柏昌旺，章超樺,2,3,4,5，林海生,2,3,4,5，秦小明,2,3,4,5，曹文紅,2,3,4,5，楊雨柔

響應(yīng)面法優(yōu)化制備牡蠣短肽工藝

柏昌旺1，章超樺1,2,3,4,5，林海生1,2,3,4,5，秦小明1,2,3,4,5，曹文紅1,2,3,4,5，楊雨柔1

（1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；2. 廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518120；3. 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實驗室// 4. 廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實驗室// 5.國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心（湛江），廣東 湛江 524088）

探究前處理方式對酶解效果的影響，優(yōu)化牡蠣短肽制備工藝。在確定高效酶種類和前處理方式的基礎(chǔ)上，以氮回收率、短肽得率為指標(biāo)對酶解時間、料液比、酶解溫度、加酶量進(jìn)行單因素試驗，再利用響應(yīng)面設(shè)計建立數(shù)學(xué)模型，以短肽得率為響應(yīng)值，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析。牡蠣經(jīng)80 ℃熱處理10 min后使用動物蛋白酶的酶解效果最佳。響應(yīng)面結(jié)果顯示，最佳酶解工藝為料液比（g/mL）1∶3.9、溫度47 ℃、加酶量3 300 U/g、自然pH（6.5）、酶解3 h，其短肽得率為（58.53 ± 1.20）%，比原酶解工藝提高24.8%。

牡蠣；短肽；可控酶解；響應(yīng)面法

牡蠣俗稱生蠔、海蠣子，因肉質(zhì)爽滑，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，被附以“根之源”“海洋牛奶”等美譽(yù)[1]。近年來，我國牡蠣行業(yè)產(chǎn)量呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，2018年養(yǎng)殖量達(dá)513.9萬t[2]。但是目前國內(nèi)牡蠣的應(yīng)用仍以直接食用或制成調(diào)味料為主，針對其精深加工技術(shù)與新型產(chǎn)品開發(fā)的進(jìn)展較為緩慢，因此，推動牡蠣深加工及綜合利用對其產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的意義[3]。一般來說，3 ~ 9個氨基酸聚合而成的肽稱為短肽，其相對分子質(zhì)量范圍為180 ~ 1 000，介于氨基酸與蛋白質(zhì)之間，具有吸收好、代謝快、活性高等優(yōu)點(diǎn)，是目前國內(nèi)外研究開發(fā)的熱點(diǎn)[4]。牡蠣短肽具有抗氧化、抗腫瘤、降血壓、抗凝血、抗炎癥、改善學(xué)習(xí)記憶[5-11]等多種生物活性。但現(xiàn)階段牡蠣肽的傳統(tǒng)制備工藝普遍存在短肽得率低，酶解后的超濾和分離純化工藝復(fù)雜、富集困難等問題[12]，直接阻礙了其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。目前急需一種高效制備牡蠣短肽的工藝。

蛋白質(zhì)的可控酶解是指通過控制水解條件、水解度的方法而獲得目標(biāo)分子量分布的水解產(chǎn)物[13]，但現(xiàn)階段可控酶解技術(shù)只應(yīng)用于提高功能物質(zhì)的活性，對如何控制、富集目標(biāo)分子量產(chǎn)物研究尚未見有報道。本研究利用可控酶解技術(shù)水解牡蠣，研究不同蛋白酶、前處理方式對酶解效果的影響，在單因素的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法確定酶解牡蠣的最佳工藝，為牡蠣可控酶解短肽的制備工藝及規(guī)?；a(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香港牡蠣（），體質(zhì)量（20.56 ± 1.34）g，購于湛江市東風(fēng)市場；菠蘿蛋白酶（1.6×104U/g）、木瓜蛋白酶（7.0×104U/g）、動物蛋白酶（6.8×104U/g）、風(fēng)味蛋白酶（7.0×104U/g）、中性蛋白酶（6.3×104U/g），南寧龐博生物工程有限公司；Protamex（6.3×104U/g）、Flavourzyme（5.9×104U/g），諾維信生物技術(shù)有限公司；還原型谷胱甘肽（GSH），上海源葉生物有限公司；混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，和光純藥工業(yè)株式會社；氫氧化鈉、甲醛等分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-25雷磁pH計，上海康儀儀器有限公司；UV-8000 紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；VAPODEST450 全自動凱氏定氮儀，德國Gerhardt公司；L-8900全自動氨基酸分析儀，日立高新技術(shù)公司；SHZ-水浴恒溫震蕩器，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；冷阱CT-6、ZLS-1型真空離心濃縮儀，湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 牡蠣酶解液的制備 牡蠣全肉經(jīng)流水解凍后打漿均勻，按料液質(zhì)量體積比（g/mL，下同）1∶3加水，調(diào)各酶最適pH值，8 000 r/min勻漿2 min，加酶酶解后100 ℃水浴滅酶10 min，靜置冷卻至室溫后以8 000 r/min離心15 min，最后四層紗布過濾獲取上清液，在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 高效蛋白酶的篩選 選用Flavourzyme、Protamex、動物蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶，在各自最適條件下進(jìn)行酶解（表1），以水解度、氮N回收率、短肽質(zhì)量濃度、短肽得率為指標(biāo)綜合評價酶解效果。

表1 各酶酶解條件

Table 1 Enzymatic conditions of each enzyme

1.3.3 前處理對酶解效果的影響 稱取牡蠣漿液40 g放入250 mL錐形瓶中，按料液比1∶3加蒸餾水后均質(zhì)，分別采用熱處理（60、70、80、90、100 ℃下水浴保溫10 min）和室溫25 ℃下超聲波處理（功率500 W處理10、15、20 min，）兩種方式對牡蠣勻漿液進(jìn)行預(yù)處理，冷卻至室溫測pH值后加入動物蛋白酶酶解4 h，最后100 ℃水浴滅酶10 min離心取上清液，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 單因素試驗 在篩選出最佳蛋白酶和前處理方式的基礎(chǔ)上，探究酶解時間、料液比、溫度、加酶量對短肽得率和N回收率的影響。酶解時間：在加酶量為3 000 U/g、溫度50 ℃、料液比1∶3、自然pH條件下分別酶解1、2、3、4、5 h。料液比：在加酶量為3 000 U/g、溫度50 ℃、酶解時間3 h、自然pH條件下料液比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6。酶解溫度：在加酶量為3 000 U/g、料液比1∶4，酶解時間3 h、自然pH條件下酶解溫度為40、45、50、55、60 ℃。加酶量：在酶解溫度45 ℃、料液比1∶4、酶解時間3 h、自然pH下加酶量分別為1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/g。

1.3.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken實驗設(shè)計原理，以酶解時間（）、料液比（）、酶解溫度（）、加酶量（）四個因素為自變量，短肽得率為響應(yīng)值，采用軟件Design-Expert V8.0.6.1設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗優(yōu)化酶解條件，相應(yīng)因素與水平設(shè)計如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗因素與水平

Table 2 Response surface test factors and levels

1.3.6 指標(biāo)測定

1.3.6.1 水解度的測定 原料中總氮量和非蛋白氮量采用凱氏定氮法[14]，水解液中氨基態(tài)氮量和原料中游離的氨基態(tài)氮量采用中性甲醛電位滴定法[15]。水解度（DH）計算公式如下：

1.3.6.2 蛋白質(zhì)回收率的測定 蛋白質(zhì)回收率= 上清液總蛋白質(zhì)含量/ 底物總蛋白質(zhì)含量。

1.3.6.3 短肽質(zhì)量濃度的測定 參考徐倩等[16]的方法略有改動。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：首先配制10 mg/mL的GSH溶液，然后將其稀釋成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/mL的10種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取2 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液與3 mL的雙縮脲試劑混勻，于漩渦混合儀上混合均勻，60 ℃水浴10 min后于540 nm 下測定光密度值。以標(biāo)準(zhǔn)肽濃度為橫坐標(biāo)（mg/mL），各濃度相應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)，制作一定濃度范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定：取牡蠣酶解液4 mL，加入4 mL體積分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸（TCA）溶液，在旋渦混合儀上混合均勻后靜置10 min，然后4 000 r/min離心15 min，取上清液稀釋倍后，取2 mL加入雙縮脲試劑3 mL [(樣液)∶(雙縮脲試劑) =2∶3]，于漩渦混合儀上混合均勻，60 ℃水浴10 min取上清液于540 nm下測定光密度值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品溶液中的短肽質(zhì)量濃度(mg/mL)。

1.3.6.4 短肽得率的測定[17]

短肽得率= （·）/，

式中：為樣品溶液中短肽質(zhì)量濃度(mg/mL)；為10% TCA總體積（mL）；為樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量（g）。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 采用Design Expert 8.0.6.1軟件對響應(yīng)面數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，EXCEL 2016、Origin 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，SPSS 23進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶酶解效果分析

圖1A所示，風(fēng)味蛋白酶的水解度最高為（41.86 ± 3.62）%，動物蛋白酶略低，為（41.37 ± 1.19）%，兩者無顯著差異（> 0.05）。中性蛋白酶的N回收率最高為（84.12±2.18）%，動物蛋白酶次之為（77.53 ± 0.49）%。由圖1B顯示結(jié)果可知，動物蛋白酶的短肽質(zhì)量濃度和短肽得率均顯著高于其他六種蛋白酶（< 0.01），分別為（15.68 ± 0.67）mg/mL，34.79%。不同蛋白酶的酶切位點(diǎn)千差萬別導(dǎo)致酶解效果的大不相同，動物蛋白酶本身是一種復(fù)合酶，它既是內(nèi)切酶又是外切酶，具有多種酶切位點(diǎn)，故其酶解產(chǎn)物各項指標(biāo)利用率高。因此，選取動物蛋白酶為酶解牡蠣的高效蛋白酶，進(jìn)行下一步實驗。

凡有一個標(biāo)記相同字母即為差異不具統(tǒng)計學(xué)意義（> 0.05）

The same letter means no statistically significant difference (>0.05)

圖1 不同蛋白酶之間的酶解效果比較

Fig.1 Comparison of enzymatic hydrolysis between different proteases

2.2 不同前處理對酶解效果的影響

由圖2A可知，熱處理10 min后的動物蛋白酶酶解產(chǎn)物水解度和N回收率均低于未處理，且隨著溫度升高，牡蠣酶解產(chǎn)物的水解度和N回收率逐步降低。這可能是因為加熱溫度過高或時間過長，都會使已暴露出來的S—H氧化生成S—S或疏水相互作用導(dǎo)致致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成，導(dǎo)致眾多酶切位點(diǎn)反而被包埋[18]。郭玉華等研究顯示熱處理溫度越高，牡蠣酶解產(chǎn)物的水解度越低[18]；林海生等研究表明熱處理組水解度均低于未處理組[19]。本研究結(jié)果與其結(jié)論相一致。圖2A顯示，酶解產(chǎn)物在500 W條件下超聲10、15、20 min后的水解度和N回收率均低于未處理組。這可能是500 W超聲波過強(qiáng)且超聲波過程中產(chǎn)熱導(dǎo)致牡蠣蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，致使蛋白酶酶解效率降低。這與郭玉華的研究結(jié)果相一致[19]。

由圖2B結(jié)果所示，超聲波組的短肽質(zhì)量濃度、短肽得率均低于未處理組。熱處理組的兩項指標(biāo)在60~80℃時隨溫度增長呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，在80℃時短肽得率達(dá)到最高，為（43.25 ± 0.56）%，之后增長趨勢較為平緩，90 ℃時甚至略有下降。100 ℃時的短肽質(zhì)量濃度最高，為（21.06 ± 0.27）mg/mL，與80 ℃的短肽質(zhì)量濃度（20.79 ± 0.27）mg/mL無顯著性差異（>0.05）。溫度升高使得短肽含量升高，可能是因為熱處理雖導(dǎo)致部分酶切位點(diǎn)被包埋，使酶解產(chǎn)物體系中水解度和N回收率顯著下降，但與未處理相比，熱處理使更多隱藏的內(nèi)切位點(diǎn)暴露，蛋白酶得以作用于肽鏈內(nèi)部，從肽鏈中間切斷，迅速降低蛋白質(zhì)分子量，使短肽得率上升。這說明熱處理對短肽的生成是個有效推進(jìn)的過程。綜合評定，選擇將80 ℃熱處理10 min后的牡蠣酶解液進(jìn)行下一步實驗。

凡有一個標(biāo)記相同字母即為差異不具統(tǒng)計學(xué)意義（> 0.05）

The same letter means no statistically significant difference (>0.05)

圖2 不同前處理方式對酶解效果的影響

Fig. 2 Effect of different pretreatment methods on enzymatic hydrolysis

2.3 單因素試驗

2.3.1 酶解時間的確定 由圖3所示，隨著酶解時間的增長，N回收率逐步增加，在3 h后無顯著性變化（>0.05）。短肽得率先上升后下降，3 h時有最高值，這主要是因為反應(yīng)初期，底物濃度高，蛋白質(zhì)迅速被酶解成肽和氨基酸，隨著時間的延長，肽被切割成分子量更小的氨基酸導(dǎo)致短肽含量的下降。因此，酶解時間選擇3 h為宜。

圖3 酶解時間對短肽得率和N回收率的影響

2.3.2 料液比的確定 由圖4可知，隨著料液比增加，短肽得率和N回收率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在1∶4時出現(xiàn)峰值。這是因為一般情況下作為溶質(zhì)的底物蛋白質(zhì)濃度過高，會減低分子間的擴(kuò)散，導(dǎo)致酶與底物接觸面積減少，對酶解產(chǎn)生抑制作用。此后當(dāng)料液比增加到一定程度時會降低底物濃度，減少酶與底物接觸幾率，使酶解作用減弱[20]。因此，料液比選擇1∶4為宜。

圖4 料液比對短肽得率和N回收率的影響

2.3.3 酶解溫度的確定 由圖5可知，隨著溫度的升高，短肽得率和N回收率先升高后下降，45 ℃時出現(xiàn)峰值，且顯著高于（<0.01）其他溫度下的酶解效果。這是因為在一定溫度范圍內(nèi)，酶活力會隨著溫度上升而升高；最適溫度時，酶的催化反應(yīng)速率最快；當(dāng)溫度過高時，酶蛋白會逐步發(fā)生變性作用，影響酶的催化活力導(dǎo)致酶解效果降低。因此，酶解溫度選擇45 ℃為宜。

圖5 酶解溫度對短肽得率和N回收率的影響

2.3.4 加酶量的確定 由圖6所示，加酶量在1 000 ~ 3 000 U/g時，短肽得率與N回收率升高迅速。酶量再增加時，短肽得率有所降低，分析可能是由于酶與底物反應(yīng)過于充分，導(dǎo)致部分短肽被酶解成氨基酸。N回收率在加酶量為4 000 U/g時略有降低，但加酶量5 000 U/g時仍有所提高，但與3 000 U/g無顯著性差異（> 0.05）?？紤]到生產(chǎn)成本，選擇加酶量3 000 U/g最為適宜。

圖6 加酶量對短肽得率和N回收率的影響

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.4.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，設(shè)計以短肽得率為響應(yīng)值，酶解時間（）、料液比（）、酶解溫度（）、加酶量（）四個因素為自變量的響應(yīng)面試驗方案，試驗方案和結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗方案與結(jié)果

采用Design Expert 8.0.6.1軟件對響應(yīng)面模型進(jìn)行分析，得出短肽得率（）與各因素變量的二次多項回歸方程為：= 57.48 + 0.46- 0.26+ 3.43+ 1.69- 0.035- 0.073- 0.17+ 0.16+ 0.16- 0.40- 2.082- 0.832- 4.582- 2.582。對方程進(jìn)行顯著性檢驗方差分析及可信度分析，結(jié)果分別如表4和表5所示。

由表4可知，短肽得率回歸模型< 0.000 1，說明該模型極顯著。一次項、，二次項2、2、2呈現(xiàn)為極顯著，2為顯著。由值可以看出，在4個因素中，對短肽得率影響最大的因素是酶解溫度（），其次分別是加酶量（）、酶解時間（），影響最小的是料液比（），其中，失擬項= 0.074 8 > 0.05，為不顯著，說明方程模擬較好，可以很好的分析數(shù)據(jù)。由表5可知，模型擬合系數(shù)R= 0.991 2，模型校正擬合系數(shù)2adj= 0.959 1，表示該模型能夠解釋短肽得率95.91%的變化來自于所選變量。同時變異系數(shù)為1.35%，說明模型置信度高，可以準(zhǔn)確預(yù)測和分析四個變量對酶解制備牡蠣短肽得率高低的影響。

表4 二次回歸方程的顯著性檢驗及方差分析

注：*表示差異顯著（< 0.05）；**表示差異極顯著（< 0.01）

表5 二次回歸方程的可信度分析

2.4.2 響應(yīng)面3D模型分析 由圖7可知，a ~ f的三維圖形均呈現(xiàn)凸面且開口向下，響應(yīng)面中心點(diǎn)處于變量范圍內(nèi)，說明短肽得率在兩因素交互作用中有最大值。圖7b與圖7f中，隨著因素的改變，短肽得率呈現(xiàn)先增加后減低的趨勢，且曲面相對較為陡峭，等高線密集成橢圓形，但圖形中的時間-溫度、加酶量-溫度的交互作用不顯著。其他圖形的變化趨勢與之相似，交互作用均不顯著。

圖7 時間、料液比、加酶量、溫度四因素兩兩交互作用三維分析

2.4.3 驗證實驗 以短肽得率為響應(yīng)值，利用軟件分析獲得最佳酶解工藝條件為料液比1∶3.9，酶解溫度46.78 ℃，加酶量3 296.8 U/g，酶解時間3.04 h，自然pH，此時的短肽得率為58.37%?？紤]實際操作的可行性，將工藝條件調(diào)整為料液比1∶3.9，酶解溫度47 ℃，加酶量3 300 U/g，酶解時間3 h，自然pH，在此條件下進(jìn)行3次實驗的短肽得率為（58.53 ± 1.20）%，與預(yù)測值接近且無顯著性差異（> 0.05），說明該二次項回歸方程能準(zhǔn)確預(yù)測可控酶解制備牡蠣短肽。且該工藝比傳統(tǒng)工藝短肽得率提升24.8%[21]。

3 結(jié)論

本實驗確定牡蠣勻漿液經(jīng)80 ℃熱處理10 min后加動物蛋白酶為制備牡蠣短肽的高效方法。確定最佳酶解工藝條件,即料液比1∶3.9，酶解溫度47 ℃，動物蛋白酶加酶量3 300 U/g，自然pH下酶解時間3 h，此條件下短肽得率達(dá)（58.53 ± 1.20）%，比傳統(tǒng)工藝的短肽得率提升24.8%。該回歸模型可靠，說明利用響應(yīng)面法能有效優(yōu)化制備牡蠣短肽的酶解工藝。

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Optimization of Preparation Process of Oyster Oligopeptides by Response Surface Methodology

BAI Chang-wang1, ZHANG Chao-hua1,2,3,4,5, LIN Hai-sheng1,2.3,4,5,QIN Xiao-ming1,2,3,4,5, CAO Wen-hong1,2,3,4,5,YANG Yu-rou1

(1.,524088,; 2.,18120,;3.// 4.//5.(),520488,）

To explore the effect of pretreatment on enzymatic hydrolysis and optimize the preparation of oyster oligopeptides.Based on the screening of protease and the confirmation of the pretreatment method, the effects of hydrolysis time, solid-liquid ratio, enzymatic temperature, enzyme-to-substrate ratio on the oligopeptides yield and N recovery rate were investigated. Then mathematical models were set up by response surface methodology. With oligopeptides yield as the response values, the four-factor and three-level response surface analysis was set up.The results showed that animal protease was found to be more suitable for the preparation of oligopeptides from oyster with a pretreatment by heating at 80℃for 10 min. The response surface showed the optimal enzymatic hydrolysis which included hydrolysis temperature at 47 ℃, solid to liquid ratio of 1:3.9, enzyme addition amount of 3300 U/g protein and enzymatic hydrolysis for 3 h under natural conditions with unregulated pH(6.5). Under these conditions, the yield of oligopeptides was 58.53%±1.20%, which was 24.82% higher than that of the traditional enzymatic hydrolysis process.

oyster; oligopeptides; controllable enzymatic hydrolysis; response surface analysis

TS254.4

A

1673-9159（2019）06-0085-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.06.011

2019-08-16

廣東省應(yīng)用型科技研發(fā)專項資金項目（2016B020235002）；貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-49）；廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品高值化加工與利用創(chuàng)新團(tuán)隊項目（GDOU2016030503）；海洋貝類營養(yǎng)健康食品關(guān)鍵技術(shù)及產(chǎn)業(yè)化（GDOU2017052606）

柏昌旺（1995—），男，碩士研究生，研究方向為水產(chǎn)品高值化加工與利用。E-mail:1029537824@qq.com

章超樺（1956—），男，教授，博士，研究方向為海洋生物資源綜合利用。E-mail:zhangch2@139.com

柏昌旺，章超樺，林海生，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化制備牡蠣短肽工藝[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2019，39（6）：85-92.

（責(zé)任編輯：劉朏）