莫紫梅 寧芯 陳寧周 林丹

摘 要：建立雞鴨肉中己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）殘留的QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。均質(zhì)樣品用水分散后加入乙腈提取，經(jīng)分散固相萃取凈化后，采用XBridge Phenyl-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）分離，在電噴霧電離負(fù)離子模式下以多反應(yīng)監(jiān)測方式檢測，流動相為水-乙腈。結(jié)果表明：DES在質(zhì)量濃度0.50～20.00 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 9;3 個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率為70.4%～81.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%～3.9%;檢出限和定量限分別為0.1、0.4 μg/kg。

關(guān)鍵詞：QuEChERS;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;己烯雌酚;雞鴨肉

Abstract： This paper aims to establish a method for the determination of diethylstilbestrol （DES） in chicken and duck meat using QuEChERS sample preparation followed by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. The homogenized sample was dispersed in water and then subjected to the extraction of the analyte with acetonitrile. The chromatographic separation were performed on a XBridge Phenyl-C18 column （150 mm × 2.1 mm， 3.5 μm） by gradient elution after dispersive solid-phase extraction purification. The qualitative and quantitative analysis of DES were operated by electrospray ionization mass spectrometry under the negative mode using multiple reaction monitoring （MRM）. Acetonitrile and water were used as the mobile phase. The correlation coefficient of the calibration curve was 0. 999 9 in the concentration range of 0.50 to 20.00 ng/mL. The average recoveries at three spiked concentration levels varied from 70.4% to 81.6% with relative standard deviations （RSD） of 3.1% to 3.9%. The limits of detection （LOD， RS/N ≥ 3） and quantitation （LOQ， RS/N ≥ 10） were 0.1 and 0.4 μg/kg， respectively.

Keywords： QuEChERS; ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; diethylstilbestrol; chicken and duck meat

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190523-114

中圖分類號：TS251.5 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2019）09-0048-05

引文格式：

莫紫梅， 寧芯， 陳寧周， 等. QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測雞鴨肉中己烯雌酚殘留[J]. 肉類研究， 2019， 33（9）： 48-52. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190523-114. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

MO Zimei， NING Xin， CHEN Ningzhou， et al. Determination of diethylstilbestrol residues in chicken and duck meat using QuEChERS combined with ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2019， 33（9）： 48-52. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190523-114. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）屬激素類化合物，是一種能夠縮短動物生長周期、提高養(yǎng)殖效率的生長促進(jìn)劑，可導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂、發(fā)育異?；虍a(chǎn)生腫瘤，被德國、法國等歐盟國家在食用性動物飼養(yǎng)中列為禁用品[1-3]。農(nóng)業(yè)部193號公告《食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單》以及農(nóng)業(yè)部235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》，均禁止在畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中使用DES等雌激素。目前，測定食品中DES殘留的方法有液相色譜（liquid chromatography，LC）[4-6]、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[7-9]、LC-MS/MS[10-12]等方法。LC法易產(chǎn)生假陽性結(jié)果;GC-MS法樣品需衍生化處理，步驟繁瑣;LC-MS/MS技術(shù)具有高選擇性和高靈敏度，且樣品前處理簡單。

液-液分配或固相萃取等傳統(tǒng)前處理方法耗時(shí)長、有機(jī)溶劑損耗大，不利于環(huán)保。分散固相萃取QuEChERS（Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged， Safe）是近年發(fā)展起來的一種快速、簡便、有效、可靠、安全的樣品前處理技術(shù)[13]。本研究采用QuEChERS技術(shù)進(jìn)行樣品前處理，建立QuEChERS-超高效液相色譜（ultra high performance liquid chromatography，UPLC）-MS/MS法檢測雞鴨肉中DES殘留的方法，可較好地排除樣品基質(zhì)干擾，提高檢測效率，節(jié)約時(shí)間，適合大批量雞鴨肉樣品的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞鴨肉，來自廣西區(qū)監(jiān)督抽檢及風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測樣品。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水;乙腈（色譜純） 德國Merck公司;無水乙酸鈉、無水硫酸鎂、中性氧化鋁、氯化鈉（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）吸附劑?德國CNW公司;DES標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.5%） 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;內(nèi)標(biāo)物DES-D8標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.0%） 美國CIL公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Shimadzu DGU-20A超高效液相色譜儀 日本島津公司;QTRAP 4500 MS四極桿質(zhì)譜儀（配備電噴霧離子源） 美國AB Sciex公司;S180H超聲波發(fā)生器德國Elma公司;3-30K離心機(jī) 德國Sigma公司;N-EVAP水浴式氮吹濃縮儀 美國Organomation Associates公司;Vortex-genie渦旋混勻器 美國Scientific Industries公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

精密稱取DES標(biāo)準(zhǔn)品，置于25 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的DES標(biāo)準(zhǔn)儲備液，密封，于-18 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，有效? 個(gè)月。精確吸取DES標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.00 mL，配制成質(zhì)量濃度為50 ng/mL的DES標(biāo)準(zhǔn)工作液，備用。

1.3.1.2 內(nèi)標(biāo)工作液的配制

精密稱取內(nèi)標(biāo)物DES-D8標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為5 μg/mL的DES-D8內(nèi)標(biāo)儲備液，密封，于-18 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。精確吸取DES-D8內(nèi)標(biāo)儲備液1.00 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 ng/mL的DES-D8內(nèi)標(biāo)工作液，備用。

1.3.1.3 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

精確吸取50 ng/mL的DES標(biāo)準(zhǔn)工作液0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 mL，分別置于10 mL棕色容量瓶中，分別加入DES-D8內(nèi)標(biāo)工作液（100 ng/mL）1.0 mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成DES質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中DES-D8內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度均為10 ng/mL。

1.3.1.4 基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

準(zhǔn)確稱取空白基質(zhì)樣品5.00 g，按1.3.2節(jié)的方法進(jìn)行樣品前處理，上清液轉(zhuǎn)移至氮吹管中，分別加入上述混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各1.00 mL，氮?dú)獯蹈珊?，加?.00 mL體積分?jǐn)?shù)50%乙腈溶液復(fù)溶，超聲30 s，渦旋混勻，過0.22 μm濾膜，即得基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 樣品提取

雞鴨肉均質(zhì)后，準(zhǔn)確稱取試樣5.00 g，置于帶螺旋蓋的50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL水，渦旋1 min后，準(zhǔn)確加入10.00 mL乙腈，渦旋2 min，加入QuEChERS鹽析劑（4.0 g無水硫酸鎂、1.0 g氯化鈉），快速搖勻，冰水浴15 min降溫，4 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至15 mL聚丙烯離心管中，備用。

1.3.2.2 樣品凈化

將QuEChERS凈化粉（含500 mg無水硫酸鎂、500 mg中性氧化鋁及200 mg PSA）加入裝有上清液的15 mL離心管中，渦旋1 min，4 000 r/min離心10 min，離心后樣品分層，取上層清液至10 mL具塞刻度試管，45 ℃水浴，氮吹濃縮至近干;加入1.0 mL體積分?jǐn)?shù)50%乙腈溶液復(fù)溶，超聲30 s，渦旋混勻，過0.22 μm濾膜，待上機(jī)測定。

1.3.3 UPLC-MS/MS測定

1.3.3.1 色譜條件

色譜條件：XBridge Phenyl-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）;柱溫40 ℃;流速0.3 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;流動相A為水，流動相B為乙腈，梯度洗脫程序見表1。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離負(fù)離子模式（electron spray ionization，ESI-），多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，電噴霧電壓-4 500 V，離子源溫度650 ℃，氣簾氣壓241 kPa，霧化氣壓、輔助氣壓均為345 kPa。MRM相關(guān)參數(shù)設(shè)定見表2。

1.3.3.3 上機(jī)測定

在上述測定條件下，分別對樣品溶液、基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時(shí)間和定性、定量離子為依據(jù)進(jìn)行定性，以定量離子色譜峰面積與對應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值計(jì)算樣品中待測物的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

雞鴨肉中的脂肪、蛋白質(zhì)等組分會產(chǎn)生基質(zhì)抑制效應(yīng)[14-15]，造成被測物靈敏度降低，需對樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行提取凈化。根據(jù)DES易溶于乙醇、乙醚、氯仿等有機(jī)試劑的化學(xué)性質(zhì)，比較甲醇、乙腈、甲醇水溶液、乙腈水溶液及乙酸乙酯的提取效果。結(jié)果表明：用乙酸乙酯提取的樣品，后續(xù)凈化困難，回收率低，與李雪等[16]報(bào)道的以乙酸乙酯提取牛乳樣品中的DES后續(xù)凈化較困難、回收率較低一致;甲醇、乙腈與水可以互溶，具有良好的蛋白沉淀能力，同時(shí)可將雞鴨肉中部分水溶性蛋白提取出來，帶來雜質(zhì);甲醇水溶液、乙腈水溶液、甲醇等由于沸點(diǎn)較高或與水互溶后沸點(diǎn)提高，不易蒸干，考慮到后續(xù)凈化過程，本研究采用乙腈為提取溶劑。

樣品經(jīng)過乙腈沉淀蛋白質(zhì)后，除去了大部分干擾物，但仍有少量脂肪雜質(zhì)會對目標(biāo)物造成一定影響。比較弗羅里硅土、中性氧化鋁、C18固相萃取小柱及QuEChERS技術(shù)等凈化方式。結(jié)果表明：單獨(dú)使用弗羅里硅土或中性氧化鋁的脂肪去除能力尚可，平均回收率在60%～72%之間，樣品基線較平整，回收率較好，能夠基本滿足分析要求[12，14];而采用C18固相萃取小柱凈化的樣品，DES回收率明顯較低且重復(fù)性差;采用QuEChERS技術(shù)凈化的樣品，DES回收率均在70%以上，重復(fù)性相對較高，故采用QuEChERS技術(shù)進(jìn)行凈化。

QuEChERS樣品前處理技術(shù)有機(jī)溶劑用量少、耗時(shí)短，加入中性氧化鋁和PSA除去樣品中的雜質(zhì)，加入無水硫酸鎂吸收樣品中的水分等[16-18]，同時(shí)可分散樣品，增加與萃取溶劑的接觸面[19-21]，提高回收率。為了獲得最佳的樣品提取效果和回收率，研究PSA（50～300 mg）、無水硫酸鎂（500～1 000 mg）及中性氧化鋁（200～1 000 mg）按不同比例組合的凈化效果。結(jié)果表明，采用200 mg PSA、500 mg無水硫酸鎂及500 mg中性氧化鋁為凈化劑組合進(jìn)行分散固相萃取時(shí)，樣品溶液澄清，基質(zhì)干擾較小，回收率最佳，為70.4%～81.6%，滿足目標(biāo)物痕量分析的要求。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)的消除

基質(zhì)效應(yīng)是客觀存在且不可能消除的，主要是由于基質(zhì)成分和目標(biāo)化合物在電噴霧離子源進(jìn)行離子化時(shí)相互競爭的結(jié)果，包括基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)。在LC-MS分析中，基質(zhì)效應(yīng)影響儀器的靈敏度和重復(fù)性，是影響可靠定性及準(zhǔn)確定量的重要因素，這在動物源食品及生物樣本中表現(xiàn)尤為明顯。為了補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)給分析結(jié)果帶來的影響，通常采用同位素內(nèi)標(biāo)、稀釋樣品溶液、配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液等方法。本研究采用配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，很好地抵消了樣品的基質(zhì)效應(yīng)，得到的方法學(xué)指標(biāo)能滿足殘留檢測的要求。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

DES的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，易脫去一個(gè)H+而形成離子峰[M-H]-，適合選用ESI-模式，ESI-模式下產(chǎn)生的母離子為[M-H]-。采用注射泵直接進(jìn)樣，將質(zhì)量濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液以5 μL/min流速注入離子源中進(jìn)行一級質(zhì)譜分析（MS2 Scan），得到分子離子峰，再對準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，得到相應(yīng)的碎片離子，選擇3 個(gè)豐度較高的特征碎片離子，其中豐度最高的作為定量離子，其余做為定性離子，進(jìn)行碰撞能量、去簇電壓、噴霧電壓等參數(shù)優(yōu)化，最后得到DES的3 個(gè)碎片離子MRM掃描時(shí)對應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)[22-24]。

2.4 色譜條件的優(yōu)化

由于DES含有酚羥基結(jié)構(gòu)，在ESI-模式下，流動相中加入乙酸、乙酸銨、甲酸等會抑制其響應(yīng)[25-27]，流動相中加入0.1%氨水則可提高靈敏度，但流動相pH值會達(dá)到10左右，超過普通硅膠基質(zhì)C18柱的pH值耐受范圍，需選用pH值耐受范圍廣的色譜柱[28-30]。在本研究優(yōu)化的色譜條件下，不加0.1%氨水也能獲得良好的峰形和靈敏度，故選取乙腈-水作為流動相。選用可耐受pH值范圍2.0～12.0的XBridge Phenyl-C18柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）作為分離柱。

流速大小影響色譜柱及系統(tǒng)的壓力、樣品組分的分離效果和出峰時(shí)間，流速太大，系統(tǒng)的壓力太高，容易引起柱頭塌陷，流速太小，出峰時(shí)間延長，通過查閱相關(guān)研究[18，20，23]，流速確定為0.3 mL/min。采用優(yōu)化后的條件，DES及其內(nèi)標(biāo)物DES-D8的MRM提取離子流如圖1所示。

2.5 線性范圍、方法檢出限與定量限

對配制好的DES標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定，以DES定量離子色譜峰面積與對應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)（y），標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，ng/mL），進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果表明：DES在質(zhì)量濃度0.50～20.00 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.927 00x+0.004 76（r=0.999 9）。準(zhǔn)確稱取雞鴨肉空白樣品，加入一定量DES和DES-D8標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.2節(jié)的方法進(jìn)行樣品前處理，以3 倍信噪比（RS/N）計(jì)算得到DES的方法檢出限為0.1 μg/kg，以10 倍RS/N計(jì)算得到DES的方法定量限為0.4 μg/kg。

2.6 回收率與精密度

采用內(nèi)標(biāo)定量法，準(zhǔn)確稱取雞鴨肉空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)量分別為0.4、0.8、4.0 μg/kg，每個(gè)加標(biāo)量設(shè)3 個(gè)平行，按1.3.2節(jié)的方法進(jìn)行樣品前處理，并做空白實(shí)驗(yàn)。

由表3可知，雞鴨肉中DES的加標(biāo)回收率為70.4%～81.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%～3.9%，表明方法的準(zhǔn)確度與精密度較好，符合殘留分析要求。圖2為加標(biāo)量0.8 μg/kg的樣品總離子流圖。

2.7 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用建立的方法對廣西區(qū)監(jiān)督抽檢和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測的103 批雞鴨肉樣品進(jìn)行DES殘留量測定，結(jié)果表明，樣品中均未檢出DES。

3 結(jié) 論

建立了雞鴨肉中DES殘留量的QuEChERS-UPLC-MS/MS測定方法，以中性氧化鋁、無水硫酸鎂和PSA為基質(zhì)凈化劑，用乙腈對樣品進(jìn)行提取，UPLC-MS/MS法檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明，樣品加標(biāo)回收率和樣品間的測定重復(fù)性較好，樣品前處理過程相對簡單，可較好地排除樣品基質(zhì)的干擾，且分析時(shí)間僅6 min左右，提高了檢測效率，適合大批量雞鴨肉樣品的快速檢測。

在樣品前處理?xiàng)l件和色譜條件優(yōu)化中，提取溶劑和凈化方式均與回收率和提取率有密切關(guān)系。合適的凈化方式可以有效將基質(zhì)干擾效應(yīng)降低，減少雜質(zhì)對目標(biāo)物的影響以及對儀器的污染和損害。色譜條件則影響目標(biāo)物的響應(yīng)和分離效果。故選擇合適的提取溶劑、凈化方式及色譜條件是日常食品檢測中必須考慮的因素。本研究建立的方法適合大批量雞鴨肉中的DES檢測，對于其他類型樣品則需進(jìn)一步研究探討。

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