CRA001062。

利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列鑒定工具程序MISA (http://www.pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)在unigenes數(shù)據(jù)集中對(duì)潛在的SSRs進(jìn)行檢測(cè)。鑒定SSRs的標(biāo)準(zhǔn)是含有單、二、三、四、五、和六核苷酸的序列分別至少重復(fù)12、6、5、5、4和4次。

1.3 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

使用Batch Primer 3.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)的主要參數(shù)為：1)引物長(zhǎng)度為18～28 bp，最佳為23 bp；2) PCR產(chǎn)物大小為80～160 bp；3)退火溫度為55～65 ℃，最佳溫度為60 ℃；4) GC含量為45%～55%，最佳值為50%。本研究所用引物均由天一輝遠(yuǎn)生物公司(北京)合成。PCR擴(kuò)增采用20 μL體系：模板DNA (50 ng·μL-1) 2.0 μL, 2×Taq PCR Master Mix (10 mmol·L-1Tris-HCl, pH 8.3; 50 mmol·L-1MgCl2; 250 μmol·L-1dNTPs; 0.5 U·μL-1Taq DNA 聚合酶) 10.0 μL, 10 μmol·L-1正反引物各0.5 μL, ddH2O 7.0 μL。PCR擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性30 s, 55 ℃退火45 s, 72 ℃延伸45 s; 30個(gè)循環(huán), 72 ℃延伸10 min。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

隨機(jī)選擇擴(kuò)增條帶清晰、具有多態(tài)性位點(diǎn)的引物，在每對(duì)引物5′端添加熒光標(biāo)記FAM(6-carboxy-flourescein), 引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)為選擇各位點(diǎn)引物序列間互不干擾、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度不重疊、退火溫度相近的位點(diǎn)構(gòu)建二重PCR。對(duì)27份沙打旺種質(zhì)基因組DNA進(jìn)行二重PCR擴(kuò)增，熒光標(biāo)記引物由華大基因公司(北京)合成。PCR反應(yīng)選用25 μL體系: 10×Taq緩沖液 (100 mmol·L-1Tris-HCl, pH 8.0; 500 mmol·L-1KCl; 20 mmol·L-1MgCl2) 2.5 μL, 2.5 mmol·L-1dNTP 2.0 μL, Extaq (5 U·μL-1) 0.2 μL, 10 μmol·L-1正反引物各0.5 μL, 模板DNA (50 ng·μL-1) 1.0 μL, ddH2O 18.3 μL。PCR擴(kuò)增條件為: 95 ℃預(yù)變性2 min; 95 ℃變性20 s, 54 ℃退火20 s, 72 ℃延伸30 s; 35個(gè)循環(huán), 72 ℃延伸10 min。使用ABI3730xl DNA分析儀(美國(guó)) 進(jìn)行自動(dòng)熒光檢測(cè)并分離PCR產(chǎn)物。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用LIZ500分子內(nèi)標(biāo)(size standard)和GeneMarker v4.0軟件(http://www.appliedbiosystems.com.cn/)對(duì)毛細(xì)管電泳產(chǎn)物進(jìn)行數(shù)據(jù)收集與圖像分析。利用PowerMarker v3.25軟件計(jì)算等位基因數(shù)，觀測(cè)雜合度(observed heterozygosity, Ho)，期望雜合度(expected heterozygosity, He)和多態(tài)性信息含量(polymorphism information content, PIC)[23]。利用PowerMarker v3.25軟件計(jì)算27個(gè)沙打旺種質(zhì)間遺傳距離并創(chuàng)建UPGMA樹形圖[23]，使用MEGA 7軟件進(jìn)行樹形圖繪制[24]。采用GenAlEx 6.1軟件進(jìn)行主成分分析(PCoA)[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 EST-SSR在沙打旺轉(zhuǎn)錄組中的頻率和分布

經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)控和數(shù)據(jù)過濾，利用短序列裝配程序Trinity共獲得151516個(gè)unigenes，總長(zhǎng)度為190587631 bp，平均長(zhǎng)度為1258 bp。進(jìn)一步從30262個(gè)unigenes序列中檢測(cè)到39163個(gè)EST-SSR位點(diǎn)，SSRs分布頻率為25.85%。在含有ESTs的30262個(gè)unigenes中，6635 (21.93%)個(gè)含有兩個(gè)及以上SSR位點(diǎn)，3514個(gè)(11.61%)為復(fù)合型SSRs (表2)。

表2 沙打旺EST-SSR標(biāo)記開發(fā)結(jié)果Table 2 Summary of EST-SSR found in erect milkvetch

從39163個(gè)EST-SSR位點(diǎn)的核苷酸基序長(zhǎng)度來看：二核苷酸重復(fù)是最豐富的基序類型(38.52%)，其次分別為三核苷酸(30.25%)、單核苷酸(23.04%)、五核苷酸(3.00%)、六核苷酸(2.94%)和四核苷酸(2.24%)(表3)。6個(gè)基序長(zhǎng)度共包含1055種重復(fù)類型，其中單、二、三、四、五和六核苷酸重復(fù)分別有4、12、60、116、327和536種(表3)。

表3 沙打旺轉(zhuǎn)錄組EST-SSR基序類型及分布特征Table 3 Distribution of the EST-SSR motifs in transcriptome

不同EST-SSR基序長(zhǎng)度中的重復(fù)頻率和主要重復(fù)基序通常是不同的。本研究中單、二、三、四、五和六核苷酸基序的主要重復(fù)頻率分別為12～15、6～11、5～8、5～6、4～6和4～6次(圖1)。單核苷酸基序類型中最豐富的重復(fù)基序是A/T，其包含95.37%的單核苷酸重復(fù)類型，其次為AG/CT (包含71.39%的二核苷酸重復(fù))，AAG/CTT (包含29.18%的三核苷酸重復(fù))，AAAT/ATTT (包含28.73%的四核苷酸重復(fù))，AAGAG/CTCTT (包含9.19%的五核苷酸重復(fù))和AAGATG/ATCTTC (包含3.73%的六核苷酸重復(fù))(表3)。

圖1 SSR重復(fù)單元及重復(fù)次數(shù)的分布Fig.1 The distribution of SSR motifs and repeat number

所有沙打旺轉(zhuǎn)錄組SSRs序列的平均長(zhǎng)度為26.16 bp，單、二、三、四、五和六核苷酸重復(fù)的平均長(zhǎng)度分別為19.07、27.13、25.25、27.60、26.20 和31.68 bp。其中分布在12～15 bp的最多，占總數(shù)的42.92%，其次為16～19 bp (16.60%)、≥32 bp (16.35%)、20～23 bp (13.55%)、24～27 bp (8.09%)和28～31 bp (2.49%)(圖2)。

2.2 EST-SSR多態(tài)性引物篩選及遺傳多樣性分析

圖2 SSR重復(fù)長(zhǎng)度的分布Fig.2 Distribution of the SSR repeat length

本研究從30262個(gè)unigenes中成功設(shè)計(jì)了22367對(duì)引物，剩余的ESTs由于SSR的側(cè)翼序列太短(<40個(gè)核苷酸)或不符合引物設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)從而未能成功進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。用兩個(gè)沙打旺種質(zhì)(CF019650，CF020070)的基因組DNA對(duì)隨機(jī)選擇的100對(duì)引物(除單核苷酸重復(fù))進(jìn)行初步篩選，其中90對(duì)引物(90%)可擴(kuò)增出目的特異性條帶，剩余10對(duì)引物產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶均不符合預(yù)期大小。進(jìn)一步從成功擴(kuò)增的90對(duì)引物中隨機(jī)選擇51對(duì)對(duì)27個(gè)沙打旺種質(zhì)基因組DNA進(jìn)行基因分型(表4和圖3)。

表4 用于基因分型的引物序列及信息Table 4 Primer sequences and information for genotyping in this study

續(xù)表4 Continued Table 4

圖3 3個(gè)沙打旺種質(zhì)在AA01位點(diǎn)的電泳圖譜分析Fig.3 Electrophoretogram analysis of one EST-SSR loci (AA01) among 3 erect milkvetch accessions

基因分型結(jié)果顯示：51個(gè)位點(diǎn)共檢測(cè)到446個(gè)等位基因，每個(gè)EST-SSR位點(diǎn)平均檢測(cè)到8.75個(gè)等位基因，變化范圍從2個(gè)(AA26)到17個(gè)(AA19)。期望雜合度(He)變化范圍為0.235 (AA10)～0.906 (AA38)，平均值為0.719。觀測(cè)雜合度(Ho)為0.259 (AA10)～1.000 (AA06)，平均值為0.730。多態(tài)性信息含量(PIC)為0.224 (AA10)～0.898 (AA38)，平均值為0.682 (表5)。根據(jù)Botstein等[26]對(duì)多態(tài)性的定義，51個(gè)標(biāo)記中有45個(gè)具有高度多態(tài)性(PIC>0.50)，5個(gè)具有中度多態(tài)性(0.25

2.3 主成分和聚類分析

計(jì)算27個(gè)沙打旺種質(zhì)間的遺傳距離并進(jìn)行主成分分析(PCoA)(圖4)，結(jié)果顯示前3個(gè)主成分分別解釋了變異的13.93%，7.09%和6.35%，占總變異的27.37%。第一主成分(PCo1)可根據(jù)地理分布將27個(gè)種質(zhì)分為兩個(gè)類群(Pop A和Pop B)。Pop A包括19個(gè)種質(zhì)(13個(gè)來自內(nèi)蒙古，5個(gè)來自西北，1個(gè)來自未知地區(qū))，而Pop B共包括8個(gè)種質(zhì)(6個(gè)來自華北，2個(gè)來自東北)。通過第二主成分(PCo2)可將Pop A和Pop B進(jìn)一步劃分為4個(gè)子群(Pop A-1, Pop A-2, Pop B-1, Pop B-2)。由圖4可知，這4個(gè)子群分別主要由具有直立或匍匐生態(tài)型的種質(zhì)組成：Pop A-1包括14個(gè)種質(zhì)(13個(gè)直立種質(zhì)和1個(gè)匍匐種質(zhì))，Pop A-2包括5個(gè)種質(zhì)(1個(gè)直立種質(zhì)和4個(gè)匍匐種質(zhì))，Pop B-1和Pop B-2分別包括4個(gè)直立和4個(gè)匍匐種質(zhì)(圖4)。表明地理分布和生態(tài)型可以在很大程度上反映沙打旺種質(zhì)的遺傳特征差異。

圖4 27個(gè)沙打旺種質(zhì)主成分分析Fig.4 Three-dimensional principal coordinate analysis (PCoA) of 27 erect milkvetch accessions

圖5 27個(gè)沙打旺種質(zhì)UPGMA 聚類分析Fig.5 UPGMA dendrogram of 27 erect milkvetch accessions

為進(jìn)一步評(píng)估沙打旺種質(zhì)之間的遺傳關(guān)系，利用Nei遺傳距離構(gòu)建了27個(gè)種質(zhì)的UPGMA樹形圖(圖5)。UPGMA聚類結(jié)果與PCoA分析基本一致。首先確定了兩大類群Ⅰ和 Ⅱ，結(jié)合圖4和圖5可知，Pop A和Pop B中的種質(zhì)分別位于聚類組Ⅰ和聚類組Ⅱ中。聚類組Ⅰ可以進(jìn)一步分為3個(gè)亞組，即Ⅰ-a，Ⅰ-b和Ⅰ-c。Ⅰ-a僅包含1個(gè)種質(zhì)(CF020085)。而來自Pop A-1的大多數(shù)種質(zhì)位于Ⅰ-b (86%)中，其余種質(zhì)平均分布在Ⅰ-a (7%)和Ⅰ-c (7%)。Pop A-2的大部分種質(zhì)都位于Ⅰ-c中(60%)，40%位于Ⅰ-b中 (圖5)。聚類組Ⅱ也可以進(jìn)一步分為兩個(gè)亞組，即Ⅱ-a和 Ⅱ-b。來自Pop B-1的種質(zhì)全部位于Ⅱ-a中(100%)，而來自Pop B-2的種質(zhì)則分別位于Ⅱ-a (50%)和Ⅱ-b (50%)中(圖5)。聚類結(jié)果表明雖然在少數(shù)情況下，來自4個(gè)子群的部分種質(zhì)沒有在5個(gè)亞組中聚集在一起，但在大多數(shù)情況下大部分種質(zhì)的聚類結(jié)果仍然與其生態(tài)型及地理來源具有較高相關(guān)性。

3 討論

Denovo轉(zhuǎn)錄組測(cè)序已被證明是一種有效且準(zhǔn)確的EST-SSR標(biāo)記開發(fā)和鑒定方法，并已成功應(yīng)用于許多植物物種中[27-28]。本研究利用Denovo轉(zhuǎn)錄組測(cè)序從沙打旺的30262條unigenes序列中成功鑒定出39163個(gè)EST-SSR位點(diǎn)，SSRs分布頻率為25.85%，高于之前在苜蓿(Medicagosativa)[29]和草木樨(Melilotus)[30]中的報(bào)道。SSRs重復(fù)基序的類型在不同物種之間通常是不同的，但在大多數(shù)物種中最豐富的重復(fù)基序(除單核苷酸重復(fù)外)均為二核苷酸和三核苷酸，這可能與物種的進(jìn)化歷史和基序的基因表達(dá)程度有關(guān)[31-32]。本研究中，最豐富的基序類型同樣是二核苷酸重復(fù)，占總重復(fù)的38.52%，這與白菜(Brassicacampestris)[33]、珙桐(Davidiainvolucrata)[34]和橡膠樹(Heveabrasiliensis)[35]的研究結(jié)果一致。其次最常見的基序類型是三核苷酸重復(fù)，占總重復(fù)的30.25%，也是黃羽扇豆(Lupinusluteus)[36]、老芒麥(Elymussibiricus)[37]和刺槐(Robiniapseudoacacia)[19]中最豐富的重復(fù)基序。此外，AG/CT和AAG/CTT分別是二核苷酸和三核苷酸重復(fù)中最常見的重復(fù)單元，這與橡膠樹[35]和檸條錦雞兒(Caraganakorshinskii)[38]的研究結(jié)果相同。

針對(duì)所有EST-SSR位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，成功獲得了22367對(duì)特異性引物，這為沙打旺遺傳育種研究提供了豐富的資源。利用兩個(gè)沙打旺種質(zhì)基因組DNA對(duì)隨機(jī)選擇的100對(duì)引物進(jìn)行初步篩選，其中90對(duì)引物可成功擴(kuò)增出目的特異性條帶，這一結(jié)果高于寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)[18]和苜蓿[29]中的成功擴(kuò)增比例。較高的擴(kuò)增率可能是因?yàn)楸狙芯恐惺褂玫姆N質(zhì)均屬于具有相似遺傳結(jié)構(gòu)的沙打旺種而不涉及其他近緣物種。利用篩選到的多態(tài)性引物分析27個(gè)沙打旺種質(zhì)的遺傳多樣性，我們?cè)?1個(gè)EST-SSR位點(diǎn)共檢測(cè)到446個(gè)等位基因，平均He、Ho和PIC分別為0.719、0.730和0.682，均高于之前在苜蓿[39]、牛角屬(Calotropis)[40]和蔥屬(Allium)[41]中的報(bào)道。上述結(jié)果表明本研究中開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記具有較高水平的多態(tài)性，適用于沙打旺遺傳和育種的研究和應(yīng)用。此外，傳統(tǒng)上使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行基因分型已被證明是低效且不準(zhǔn)確的[42]，本研究中的51個(gè)EST-SSR位點(diǎn)均通過自動(dòng)DNA分析平臺(tái)進(jìn)行基因分型，檢測(cè)結(jié)果更加靈敏準(zhǔn)確。

遺傳關(guān)系分析可以揭示特定種質(zhì)的遺傳多樣性，并可用于標(biāo)記輔助育種[10]。以前的許多研究都集中在對(duì)部分地區(qū)沙打旺種質(zhì)之間的遺傳關(guān)系進(jìn)行研究和分析[10-11]，而本研究包括了來自中國(guó)各地區(qū)的種質(zhì)，結(jié)果更加具有代表性和準(zhǔn)確性。通過UPGMA聚類分析將沙打旺種質(zhì)分成兩個(gè)類群，其中一個(gè)類群包括來自西北和內(nèi)蒙古的種質(zhì)，另一個(gè)類群主要包括來自華北和東北的種質(zhì)，這可能是由于臨近的地理區(qū)域和長(zhǎng)期的人工選擇導(dǎo)致在兩個(gè)群體中形成了相似的遺傳關(guān)系。PCoA分析基于直立和匍匐兩種生態(tài)型將大部分種質(zhì)(除CF020081和CF008620)劃分為4個(gè)子群，這意味著兩種不同的生態(tài)型可以在很大程度上反映不同沙打旺種質(zhì)的遺傳特征。其余兩個(gè)種質(zhì)(CF020081, CF008620)未根據(jù)生態(tài)型聚集在一起，可能是因?yàn)殚L(zhǎng)期的自然選擇導(dǎo)致其遺傳背景發(fā)生了部分改變。UPGMA聚類結(jié)果與PCoA分析結(jié)果基本一致，然而并非所有的種質(zhì)都基于其地理來源在5個(gè)亞組中聚集在一起，這可能與鄰近地區(qū)長(zhǎng)期的人工選擇和種質(zhì)交換有關(guān)。為更全面的了解不同沙打旺種質(zhì)間的遺傳關(guān)系，有必要使用來自中國(guó)乃至世界各地的大量不同種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性及遺傳關(guān)系評(píng)估，以便為沙打旺種質(zhì)的改良和利用提供行之有效的手段和重要的參考資源。

4 結(jié)論

本研究通過Denovo轉(zhuǎn)錄組測(cè)序從30262個(gè)unigenes中鑒定了39163個(gè)EST-SSR位點(diǎn)，成功設(shè)計(jì)了22367對(duì)引物，并對(duì)100對(duì)引物進(jìn)行驗(yàn)證共篩選出51對(duì)多態(tài)性引物，這為沙打旺乃至黃芪屬(Astragalus)物種的分子標(biāo)記開發(fā)及利用提供了良好的基礎(chǔ)。此外，對(duì)27個(gè)沙打旺種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行了初步分析，結(jié)果表明本研究開發(fā)的多態(tài)性EST-SSR分子標(biāo)記具有較高水平的遺傳多樣性，有助于沙打旺分子標(biāo)記輔助育種，QTL定位和遺傳變異研究。主成分和聚類分析表明不同沙打旺種質(zhì)之間的遺傳關(guān)系與其地理來源具有較高的相關(guān)性，且不同生態(tài)型(直立或匍匐)種質(zhì)的遺傳分布具有明顯的種質(zhì)特異性，為沙打旺種質(zhì)改良和遺傳多樣性研究提供了重要的參考資源。