趙煒 趙志正

摘要：目的? 觀察五味子乙素對人乳腺癌細(xì)胞增殖及Notch-1信號通路的影響，探討其抑制乳腺癌發(fā)展的可能分子機制。方法? 不同濃度五味子乙素（0、20、40、80 μmol/L）處理乳腺癌細(xì)胞MCF-7，作用24、48、72 h后，CCK-8法檢測MCF-7細(xì)胞增殖。裸鼠皮下接種MCF-7細(xì)胞建立裸鼠乳腺癌移植瘤模型，隨機分為對照組和五味子乙素組，每4 d測量腫瘤體積并繪制腫瘤生長曲線，32 d后取腫瘤稱重。Western blot檢測MCF-7細(xì)胞和腫瘤組織Notch-1及其下游分子Hes-1、Hey-1蛋白水平;免疫組化檢測小鼠腫瘤組織Notch-1的表達(dá)。結(jié)果? 與空白組比較，五味子乙素顯著抑制MCF-7細(xì)胞生長，且抑制作用具有時間和濃度依賴性，同時顯著降低MCF-7細(xì)胞Notch-1及其下游分子Hes-1、Hey-1蛋白的表達(dá)。與對照組比較，五味子乙素組裸鼠腫瘤體積及質(zhì)量明顯受抑制，且腫瘤組織Notch-1及其下游分子Hes-1、Hey-1蛋白表達(dá)顯著降低。結(jié)論? 五味子乙素可抑制乳腺癌發(fā)展，其機制可能與抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7及其裸鼠模型移植瘤的生長、降低Notch-1信號通路相關(guān)因子表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：五味子乙素;細(xì)胞增殖;Notch-1;移植瘤;乳腺癌細(xì)胞MCF-7;小鼠

中圖分類號：R285.5??? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）10-0055-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.10.013????? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： Objective To explore the effects of schisandrin B on the growth of MCF-7 and Notch-1 signaling pathway in breast cancer; To explore possible molecular mechanism that inhibit the development of breast cancer. Methods Human breast cancer cell MCF-7 was treated with different concentrations of schisandrin B （0， 20， 40， 80 μmol/L） for 24， 48， 72 h. CCK-8 assay was used to detect cell growth. Nude mice breast cancer xenograft models were established by subcutaneous inoculation of MCF-7 cells in nude mice and were randomly divided into the control group and the schisandrin B treatment group. Tumor volume was measured every 4 days and the tumor growth curve was drawn. After 32 days， the tumor was weighed. The expressions of Notch-1， Hes-1， Hey-1 in MCF-7 cells and tumor tissues were detected by Western blot. Immunohistochemistry was used to detect the expression of Notch-1 in tumor tissues. Results Compared with the blank group， schisandrin B significantly inhibited the growth of MCF-7 cells in a time- and concentration-dependent manner， and significantly decreased the expression of Notch-1 and its downstream molecules Hes-1 and Hey-1 in MCF-7 cells. Compared with the control group， the tumor volume and quality of the schisandrin B treatment group were significantly inhibited， and the expression of Notch-1 and its downstream molecules Hes-1 and Hey-1 significantly decreased. Conclusion Schisandrin B can inhibit the growth of breast cancer， and its mechanism can be related to inhibiting the growth of breast cancer cells MCF-7 and its nude mouse model， and decreasing the expression of Notch-1 signaling pathway.

Keywords： schisandrin B; cell proliferation; Notch-1; xenografted tumor ; breast cancer cell MCF-7; mice

乳腺癌是發(fā)生在女性中最常見腫瘤之一，是女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。近年來，隨著診斷學(xué)尤其是癌癥分子生物學(xué)和基因組學(xué)領(lǐng)域的進步，乳腺癌檢測發(fā)生了革命性的變化[2]。目前，治療乳腺癌主要方法包括外科手術(shù)、化療、放療，大大改善了乳腺癌的預(yù)后，但仍有許多患者復(fù)發(fā)及在治療過程中出現(xiàn)不良反應(yīng)和耐藥。因此，尋找有效治療乳腺癌的藥物，成為當(dāng)前研究的重點。五味子乙素（Schisandrin B）是從五味子中分離得到的主要生物活性成分[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，五味子乙素在多種疾病中介導(dǎo)多種生物活性，包括抗炎、抗氧化和心血管保護作用[4-6]。有報道顯示，五味子乙素可抑制膽管癌、肺腺癌、膠質(zhì)瘤、胃癌細(xì)胞增殖[7-10]，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減弱腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。本研究分別通過細(xì)胞與動物實驗，觀察五味子乙素對人乳腺癌細(xì)胞增殖及Notch-1信號通路表達(dá)的影響，探討其可能的分子機制。

1? 實驗材料

1.1? 動物

SPF級雌性Balb/C小鼠10只，6～8周，體質(zhì)量18～20 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。飼養(yǎng)于溫度（20±2）℃、相對濕度（50±5）%環(huán)境，日照時間12 h，自由攝食飲水。實驗前小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.2? 藥物

五味子乙素，南京道斯夫生物科技有限公司，溶于二甲基亞砜并配制成100 mmol/L貯備液保存。

1.3? 細(xì)胞

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供，在本實驗室進行培養(yǎng)。

1.4? 主要試劑與儀器

杜爾伯科改良伊格爾（DMEM）培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清，美國Gibco公司;青/鏈霉素，美國Sigma公司;BCA法蛋白濃度檢測試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)公司;抗Notch-1抗體、抗Hes-1抗體、抗Hey-1抗體、抗β-actin抗體和辣根過氧化物標(biāo)記的二抗，英國Abcam公司;CCK-8試劑盒，上海博谷生物科技有限公司。超低溫冰箱（日本Sanyo公司），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），低速離心機（美國Thermo公司），電泳儀（北京六一生物科技有限公司），凝膠成像儀（美國Azure Biosystems公司）。

2? 實驗方法

2.1? 細(xì)胞培養(yǎng)

MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、含5%CO2且濕度完全飽和的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期取對數(shù)生長期細(xì)胞進行傳代。

2.2? CCK-8實驗

用于檢測細(xì)胞增殖并計算增殖抑制率。100 μL對數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞（1×105/孔）接種于96孔板，每組設(shè)置4個復(fù)孔，共4組，加入終濃度為0、20、40、80 μmol/L五味子乙素，培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入CCK-8試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使用分光光度計檢測波長450 nm處吸光度，計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-給藥組A450÷對照組A450）×100%。

2.3? 乳腺癌細(xì)胞移植瘤裸鼠模型建立

用PBS將對數(shù)期乳腺癌細(xì)胞MCF-7濃度調(diào)整為2×107/mL，取0.1 mL懸液注射于小鼠右后側(cè)肢體皮下，接種后觀察1周成瘤，將10只成瘤小鼠隨機分為對照組和五味子乙素組，每組5只。五味子乙素組小鼠腹腔注射五味子乙素，每2 d注射1次，直至細(xì)胞接種后32 d，每次100 mg/kg，體積0.2 mL;對照組注射等體積PBS。每4 d用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑和短徑，腫瘤體積=長徑×短徑2÷2。細(xì)胞接種32 d，處死裸鼠，稱取瘤重，計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（對照組瘤體平均質(zhì)量-給藥組瘤體平均質(zhì)量）÷對照組瘤體平均質(zhì)量×100%。腫瘤組織置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4? Western blot檢測

MCF-7細(xì)胞用預(yù)冷的細(xì)胞裂解液裂解15 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液，收取蛋白。腫瘤組織先用液氮進行研磨，然后加入細(xì)胞裂解液，離心后獲得腫瘤組織蛋白。BCA比色法計算蛋白濃度，通過SDS-PAGE將蛋白進行分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，隨后用5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h，根據(jù)說明書稀釋一抗，利用封閉液將抗體稀釋到所需濃度，4 ℃孵育過夜，用TBST洗滌3次×5 min，隨后根據(jù)用量，稀釋HRP標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h。用TBST洗滌3次×5 min。用ECL化學(xué)發(fā)光檢測，用Image J對圖像進行灰度分析。

2.5? 免疫組化檢測

脫蠟、水化后切片，經(jīng)1%Triton X-100處理15 min，再用3%H2O2處理10 min，隨后加入Notch-1抗體孵育，置于濕盒4 ℃過夜，第2日清洗后孵育對應(yīng)的二抗，室溫30 min，最后進行染色封片。染色結(jié)果采用DAB顯色法進行觀察，使用蘇木精進行對比染色。

3? 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，用方差分析進行比較，兩組間比較用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4? 結(jié)果

4.1? 五味子乙素對乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響

經(jīng)不同濃度五味子乙素（0、20、40、80 μmol/L）處理的乳腺癌MCF-7細(xì)胞，其對乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用具有時間和濃度依賴性，細(xì)胞抑制率隨五味子乙素濃度增加和處理時間的延長而增加。結(jié)果見表1。

4.2? 五味子乙素對乳腺癌MCF-7細(xì)胞Notch-1信號通路相關(guān)因子表達(dá)的影響

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