梁文 楊鎮(zhèn)州 李妍 羅超 聞艷麗 劉剛

摘要：針對進(jìn)出口貿(mào)易中涉及較多的轉(zhuǎn)基因玉米MON89034、MON810、MIR162品系，研究一套雙重?cái)?shù)字PCR（dPCR）定量檢測方法，包括引物探針的序列設(shè)計(jì)和濃度，DNA模板濃度，PCR反應(yīng)過程的時(shí)間、溫度等。該方法的定量限為0.1%，轉(zhuǎn)基因定量檢測范圍覆蓋0.1%～100%，線性系數(shù)為0.999，精密度優(yōu)于10%。該檢測方法中，每個(gè)微反應(yīng)體系都含有兩套引物探針，分別用FAM和VIC熒光通道進(jìn)行檢測，能實(shí)現(xiàn)內(nèi)外源基因的同時(shí)檢測，避免同一樣品因取樣不一致造成的定量差異。該方法可以同時(shí)應(yīng)用到市面上最常用微滴dPCR平臺和3D芯片dPCR平臺，且兩種方法定量結(jié)果一致性好。

關(guān)鍵詞：生物技術(shù);數(shù)字PCR;雙重?cái)?shù)字PCR;轉(zhuǎn)基因玉米

中圖分類號：0503 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1674-5124（2019）06-0070-07

收稿日期：2019-01-02;收到修改稿日期：2019-03-18

基金項(xiàng)目：國家科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目（2018ZX0801112B）;國家自然科學(xué)面上基金項(xiàng)目（21775104）;上海市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科研項(xiàng)目（2017-03）

作者簡介：梁文（1986-），女，四川德陽市人，工程師，碩士，主要從事轉(zhuǎn)基因檢測方法研究、核酸定量方法研究。

通信作者：劉剛（1982-），男，山東青島市人，教授級高工，博士，主要從事核酸檢測方法研究。

0 引言

隨著生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，全球轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)速度和面積持續(xù)增加，轉(zhuǎn)基因的食品安全問題也成為世界關(guān)注的熱點(diǎn)[1]。控制轉(zhuǎn)基因的含量，實(shí)施轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識制度是各國加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因管理的重要舉措。轉(zhuǎn)基因檢測方法分核酸檢測和蛋白檢測兩類。核酸在生物細(xì)胞中含量相對穩(wěn)定，在產(chǎn)品加工中也相對不容易被破壞，而且核酸檢測方法靈敏度高、操作簡便，因此成為轉(zhuǎn)基因檢測的主流方法[2]。常用的核酸檢測手段包括等溫?cái)U(kuò)增、普通PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-timefluoresence quantitative，qPCR）、數(shù)字PCR（dPCR）等方法[3]。目前常用的qPCR法可以篩選轉(zhuǎn)基因特異DNA片段，但大多數(shù)的qPCR在轉(zhuǎn)基因檢測方法的應(yīng)用還停留在定性階段[4]。

dPCR作為一種新的PCR技術(shù)在各檢測領(lǐng)域發(fā)展迅猛，尤其在轉(zhuǎn)基因定量檢測方面有獨(dú)特優(yōu)勢。dPCR的技術(shù)特點(diǎn)是，不需要建立工作曲線，避免了標(biāo)準(zhǔn)品配制過程及標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品的天然差異導(dǎo)致的偏差[5]。dPCR采用終點(diǎn)熒光檢測，微小反應(yīng)單元的獨(dú)立擴(kuò)增不易受到轉(zhuǎn)基因樣品DNA提取過程中抑制物的影響[6]。dPCR定量準(zhǔn)確度高，對于痕量轉(zhuǎn)基因DNA樣品檢測重復(fù)性好[7]。在dPCR檢測體系中設(shè)計(jì)雙重?zé)晒鈾z測，分別用于標(biāo)記外源基因和內(nèi)源基因，可以實(shí)現(xiàn)內(nèi)外源基因的雙重檢測，進(jìn)一步避免加樣誤差的同時(shí)降低了檢測成本，提高了檢測效率。

本文在轉(zhuǎn)基因玉米品系MON89034，MON810，MIR162定量檢測體系中實(shí)現(xiàn)了內(nèi)源基因和外源基因的同時(shí)檢測，通過一個(gè)反應(yīng)直接得出外源基因和內(nèi)源基因的拷貝數(shù)，進(jìn)而給出外源基因和內(nèi)源基因的拷貝數(shù)濃度的比，即轉(zhuǎn)基因的含量[8]。目前，市面上的dPCR分為微滴PCR和芯片PCR兩大類。兩者在獨(dú)立的PCR反應(yīng)微小單元形成方式，加熱介質(zhì)方面各有不同。本文首先在芯片dPCR平臺上建立了實(shí)驗(yàn)方法，考察其特異性、定量限和線性范圍、精密度。最后將該方法應(yīng)用到微滴dPCR中，考察了兩種平臺的結(jié)果一致性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

植物基因組DNA提取試劑盒（天根DP305，北京）;引物及探針（佰力格，上海）;3D數(shù)字PCR系統(tǒng)（QuantStudio^TM3D，ABI公司）;微滴數(shù)字PCR（QX200，伯樂公司）;核酸定量儀（Nanodrop2000，thermo公司）。

轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：轉(zhuǎn)基因玉米種子粉末MON810（ERM-BF413gk），轉(zhuǎn)基因玉米種子粉末MON89034（AOCS 0906-E），轉(zhuǎn)基因玉米種子粉末MIR162（AOCS1208-A），種子粉末均為F1代雜合子。

1.2 轉(zhuǎn)基因DNA的抽提

用TIANGEN公司的植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行玉米基因組DNA的抽提。在抽提過程中需要用到酚氯仿，以有效去除玉米材料中的多糖和多酚成分。抽提結(jié)束后用核酸定量儀定量DNA的濃度，要求其A260/A280在1.8～2.0之間。

1.3 DNA模板濃度的控制

dPCR法的模板DNA濃度受到泊松分布原理的限制，即大量微反應(yīng)單元（10000以上）中，DNA模板的分布應(yīng)具備隨機(jī)性。由于目前市售dPCR的微反應(yīng)單元數(shù)量都至少高于10000個(gè)，在保證定量結(jié)果的重復(fù)性優(yōu)于25%的條件下，要滿足定量限達(dá)到0.1%，則模板DNA濃度應(yīng)保證上樣體系中總DNA模板數(shù)（內(nèi)源基因拷貝數(shù)）在4700～73551拷貝范圍內(nèi)[9]。從而避免低轉(zhuǎn)基因含量樣本出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因片段漏取樣的情況，也避免DNA拷貝數(shù)過高，陽性過載使數(shù)據(jù)精確度下降的情況。

1.4 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

3種玉米品系的內(nèi)源基因均采用Adh-1基因?yàn)闄z測靶基因，外源基因選擇每個(gè)玉米品系的特異性序列[10-11]，引物探針的序列見表1。以轉(zhuǎn)基因樣品MON89034為例，用實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)檢驗(yàn)設(shè)計(jì)引物探針的特異性。在含轉(zhuǎn)基因MON89034外源基因的引物探針或內(nèi)源基因Adh-1引物探針的PCR反應(yīng)體系中，分別加入轉(zhuǎn)基因玉米MIR162品系、MON810品系、玉米GA21品系、玉米TC1507品系、玉米T25品系、玉米NK603品系、轉(zhuǎn)基因玉米MON89034品系和非轉(zhuǎn)基因玉米的基因組DNA，驗(yàn)證該引物探針體系是否只針對MON89034基因組有品系特異性外源基因擴(kuò)增曲線，其他樣品僅有內(nèi)源基因擴(kuò)增。每個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米品系的芯片dPCR反應(yīng)體系（總體積為20μL）中，內(nèi)外源基因的正反向引物終濃度均為500nmol/L，探針終濃度為100nmol/L。Master mix體積為10μL，H₂O體積為3.2μL。3D芯片dPCR的反應(yīng)條件為酶激活和預(yù)變性階段：96℃，10min;循環(huán)擴(kuò)增階段：60℃/2min，98℃/30s，共40個(gè)循環(huán)。升溫速率為0.8℃/s，降溫速率為1.2℃/s。

1.5 定量限和線性范圍驗(yàn)證

定量檢測低限是指被檢測的樣品在合適的精度水平下（一般轉(zhuǎn)基因定量檢測要求RSD小于25%），能被檢測出的最低含量或濃度[12]。本文將轉(zhuǎn)基因含量為100%的轉(zhuǎn)基因玉米品系MON89034與陰性的玉米種子粉末進(jìn)行混合，制成10%、5%、1%、0.5%、0.1%的樣品，驗(yàn)證其轉(zhuǎn)基因含量檢測的定量限和線性范圍。

1.6 精密度實(shí)驗(yàn)

dPCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是通過統(tǒng)計(jì)上萬個(gè)微小反應(yīng)單元的結(jié)果得出，重復(fù)性好。精密度實(shí)驗(yàn)方案為在相同的PCR反應(yīng)體系中分別加入相同的基因組DNA樣品（選擇了1%、10%、100%轉(zhuǎn)基因含量的3種樣品），實(shí)驗(yàn)重復(fù)8次，統(tǒng)計(jì)8次檢測結(jié)果的RSD。

1.7 玉米品系混合樣品檢測

采用雙盲樣驗(yàn)證法，由實(shí)驗(yàn)室不同人員利用1.1中轉(zhuǎn)基因玉米種子粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)按照質(zhì)量配比配制成玉米品系混合樣品，然后按照1.2中的方法提取斟建且DNA。盲樣1為含25%玉米MIR162和50%玉米MON89034混合樣品，盲樣2為含50%玉米MIR162和4%玉米MON810混合樣品，分別由轉(zhuǎn)基因玉米MIR162，MON89034和MON810的擴(kuò)增體系對混合DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證3個(gè)不同玉米品系數(shù)字PCR方法定量檢測混合樣本的準(zhǔn)確性。

1.8 微滴dPCR和芯片dPCR結(jié)果的一致性驗(yàn)證

將1.1中轉(zhuǎn)基因玉米種子粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)寄送給兩家不同公司，進(jìn)行DNA提取實(shí)驗(yàn)和dPCR實(shí)驗(yàn)。在微滴dPCR與芯片dPCR實(shí)驗(yàn)中采用相同的PCR反應(yīng)體系（相同的引物探針濃度，但PCR預(yù)混液Master mix不同，與儀器配套使用），選擇與平臺相適應(yīng)的PCR反應(yīng)程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每種平臺實(shí)驗(yàn)重復(fù)8次，用T-test比較兩種方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，判斷是否具有顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 反應(yīng)條件的建立

本文中所設(shè)計(jì)的引物探針僅對特定玉米品系有明顯的擴(kuò)增曲線，對非目標(biāo)玉米品系無擴(kuò)增。在芯片dPCR中，所有玉米品系都同時(shí)進(jìn)行外源基因和玉米內(nèi)源基因的擴(kuò)增。為了避免可能出現(xiàn)的兩個(gè)靶基因的擴(kuò)增體系相互干擾，本文設(shè)計(jì)了多個(gè)內(nèi)源基因和外源基因的引物探針進(jìn)行配對，選出內(nèi)外源基因都能正常擴(kuò)增且兩種熒光信號彼此不干擾的擴(kuò)增體系。每種轉(zhuǎn)基因玉米的擴(kuò)增圖見圖1。研究結(jié)果表明，3個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米品系的內(nèi)外源基因可以在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行，且陰性反應(yīng)孔和陽性反應(yīng)孔的熒光信號能明顯區(qū)分。

2.2 線性范圍和定量限檢測結(jié)果

將轉(zhuǎn)基因含量為100%的轉(zhuǎn)基因玉米品系MON89034與陰性的玉米進(jìn)行混合，制成10%、5%，1%、0.5%、0.1%的種子粉末樣品。提取樣品的基因組DNA并進(jìn)行dPCR的擴(kuò)增。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)檢測，取3次檢測的平均值作為定值結(jié)果。擴(kuò)增結(jié)果顯示，本方法檢測0.1%轉(zhuǎn)基因含量的種子樣品時(shí)RSD為12.5%。本方法檢測轉(zhuǎn)基因含量0.1%及以上的樣品RSD小于25%，即本方法定量限可達(dá)到0.1%。檢測轉(zhuǎn)基因含量標(biāo)準(zhǔn)值為0.1%～100%的種子樣品，檢測結(jié)果方程為Y=1.042X-0-002，其中X為轉(zhuǎn)基因含量標(biāo)準(zhǔn)值，Y為轉(zhuǎn)基因含量實(shí)際檢測值，線性r²為0.999。具體檢測結(jié)果見表2。

2.3 方法精密度檢測

用轉(zhuǎn)基因含量為100%、10%、1%的轉(zhuǎn)基因玉米MON89034基因組DNA測試方法的精密度，重復(fù)測量8次，檢測結(jié)果精密度見表3。不同轉(zhuǎn)基因比例的精密度均優(yōu)于10%，符合國際上轉(zhuǎn)基因定量結(jié)果RSD優(yōu)于25%的要求。

2.4 混合種子粉末樣品檢測結(jié)果

在盲樣檢測中，25%玉米MIR162混合樣品的定量結(jié)果為19.6%，50%玉米MON89034混合樣品的定量結(jié)果為66.7%，50%玉米MIR162混合樣品的定量結(jié)果為64.7%，4%玉米MON810混合樣品的定量結(jié)果為3_3%，定量結(jié)果的誤差均小于25%，符合國家轉(zhuǎn)基因定量檢測的需要。

2.5 兩種平臺實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性驗(yàn)證

dPCR主要有微滴式和芯片式兩種平臺，微小反應(yīng)單元的形成方式有差異。微滴dPCR中微滴在PCR反應(yīng)前由微滴振蕩器現(xiàn)場生成，芯片dPCR的微孔大小在制造芯片時(shí)已經(jīng)確定。微滴dPCR是在油包水的液體中進(jìn)行反應(yīng)，加熱速度快，PCR反應(yīng)中的退火溫度、時(shí)間和芯片式dPCR有所區(qū)別。芯片dPCR由于芯片的影響，熱傳導(dǎo)時(shí)間較慢，因此芯片dPCR中60℃退火延伸的時(shí)間較長，需要2min。而微滴PCR在油包水的液體條件下擴(kuò)增，退火溫度在56℃反而能到達(dá)更好的擴(kuò)增效果，擴(kuò)增時(shí)間為1min，圖2為微滴PCR退火溫度的優(yōu)化情況，MON89034品系特異基因擴(kuò)增優(yōu)化情況見圖A，圖B。圖A陰性（黑色）信號值在5000～6500之間，陽性（藍(lán)色）信號在6000～10000之間，陰性和陽性信號不能明顯區(qū)分。圖B優(yōu)化退火溫度后，陰性信號在1000～2000之間，而陽性信號在6000～8000之間，阻性和陽性信號分離情況好。內(nèi)源基因Adh-1的擴(kuò)增情況見圖C、D。圖C和圖D中陰性孔的熒光值（黑色）沒有變化，陽性孔的熒光信號值（藍(lán)色）在優(yōu)化后由3000提高到3500～4000，最終陰性和陽性反應(yīng)孔的熒光值分離情況更好。微滴dPCR的反應(yīng)條件為：酶激活和預(yù)變性階段：95℃，10min;循環(huán)擴(kuò)增階段：56℃/1min，94℃/30s，共40個(gè)循環(huán)。

將3種轉(zhuǎn)基因玉米粉末交給兩家不同公司進(jìn)行玉米基因組DNA的提取和dPCR檢測實(shí)驗(yàn)。3種轉(zhuǎn)基因玉米品系在兩種平臺的檢測結(jié)果見表4。盡管由于提取DNA濃度不同，兩種平臺的拷貝數(shù)濃度有差異，但其轉(zhuǎn)基因含量定量結(jié)果的一致性很好。轉(zhuǎn)基因含量100%的轉(zhuǎn)基因玉米MON89034，芯片dPCR和微滴dPCR的定量結(jié)果分別為105.6%和106.5%，將兩種檢測方法的結(jié)果進(jìn)行T一檢驗(yàn)，其顯著性差異P=0.58>0.05，證明兩種方法的檢測結(jié)果沒有顯著性差異。轉(zhuǎn)基因含量為10%的轉(zhuǎn)基因玉米MON810，芯片dPCR和微滴dPCR的定量結(jié)果分別為9.7%和9.5%，顯著性差異P=0.38>0.05。轉(zhuǎn)基因含量100%的轉(zhuǎn)基因玉米MIR162，芯片dPCR和微滴dPCR的定量結(jié)果分別為114.2%和115.8%，顯著性差異P=0.39>0.05。3種轉(zhuǎn)基因玉米用兩種不同平臺檢測結(jié)果的T-檢驗(yàn)表明，兩種平臺的檢測結(jié)果沒有顯著性差異。

3 結(jié)束語

dPCR定量檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的靈敏度高，特異性好，可以應(yīng)用于更多不同轉(zhuǎn)基因植物品系的定量檢測。本文針對進(jìn)出口貿(mào)易中涉及最多的3個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米品系MON89034，MON810，MIR162設(shè)計(jì)引物探針進(jìn)行dPCR定量檢測。通過對不同玉米品系的qPCR實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了用于3個(gè)玉米品系檢測的引物與探針的特異性。在qPCR實(shí)驗(yàn)中具有特異性的內(nèi)外源基因的引物探針有多種，但能應(yīng)用在dPCR同一個(gè)反應(yīng)微小單元中，并且內(nèi)外源基因的擴(kuò)增體系不相互干擾卻并不容易，很常見的現(xiàn)象是內(nèi)源或外源基因的擴(kuò)增受到抑制，從而陰性反應(yīng)孔和陽性反應(yīng)孔的熒光信號無法區(qū)分，因此不能將qPCR中的反應(yīng)條件直接應(yīng)用到dPCR中。本文通過多對引物探針組合，并篩選最佳引物探針濃度、退火溫度、PCR反應(yīng)過程的時(shí)間、溫度等，從而建立一套完整的轉(zhuǎn)基因玉米dPCR定量檢測方法。該檢測方法中，每個(gè)微反應(yīng)體系都含有兩套引物探針，分別用FAM和VIC熒光通道進(jìn)行檢測，能實(shí)現(xiàn)內(nèi)外源基因的同時(shí)檢測，避免了同一樣品因取樣不一致造成的定量差異，從而節(jié)約了檢測成本。該方法可以同時(shí)應(yīng)用到市面上最常用微滴dPCR平臺和3D芯片dPCR平臺。兩種平臺的加熱介質(zhì)有很大的差異，芯片dPCR是金屬腔室，其微小反應(yīng)單位的體積變動較小，但熱傳導(dǎo)性略慢，因此退火延伸需要的時(shí)間較長，和 qPCR實(shí)驗(yàn)有很大的差異。而微滴dPCR是油包水的液滴，其反應(yīng)的程序和qPCR實(shí)驗(yàn)基本一致，這樣也利于用qPCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行PCR反應(yīng)程序優(yōu)化。但優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件后兩種平臺的結(jié)果一致性很好，T-test中3種轉(zhuǎn)基因玉米品系的轉(zhuǎn)基因含量平均值和重復(fù)性RSD沒有顯著性差異。該方法的定量限為0.1%，轉(zhuǎn)基因定量檢測范圍覆蓋0.1%～100%，線性系數(shù)為0.999，精密度優(yōu)于10%。該方法快速高效，在檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性優(yōu)于傳統(tǒng)的qPCRa在實(shí)驗(yàn)操作上，和qPCR相比不需要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，避免購買昂貴的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，也避免了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和檢測樣品之間的PCR擴(kuò)增效率差異對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。將該方法用于轉(zhuǎn)基因玉米的定量檢測，能為規(guī)范我國轉(zhuǎn)基因監(jiān)管工作提供技術(shù)支撐。

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（編輯：莫婕）