王 哲，王姿曼，郝瑞娟，李俊輝，鄧岳文,2

馬氏珠母貝金黃殼色選育群體植核后差異表達(dá)免疫基因篩選

王 哲1，王姿曼1，郝瑞娟1，李俊輝1，鄧岳文1,2

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088 2. 廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088）

篩選（）金黃殼色選育群體植核后免疫相關(guān)基因與代謝通路。利用轉(zhuǎn)錄組對植核前后馬氏珠母貝的血細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組建庫及測序分析。分別獲得61.78×106和62.68×106個高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，且映射到參考基因組的平均映射率分別為70.16%和67.82%。與植核前相比，植核后分別有2 925個和3 097個基因顯著上調(diào)和下調(diào)（差異倍數(shù)≥2, 校正后≤0.001），其中包括免疫相關(guān)基因凝集素、Toll樣受體，熱休克蛋白等。對差異基因進(jìn)行GO分類分析，分為基因的分子功能、細(xì)胞組分、生物過程3個大類，并細(xì)分為11個子類別，其中結(jié)合和催化功能的基因較多。KEGG分類分析差異基因，可將基因參與的KEGG代謝通路分為6個分支，細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病（僅限動物）、代謝、有機(jī)系統(tǒng)。KEGG富集結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因顯著富集到免疫相關(guān)通路胞質(zhì)DNA感應(yīng)途徑、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移等免疫通路。

馬氏珠母貝；金黃殼色選育群體；轉(zhuǎn)錄組；免疫相關(guān)基因

馬氏珠母貝（）是重要的海水育珠貝。在其育珠時需在受體貝體內(nèi)植入珠核與外套膜小片（供體貝），植入后，外套膜小片與受體貝結(jié)締組織形成珍珠囊并分泌珍珠質(zhì)形成珍珠[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，育珠貝的貝齡、植核季節(jié)、術(shù)前處理方法、術(shù)后處理方法和育珠模式等均影響珍珠產(chǎn)生[3-10]。植核過程是一種移植耐受應(yīng)激反應(yīng)[1]，對于珍珠的產(chǎn)量和質(zhì)量有很大影響[11]，但相關(guān)機(jī)制研究相對較少。

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，對珍珠貝植核免疫反應(yīng)組學(xué)研究漸增[12-13]。雷倩楠[14]利用RNA-seq技術(shù)對馬氏珠母貝植核育珠后不同時間血細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)在植核育珠后第10天差異表達(dá)基因最多，不同時期差異表達(dá)基因包括溶菌酶、清道夫受體、甘露糖受體等。Wang等[12]利用iTRAQ結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)分析馬氏珠母貝植核后0、10、20、30 d的血細(xì)胞蛋白，共獲得相關(guān)蛋白2 702個，其中與免疫相關(guān)的差異蛋白包括纖維蛋白溶酶原、干擾素誘導(dǎo)蛋白、腫瘤壞死因子等。祁曉翔等[15]對三角帆蚌（）植核后不同時期的外套膜和內(nèi)臟團(tuán)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，篩選出58個與鈣代謝相關(guān)的基因。Wei等[13]對植核后0、48 h的馬氏珠母貝血細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)移植后48 h，血細(xì)胞中白細(xì)胞介素受體和Toll樣受體的表達(dá)水平顯著增加，誘導(dǎo)珍珠貝免疫應(yīng)答反應(yīng)。Wei等[16]對珠母貝（）同種異體移植組和異種移植組在0、6、12、24、48、72、96 h血細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定到諸多與氧化還原反應(yīng)、MAPK信號通路和凋亡相關(guān)的基因。通過分析組學(xué)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與植核相關(guān)免疫基因及其調(diào)控機(jī)理[17-18]，如田榮榮發(fā)現(xiàn)，膽堿可免疫調(diào)節(jié)基因通過調(diào)控NF-κB信號通路參與調(diào)控機(jī)體的免疫反應(yīng)等[19]。上述研究為深入了解珍珠貝植核免疫耐受機(jī)制提供了豐富的基礎(chǔ)資料，但對于不同選育群體免疫耐受機(jī)制的研究較少。王哲等[20]研究表明，馬氏珠母貝金黃殼色群體在植核后免疫酶活力較佳，且育珠性狀優(yōu)于對照養(yǎng)殖群體；另外，研究發(fā)現(xiàn)，馬氏珠母貝植核3 d后在血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平及血清免疫酶活均出現(xiàn)明顯變化[21]。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序檢測馬氏珠母貝金黃殼色選育群體植核前后差異表達(dá)的免疫基因，以期為殼色品系培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

為本課題組選育的金黃殼色第4代群體[22]，貝齡1.5齡，殼長5.5 ~ 6.0 cm。植核手術(shù)時，每個受體貝植入1粒規(guī)格為5.5 mm珠核。以同批次進(jìn)行術(shù)前處理未植核的個體為對照組，植核3 d后的貝體為實驗組，以2 mL注射器從貝體閉殼肌抽取血淋巴為樣品，以3 500 r/min、4℃條件離心5 min，棄上清，得血細(xì)胞，加1 mL Trizol，于液氮中速凍，- 80℃下保存，用于轉(zhuǎn)錄組測序分析。每3個個體合為一個樣，且每個轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行3個平行測定。

1.2 RNA 提取及文庫構(gòu)建

利用Trizol 法對血細(xì)胞提取總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳及核酸定量儀（NamoDrop 2000, Therino scientific）檢測RNA的完整性及純度。用帶有OligodT的磁珠富集有polyA尾巴的mRNA；用DNA探針雜交rRNA去除rRNA，RNaseH選擇性消化DNA/RNA雜交鏈，再用DNaseI消化，去除DNA探針，純化后得所需RNA。用打斷buffer把獲得的RNA片段化，用隨機(jī)的N6引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再合成cDNA二鏈形成雙鏈DNA。把合成的雙鏈DNA末端補(bǔ)平并5′端磷酸化，3′端形成突出一個“A”的黏末端，再連接一個3′端有凸出“T”的鼓泡狀的接頭。連接產(chǎn)物通過特異的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物熱變性成單鏈，再用一段橋式引物將單鏈DNA環(huán)化，得到單鏈環(huán)狀DNA文庫。利用BGISEQ-500進(jìn)行上機(jī)測序。

1.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

測序所得原始數(shù)據(jù)稱為原始序列讀數(shù)。利用過濾軟件SOAPnuke（v1.5.2）去除包含接頭的序列讀數(shù)，去除未知堿基N含量大于5%序列，去除低質(zhì)量序列 (定義質(zhì)量值低于10的堿基占該序列總堿基數(shù)的比例大于20%的序列為低質(zhì)量序列)。過濾后獲得干凈序列讀數(shù)。利用 HISAT (v2.0.4) 將干凈序列比對到參考基因組序列[23]（http://gigadb.org/dataset/ view/id/100240/File_page/11）。使用Bowtie2 (v2.25) 將干凈序列比對到參考基因序列，對比對結(jié)果使用RSEM (v1.2.12) 計算基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。

1.4 差異表達(dá)基因分析

本研究利用DEGseq方法[24]檢測差異表達(dá)基因（Differentially Expressed Gene，DEG）。定義差異倍數(shù)為兩倍以上且值≤0.001的基因為顯著差異表達(dá)基因。根據(jù)GO注釋及分類，將差異基因進(jìn)行功能分類，并對值進(jìn)行FDR (False Discovery Rate) 校正，F(xiàn)DR≤0.01視為顯著。根據(jù) KEGG、KEGG PATHWAY注釋結(jié)果，將差異基因進(jìn)行KEGG分類及通路富集分類，同時利用R軟件（phyper函數(shù)）進(jìn)行富集分析，并對值進(jìn)行FDR校正，F(xiàn)DR≤0.01的通路視為顯著富集。

2 結(jié)果

2.1 總RNA質(zhì)量檢測分析

馬氏珠母貝金黃殼色群體植核前后3 d時的血細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，提取的總RNA經(jīng)Agilent 2000檢測，每個樣品的濃度均大于200 ng/μL，RIN均大于7.0，檢驗結(jié)果為合格（表1），說明RNA 符合建庫要求，可進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

表1 植核前后個體RNA檢測結(jié)果

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)整體評價

利用BGISEQ-500平臺分別對馬氏珠母貝金黃殼色群體植核前后提取的cDNA進(jìn)行測序，分別獲得（61.78±0.608）×106和（62.68±0.025）×106的高質(zhì)量Reads，并映射到馬氏珠母貝基因組（表 2）。轉(zhuǎn)錄組的質(zhì)量分析表明，20分別為98.4％、98.23％，30分別為91.34％、91.13％?；虮挥成涞今R氏珠母貝基因組，植核前轉(zhuǎn)錄組平均映射率為70.16％，植核后為67.82％（表2）。因此，轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的測序質(zhì)量良好，說明隨后的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果是可靠的。

2.3 差異表達(dá)基因分析

比較馬氏珠母貝金黃殼色群體植核前后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在兩組之間鑒定出6 022個差異表達(dá)的基因（差異倍數(shù)2，校正后≤0.001）。與植核前轉(zhuǎn)錄組相比，金黃殼色群體植核后有2 925個上調(diào)基因和3 097個下調(diào)基因。其中包括非特異性免疫相關(guān)基因凝集素（CTL）、Toll樣受體（TLR）、補(bǔ)體分子（C1q）、乙酰膽堿受體（nAchR）、應(yīng)激蛋白熱休克蛋白（HSP70、HSP90）等（表3）。

表2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

表3 植核前后轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)部分免疫相關(guān)基因

2.4 差異基因的GO和KEGG注釋

差異基因的GO富集分析表明，GO總共有3個分類，分別描述基因的分子功能（molecular function，1 716個）、細(xì)胞組分(cellular component，2 616個)、生物過程（biological process，1 913個）。在分子功能類型中包含11個子類別，其中結(jié)合（binding，755個）和催化活性（catalytic activity，539個）的基因較多。在細(xì)胞組分功能類型中包含16個子類別，細(xì)胞（cell，443個）、細(xì)胞部分（cell part，430個）、膜（membrane，554個）和膜部分（membrane part，519個）相關(guān)基因較多。涉及生物過程功能的差異基因包括25個子類別，主要生命過程是細(xì)胞過程（cellular process，542個）、代謝過程（metabolic process，421個）等（圖1）。

根據(jù) KEGG 注釋結(jié)果以及分類，將差異基因進(jìn)行KEGG通路分類分析。將基因參與的KEGG代謝通路分為6個分支：細(xì)胞過程（Cellular processes，1 045個)、環(huán)境信息處理（Environmental information processing，1 244個）、遺傳信息處理（Genetic information processing，671個）、人類疾?。℉uman disease，2 844個）（僅限動物）、代謝（Metabolism，1 802個）、有機(jī)系統(tǒng)（Organismal systems，2 479個）。在細(xì)胞工程中包含4個子類別，其中細(xì)胞群落-真核生物（Cellular community-eukaryotes，324個）相關(guān)基因較多。環(huán)境信息處理包含3個子類別，其中信號傳遞過程（Signaling molecules and interaction，846個）基因較多。遺傳信息處理包括4個子類別，其中折疊、排列和降解過程（Folding, sorting and degradation，221個）的基因較多。疾病包括11個子類別，其中癌癥（Cancer: Overview，651個）、病毒感染（infections diseases: Viral，497個）基因較多。代謝過程包括12個子類別，有機(jī)系統(tǒng)包括10個子類別，其中免疫系統(tǒng)（immune system，615個）和內(nèi)分泌系統(tǒng)（Endocrine system，567個）基因較多（圖2）。

圖1 差異基因GO分類

KEGG數(shù)據(jù)庫富集結(jié)果由R 軟件中的 phyper 函數(shù)進(jìn)行，對金黃殼色群體植核前后差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因富集到了333條特定的代謝通路，其中前20條顯著富集的代謝通路如圖3，主要包括胞質(zhì)DNA傳感通路（Cytosolic DNA-sensing pathway）、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝（Cysteine and methionine metabolism）、碳代謝（Carbon metabolism）和白細(xì)胞跨內(nèi)遷移（Leukocyte transendothelial migration）等通路。其中參與先天性免疫的包括胞質(zhì)DNA傳感通路，白細(xì)胞跨內(nèi)遷移、趨化因子信號通路（Chemokine signaling pathway），Toll 樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）等。

圖2 差異基因KEGG Pathway分類結(jié)果

圖3 差異基因KEGG Pathway富集分析

3 討論

在珍珠貝有核珍珠植核育珠過程中，供體貝的外套膜小片及珠核植入受體貝時將引起育珠貝的免疫排斥反應(yīng)。該過程會導(dǎo)致育珠貝吐核甚至死亡，僅部分育珠貝可適應(yīng)植核和小片，逐漸形成珍珠囊，分泌珍珠質(zhì)形成珍珠[1]。因此，研究植核育珠前后基因表達(dá)的組學(xué)差異，對提高珍珠貝的留核率和降低死亡率有重要意義。本研究比較馬氏珠母貝金黃殼色群體植核前后血細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組變化，從mRNA水平解析植核手術(shù)對于育珠貝在基因表達(dá)方面的影響。植核前后轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的質(zhì)控結(jié)果顯示，植核前后轉(zhuǎn)錄組的20分別為97.85%和97.78%，30分別為90%和89.77%，說明轉(zhuǎn)錄測序質(zhì)量較好，滿足后續(xù)的分析要求。

比較馬氏珠母貝金黃殼色群體植核前后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定出6 101個差異表達(dá)基因：植核后有3 432個基因較植核前顯著上調(diào)，2 669個基因顯著下調(diào)，說明受體貝貝體植核時受到強(qiáng)烈刺激，導(dǎo)致機(jī)體大量基因發(fā)生變化以應(yīng)對植核手術(shù)，這與雷倩楠[14]的結(jié)果相似。雷倩楠[14]對馬氏珠母貝植核后不同時期血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，與植核前相比，植核后5、10、15、20、60 d分別有3 345、6 846、4 636、4 167、4 716、6 679個差異基因。對植核前后轉(zhuǎn)錄組分析獲得的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)許多與非特異性免疫相關(guān)基因，包括凝集素、Toll樣受體、HSP70蛋白等發(fā)生顯著變化，說明這些基因在植核后的免疫反應(yīng)中發(fā)揮了作用。

凝集素是一類糖結(jié)合蛋白，廣泛存在于雙殼貝類中，并誘導(dǎo)機(jī)體摧毀病原物并激活免疫反應(yīng)[25-29]。Fisher等[26]研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣、蛤等貝類體內(nèi)的凝集素可凝集多種脊椎動物的紅細(xì)胞。Tunkijjanukij等[30]從馬貽貝（）血淋巴中得到一種可特異性結(jié)合脂多糖（LPS）的凝集素，該凝集素經(jīng)純化后對多種海洋細(xì)菌均表現(xiàn)出抗菌活性。C-型凝集素（CTL）作為凝集素的一種，在貝類免疫防御中發(fā)揮重要作用，主要功能有促進(jìn)機(jī)體對入侵異物的識別和吞噬，凝集細(xì)菌和抵抗病毒感染、防止病原蔓延，激活免疫系統(tǒng)等[31]。本研究中，在植核前后的表達(dá)有顯著性差異（差異倍數(shù)大于2，且、均小于0.01），進(jìn)一步表明該基因?qū)ω愺w受傷后免疫機(jī)能的調(diào)控作用。

熱休克蛋白參與多種免疫應(yīng)答及調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，以應(yīng)對環(huán)境壓力[32]。Gao等[35]發(fā)現(xiàn)，在感染弧菌（）6 h后，海灣扇貝（表達(dá)水平達(dá)到峰值，48 h后恢復(fù)到正常水平。Wei等[16]用大珠母貝（）外套膜做小片，對植核后的馬氏珠母貝進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)在植核0 ~ 9 h時顯著高表達(dá)。Wang等[12]用iTRAQ技術(shù)比較馬氏珠母貝植核后4個時期血細(xì)胞蛋白變化，發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白等諸多免疫相關(guān)蛋白發(fā)生顯著變化以應(yīng)對植核手術(shù)。本研究亦發(fā)現(xiàn)，金黃殼色群體植核后3 d，和均發(fā)生上調(diào)，以應(yīng)對植核手術(shù)對貝體的刺激。

TLR4 可參與植核移植反應(yīng)，且TLR4高表達(dá)出現(xiàn)在植核后2 d[17]。研究發(fā)現(xiàn)，馬氏珠母貝Toll-like 受體基因PmTLR6在植核后5和10 d表達(dá)水平無顯著性變化，15和20 d表達(dá)量呈上升趨勢，于30 d達(dá)到最大值，約為空白對照組（0 d）的5倍，說明PmTLR6可能在馬氏珠母貝免疫防御反應(yīng)中擔(dān)任著重要角色[36]。Wei等[13]對植核后不同時期血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，TLR在植核后48 h顯著高表達(dá)。本研究中，TLR在植核后3 d，多個TLR基因發(fā)生上調(diào)，參與植核育珠手術(shù)后的免疫應(yīng)答，同時存在一些TLR發(fā)生顯著下調(diào)，因此TLR基因應(yīng)對植核手術(shù)的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

在雙殼類中，TLR/NF-κB信號通路負(fù)責(zé)促進(jìn)免疫應(yīng)答的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[37]。TLRs識別配體可激活關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子并與MyD88相互作用，從而釋放白細(xì)胞介素（ILS）、抗菌肽、溶菌酶和其他抗病原體感染的免疫基因。NFκB通路是一種細(xì)胞內(nèi)信號通路，在雙殼類中，MyD88能激活轉(zhuǎn)錄因子，從而誘導(dǎo)細(xì)菌和病毒感染的急性時相反應(yīng)并控制促炎特性、效應(yīng)分子和細(xì)胞因子的表達(dá)[38-40]。本研究中，植核后NF-κB信號通路被顯著富集，并且基因在植核前后差異顯著說明TLR/NF-κB信號通路在植核后免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。該結(jié)果與Wei等[13]的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果相一致。

4 結(jié)語

本研究利用轉(zhuǎn)錄組對金黃殼色群體植核前后育珠貝的血細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)植核后有2 925個基因顯著上調(diào)，有3 097個基因顯著下調(diào)，其中包括免疫相關(guān)基因凝集素、Toll樣受體、熱休克蛋白等。對差異基因進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，免疫相關(guān)通路細(xì)胞DNA傳感途徑，白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移等參與金黃殼色群體的植核育珠免疫反應(yīng)。本研究為殼色育珠提供參考資料。

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Screening of Immune Related Genes of Yellow Colored Line ofAfter Nucleus Insertion Operation by Transcriptome Analysis

WANG Zhe1, WANG Zi-man1, HAO Rui-juan1, LI Jun-hui1, DENG Yue-wen1,2

（1.,,524088,2.,524088,）

To investigate the immune-related genes and metabolic pathways of yellow colored line ofafter nuclear insertion operation.The cDNAs were used to construct the transciptome for the analyis of the blood cells of the cultivar before and after nucleus insertion operation.61.78 × 106and 62.68 × 106high quality Reads were obtained respectively and the average mapping rates to the reference genome were 70.16% and 67.82%, respectively. Compared with that before nuclear insertion, 2925 and 3097 genes were significantly up-regulated and down-regulated (Fold Change≥2 and Adjustedvalue≤0.001), including immune-related genes, such as lectin, Toll-like receptor, heat shock protein and so on. The differential genes were classified by GO and divided into three categories: molecular function, cell component and biological process. They were subdivided into 11 subcategories, among which there were more genes with binding and catalytic functions. KEGG classification analysis of differential genes showed that genes-involved KEGG metabolic pathway can be divided into six branches: cellular processes, environmental information processing, genetic information processing, and human disease (animals only), metabolism and organismal systems. The results of KEGG enrichment showed that Cytosolic DNA-sensing pathway, Leukocyte transendothelial migration was significantly enriched in immune related pathway.

; Yellow colored line; Transcriptome; immune-related genes

Q78

A

1673-9159（2019）06-0009-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.06.002

2019-03-21

國家貝類產(chǎn)業(yè)體系專項（CARS-049）；廣東省科技廳項目（2017A030303076）

王哲（1989―），女，碩士研究生，研究方向為水產(chǎn)無脊椎動物生物學(xué)。Email:2262891416@qq.com

鄧岳文（1975―），男，博士，教授，珍珠貝遺傳育種與養(yǎng)殖。Email: dengyw@gdou.edu.cn

王哲，王姿曼，郝瑞娟，等. 馬氏珠母貝金黃殼色選育群體植核后差異表達(dá)免疫基因篩選[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2019，39（6）：9-16.

（責(zé)任編輯：劉慶穎）