朱元良

摘要：目的：探討磷酸化表皮生長因子受體（P-EGFR）、磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶（P-ERK）及細胞核轉錄因子（NF-κB）在中耳膽脂瘤上皮組織中的表達。方法：選取本院于2018年5月-2019年5月收治的中耳膽脂瘤患者28例及正常外耳道患者13例，采用Western blot（WB）免疫印跡法、免疫組織化學SP法檢測其皮膚組織當中NF-κB、P-ERK、P-EGFR的表達。結果：P-EGFR蛋白陽性表達多定位在細胞膜與細胞質，NF-κB蛋白陽性表達多定位在細胞核，二者在膽脂瘤組陽性表達率均較正常外耳道皮膚組偏高（P<0.05）。經WB免疫印跡法檢測得知，中耳膽脂瘤組P-ERK、P-EGFR與NF-κB的表達量相比正常耳道皮膚組，表達量均有顯著升高（P<0.05）。結論：于中耳膽脂瘤上皮中，P-EGFR、P-ERK與NF-κB的表達均有增強，在此病癥形成與發(fā)展中，P-EGFR/P-ERK/NF-κB信號通路可能其重要作用。

關鍵詞：P-EGFR;P-ERK;NF-κB;中耳膽脂瘤

中耳膽脂瘤實為一種比較常見的耳科常見病，盡管為良性，但卻有著較強的復發(fā)性、破壞性與侵襲性，且有著并未明確的發(fā)病機制，有報道[1]指出，此病發(fā)生可能與膽脂瘤上皮細胞的凋亡、紊亂、過度增殖相關。伴隨當今分子生物技術的持續(xù)更新與完善，膽脂瘤發(fā)病機制當中，細胞因子所起到的作用越發(fā)受到重視。本文針對中耳膽脂瘤的上皮組織，就磷酸化表皮生長因子受體（P-EGFR）、磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶（P-ERK）及細胞核轉錄因子（NF-κB）在其中的表達情況作一探討。

1.材料與方法

1.1組織標本與試劑

于2018年5月-2019年5月，選取本院收治的28例后天性中耳膽脂瘤患者，將其當作觀察組，另選取15例外耳道正常患者為對照組，均取其皮膚組織標本，將一半用石蠟包埋并切片，并蘇木精-伊紅進行染色，而另外一半則放置到液氮中，當作WB的實驗組織標本。

試劑為：ECL發(fā)光液（美國Thermo pierce）、RIPA裂解液（北京普利萊）、鼠抗人P-ERK單克隆抗體、兔抗人P-EGFR多克隆抗體（均購自SantaCruz公司）。

1.2實驗方法

1.2.1免疫組織化學實驗

先進行烤片、脫蠟、水化等操作，基于0.01M枸櫞酸鉀緩沖液持續(xù)高壓下，實施抗原修復。利用山羊血清實施有針對性的抗原封閉，然后，孵育一抗，放入冰箱中（4℃）。過夜后，第2d復溫，使其溫度達室溫，用PBS進行浸泡，然后孵育二抗，時間為15min，采用PBS進行沖洗，后于室溫下，對辣根酶標記鏈霉卵白素進行孵育（時間為15min），PBS進行沖洗。利用二氨基聯苯胺（DAB）進行染色，于顯微鏡直視下，對反應時間進行控制。已知曉的陽性切片當作陽性對照，而將PBS緩沖液代替一抗當作陰性對照。

1.2.2WB免疫印跡法

取組織，用冰將PBS預冷，后對組織進行清洗，在勻漿器中，將RIPA裂解液加入，對組織進行反復研磨，直至組織塊消失。放在冰上，裂解蛋白，時間為30min。移到離心管，12000rpm，溫度為4℃，時間為15min，離心處理，轉移上清液，備用。對蛋白濃度進行檢測，實施配膠、上樣等操作，調節(jié)濃縮膠電泳的電壓，即80V，將分離膠的電泳電壓控制在120V，當溴酚藍電泳到離膠底大約1cm時，將電泳終止。孵育一抗、二抗，用ECL 化學發(fā)光液顯影，用定影液將顯色終止。曝光底片后，掃描操作，專業(yè)灰度分析軟件（quantity one）分析。

1.3統(tǒng)計學處理

SPSS20.0處理數據，百分率表示計數資料（X2檢驗），P<0.05表示差異顯著。

2.結果

細胞膜與細胞質為P-EGFR蛋白陽性表達的主要定位處，其于膽脂瘤組陽性表達率為57.14%（16/28），較正常外耳道皮膚組10.71%（3/28），顯著偏高（P<0.05）。NF-κB蛋白陽性表達多定位在細胞核，其于膽脂瘤組陽性表達率為71.43%（20/28），相比正常外耳道皮膚組10.71%（3/28），明顯偏高（P<0.05）。經WB免疫印跡法檢測得知，中耳膽脂瘤組P-ERK、P-EGFR與NF-κB的表達量相比正常耳道皮膚組組，表達量均有顯著升高（P<0.05）。

3.討論

EGFR實為一個具有比較明顯的酪氨酸蛋白激酶活性，且大小為170kDa的表皮生長因子受體，由三部分組成，即胞內區(qū)、跨膜區(qū)與胞外區(qū)。當胞外部分結合配體后，能形成P-EGFR，將下游信號通路激活，因而可以加速細胞增殖、遷移等[2]。而對于ERK蛋白而言，其實為絲氨酸-蘇氨酸激酶亞家族，在相關成員當中，當前研究最多的是ERK2、ERK1。從根本上來講，在整個Ras/Raf/MEK/ERK信號通路架構當中，ERK1/2為其基礎構成，其能夠與細胞表面受體轉錄因子相結合，由細胞漿向細胞核內進行轉移，對重要蛋白活性加以控制，最終達到調控細胞周期、凋亡及增殖的目的。對于NF-κB來講，其作為一種轉錄因子，提取于B淋巴細胞當中，其能夠參與許多基因的調控，還參與免疫反應、炎癥反應，對細胞增殖、轉化具有調節(jié)作用，還能加速腫瘤發(fā)展[3]。本文針對中耳膽脂瘤患者，就上述物質在其上皮組織中的表達作一分析，由結果得知，P-EGFR、NF-κB在膽脂瘤組陽性表達率均高于正常外耳道皮膚組。而經WB免疫印跡法檢測現實，中耳膽脂瘤組P-ERK、P-EGFR與NF-κB的表達量均高于正常耳道皮膚組。提示P-EGFR、P-ERK與NF-κB的表達在中耳膽脂瘤的形成與發(fā)展中，均起到重要作用。

參考文獻：

[1]李強，江紅群，陳亞琴，等.長鏈非編碼RNA HOTAIR在中耳膽脂瘤中的表達[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2017，31 （4）：250-253.

[2]沈景秋，許昱.中耳炎患者膽脂瘤中轉化生長因子α的表達水平的臨床意義[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2017，14 （9）：1277-1279.

[3]郝艷，李珂，王建亭，等.NF-κBP65和caspase-3在中耳膽脂瘤中的表達及其臨床意義[J].山西醫(yī)科大學學報，2016，42 （4）：288-291.