馬春林 吳紅彥 蘭美華 程堅(jiān) 段永強(qiáng)

摘要：目的? 觀察黑逍遙散對(duì)阿爾茨海默?。ˋD）小鼠海馬神經(jīng)元Ca2+濃度和鈣調(diào)蛋白（CaM）、鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱα（CaMKⅡα）表達(dá)的影響。方法? 30只APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因雄性小鼠稱重后，按隨機(jī)原則分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和黑逍遙散組，每組10只。另取10只同月齡、同種系野生型C57BL/6雄性小鼠為空白組。各給藥組給予相應(yīng)藥物干預(yù)，連續(xù)3個(gè)月，采用鈣熒光探針結(jié)合激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測(cè)海馬神經(jīng)元Ca2+濃度，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化技術(shù)分別檢測(cè)小鼠海馬區(qū)CaM、CaMKⅡα基因和蛋白的表達(dá)。結(jié)果? 與空白組比較，模型組小鼠海馬神經(jīng)元Ca2+濃度顯著升高，CaM基因和蛋白表達(dá)顯著升高，CaMKⅡα基因和蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01，P<0.05）;與模型組比較，各給藥組小鼠海馬神經(jīng)元Ca2+濃度顯著降低，CaM基因和蛋白表達(dá)顯著降低，CaMKⅡα基因和蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01，P<0.05）。結(jié)論? 黑逍遙散通過(guò)調(diào)節(jié)模型小鼠海馬Ca2+-CaM/CaMKⅡα信號(hào)通路關(guān)鍵因子表達(dá)而發(fā)揮防治AD的作用。

關(guān)鍵詞：黑逍遙散;阿爾茨海默病;海馬組織;Ca2+濃度;鈣調(diào)蛋白;鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱα;小鼠

中圖分類號(hào)：R285.5??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）10-0050-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.10.012????? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Objective To observe the effects of Heixiaoyao Powder on the concentration of Ca2+ and expressions of calmodulin， CaMKⅡα αgenes or proteins in the hippocampus neurons of Alzheimer disease （AD） mice. Methods After weighing， 30 APP/PSI genetically modified mice were randomly divided into model group， positive medicine control group， and Heixiaoyao Powder groups， with 10 mice in each group. Ten wild-type C57BL/6 male mice of the same age and same species were set as blank group. Each administration group was given relevant medicine. After three-month successive gavage， calcium fluorescence probe combined with laser confocal microscopy was used to detect the Ca2+ concentration in hippocampal neurons， and real-time quantitative PCR and immuno- histochemistry were used to detect the expressions of CaM and CaMKⅡα genes and proteins in hippocampus of mice. Results Compared with the blank group， the Ca2+ concentration in the hippocampal neurons of the model group significantly increased， and the expressions of CaM gene and protein were significantly increased， while the expressions of CaMKⅡα gene and protein were decreased （P<0.01， P<0.05）. Compared with the model group， the concentration of Ca2+ in hippocampal neurons of mice significantly decreased. The expressions of CaM gene and protein were significantly decreased， while the expressions of CaMKⅡα gene and protein were significantly increased （P<0.01， P<0.05）. Conclusion Heixiaoyao Powder can prevent and treat AD by regulating the concentration of Ca2+-CaM/CaMKⅡα signal pathway in the hippocampus of model mice.

Keywords： Hei Xiaoyao Powder; Alzheimer disease; hippocampus; Ca2+; CaM; CaMKⅡα; mice

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種增齡性的神經(jīng)退化性疾病，以大腦皮層退化導(dǎo)致記憶力、判斷力、抽象思維力、推理能力及情感反應(yīng)障礙和性格改變?yōu)橹饕R床特征[1]。據(jù)報(bào)道，目前全世界癡呆患者約有4680萬(wàn)人，而我國(guó)占比超過(guò)l/4，隨著我國(guó)老齡化趨勢(shì)的加速，如缺乏有效防治措施，AD患者必將迅速增加[2]。研究表明，AD發(fā)病時(shí)腦神經(jīng)元存在鈣穩(wěn)態(tài)失衡[3]。Ca2+/CaM-CaMKⅡ-CREB是中樞神經(jīng)系統(tǒng)學(xué)習(xí)記憶形成與維持的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[4]，其中Ca2+是一種重要的第二信使，參與多種細(xì)胞生理生化過(guò)程[5];鈣調(diào)蛋白（CaM）是胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子，與Ca2+結(jié)合形成Ca2+/CaM復(fù)合物，通過(guò)激活下游分子參與學(xué)習(xí)記憶等多種生理學(xué)效應(yīng)[6];鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱα（CaMKⅡα）是胞內(nèi)參與鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種依賴于Ca2+的酶類，廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、骨架蛋白磷酸化，其活性異常可能是AD的發(fā)病機(jī)制之一[7]。Ca2+-CaM可誘導(dǎo)CaMKⅡ發(fā)生分子構(gòu)像改變，在Thr286位點(diǎn)出現(xiàn)磷酸化，活化的CaMKⅡ可激活神經(jīng)元胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄機(jī)制，從而調(diào)控神經(jīng)元胞內(nèi)或胞膜的酶類或受體成分的合成[8]。本課題組前期已應(yīng)用基因芯片檢測(cè)大鼠基因表達(dá)譜改變，部分差異表達(dá)基因聚類分析提示，黑逍遙散干預(yù)AD大鼠與Ca2+-CaM/CaMKⅡ信號(hào)通路有關(guān)[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)從Ca2+-CaM/CaMKⅡ信號(hào)通路探討黑逍遙散對(duì)APP/PSI雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)CaM、CaMKⅡα因子的干預(yù)作用，為該方防治AD的研發(fā)提供依據(jù)。

1? 實(shí)驗(yàn)材料

1.1? 動(dòng)物

雄性SPF級(jí)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠30只，4月齡，體質(zhì)量（25±5）g，同月齡、同種系雄性小鼠10只，均購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2014-0004。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度20 ℃、濕度40%，晝夜交替12 h，自由攝食飲水。

1.2? 藥物

黑逍遙散按熟地黃∶柴胡∶當(dāng)歸∶白芍∶茯苓∶白術(shù)∶生姜∶甘草∶薄荷=7.5∶5∶5∶5∶5∶5∶5∶4∶1比例，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，采取傳統(tǒng)水煎法制備成水煎液，無(wú)菌條件裝瓶，4 ℃貯存?zhèn)溆?。鹽酸多奈哌齊片，衛(wèi)材（中國(guó)）藥業(yè)有限公司，批號(hào)1604043。

1.3? 主要試劑與儀器

Fluo-3/AM（翊圣，F(xiàn)58890），PluronicF-127（上海復(fù)凝科技有限公司），無(wú)鈣和含鈣人工腦脊液（自配），胰蛋白酶（翊圣，T1826471），Rabbit Anti- Calmodulin Polyclonal Antibody、Rabbit Anti-CaMKⅡα Polyclonal Antibody（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-0527R、bs-3666R），辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（中杉金橋，ZB-2301），TRIzolTM Reagent （Invitrogen Corporation， Cat. No.15596026），GoScriptTM Reverse Transcription System和GoTaq?qPCR Master Mix（Promega Corporation，0000303542、0000275172）。1 mL和10 ?L微量加樣器（Eppendorf，R18012G、H18771H），激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus，RS2000TM），連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad），PCR儀（美國(guó)Bio-Rad，CFX96），超薄切片機(jī)（瑞典LKB），電腦生物組織攤烤片機(jī)（浙江金華），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus，CKX21）。

2? 實(shí)驗(yàn)方法

2.1? 分組及給藥

將30只4月齡AD小鼠按隨機(jī)分組法分為3組，給藥劑量按人和動(dòng)物體表面積比進(jìn)行換算。黑逍遙散組給予黑逍遙散水煎液（6 g原藥材/kg）灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組給予鹽酸多奈哌齊（3.25 mg/kg）藥液灌胃，給藥體積0.2 mL/10 g。同月齡同系種小鼠10只作為空白組，模型組和空白組給予等體積純凈水灌胃。每日1次，連續(xù)3個(gè)月。

2.2? 熒光探針結(jié)合激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測(cè)海馬神經(jīng)元[Ca2+]i相對(duì)熒光強(qiáng)度

參照文獻(xiàn)[10-13]方法，主要步驟包括標(biāo)本制作、神經(jīng)細(xì)胞Fluo-3/AM負(fù)載、激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測(cè)和圖象分析等。

2.3? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

Trizol法提取小鼠海馬組織總RNA，檢測(cè)濃度純化后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。引物CaM、CaMKⅡα、GAPDH由寶生物工程（大連）有限公司合成，其序列詳見(jiàn)表1。按95 ℃預(yù)熱3 min，95 ℃變性5 s，60 ℃ 退火與延伸40 s，40個(gè)循環(huán)，PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。2-ΔΔCt法分析結(jié)果，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2.4? 免疫組化檢測(cè)

切片經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)、沖洗、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶滅活處理后，加一抗Rabbit Anti-Calmodulin Polyclonal Antibody（1∶400）、Rabbit Anti-CaMKⅡα Polyclonal Antibody（1∶200）將載玻片置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h，PBS沖洗2次×5 min，滴加二抗（1∶500），室溫孵育30 min，取出后PBS沖洗2次×5 min，滴加顯色劑，經(jīng)復(fù)染、脫水和透明后，樹膠封片，拍照。

3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，方差齊用LSD法，不齊用Dunnetts T3。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4? 結(jié)果

4.1? 黑逍遙散對(duì)模型小鼠海馬神經(jīng)元[Ca2+]i相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

與空白組比較，模型組小鼠海馬神經(jīng)元[Ca2+]i相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組小鼠海馬神經(jīng)元[Ca2+]i相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與陽(yáng)性對(duì)照組比較，黑逍遙散組小鼠海馬神經(jīng)元[Ca2+]i相對(duì)熒光強(qiáng)度略高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖1、表2。

4.2? 黑逍遙散對(duì)模型小鼠海馬組織鈣調(diào)蛋白、鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱα mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組小鼠海馬組織CaM mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高，CaMKⅡα mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組小鼠海馬組織CaM mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低，CaMKⅡα mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與陽(yáng)性對(duì)照組比較，黑逍遙散組小鼠海馬組織CaM mRNA相對(duì)表達(dá)量有所升高，CaMKⅡα mRNA相對(duì)表達(dá)量有所降低，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

4.3? 黑逍遙散對(duì)模型小鼠海馬組織鈣調(diào)蛋白、鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱα蛋白表達(dá)的影響

CaM、CaMKⅡα陽(yáng)性表達(dá)多出現(xiàn)在神經(jīng)元胞漿或核位置，呈黃色或棕黃色顆粒。與空白組比較，模型組小鼠海馬組織CaM蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯著增強(qiáng)，CaMKⅡα蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯著減弱（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組小鼠海馬組織CaM蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯著減弱，CaMKⅡα蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯著增強(qiáng)（P<0.05，P<0.01）;與陽(yáng)性對(duì)照組比較，黑逍遙散組CaM蛋白陽(yáng)性表達(dá)相對(duì)增強(qiáng)，CaMKⅡα蛋白陽(yáng)性表達(dá)相對(duì)減弱，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4、圖2和圖3。

5? 討論

AD屬中醫(yī)學(xué)“呆證”“健忘”等范疇，其病位在腦，但與肝、腎等臟腑功能紊亂尤為密切。黑逍遙散出自《醫(yī)宗己任編》，具有肝脾腎并調(diào)、氣血精兼顧功效，通過(guò)清利腦絡(luò)充養(yǎng)神竅能有效緩解AD患者行為異常[14]，對(duì)AD模型具有調(diào)節(jié)中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、抗氧化應(yīng)激、保護(hù)神經(jīng)元等防治效果[15-17]。AD發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，中醫(yī)復(fù)方具有多組分、多靶點(diǎn)治病特點(diǎn)，因此，基于中醫(yī)學(xué)理論結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究成果從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路著手，尋找有效的AD防治策略。

鈣穩(wěn)態(tài)失衡可導(dǎo)致AD發(fā)生的病理模式逐漸得到醫(yī)學(xué)界認(rèn)可并成為研究焦點(diǎn)[5，18-20]。前期研究表明，黑逍遙散防治AD可能與Ca2+-CaM/CaMKⅡα信號(hào)通路有關(guān)[9]。鈣信號(hào)的形成與維持參與了學(xué)習(xí)和記憶機(jī)制，長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作用（long term potentiation，LTP）是學(xué)習(xí)和記憶形成與維持的微觀模式，而神經(jīng)細(xì)胞游離Ca2+濃度是影響LTP形成的重要因素之一，其主要參與神經(jīng)信號(hào)的傳遞和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[21]。CaM首先發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞漿，但也存在于細(xì)胞核中，在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中非常豐富。在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，CaM是Ca2+的受體蛋白，Ca2+所介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)大多數(shù)以Ca2+-CaM復(fù)合物的方式激活靶酶，活化的CaM經(jīng)Ca2+-CaM依賴性蛋白激酶途徑，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放、調(diào)節(jié)離子通道活性、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)軸突延伸、突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶及基因表達(dá)等多種生理功能，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂[22]。

CaMKⅡα是一種主要表達(dá)于皮質(zhì)、海馬、杏仁核和基底神經(jīng)節(jié)的絲/蘇氨酸蛋白激酶，可經(jīng)假底物區(qū)的自動(dòng)磷酸化進(jìn)行調(diào)節(jié)。CaM缺乏時(shí)，假底物區(qū)和CaM結(jié)合掩蔽了催化域，阻止底物與ATP結(jié)合而使激酶處于自身抑制狀態(tài);當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，促使Ca2+-CaM與激酶的CaM結(jié)合區(qū)相互作用引起構(gòu)象改變，自身抑制區(qū)失活，激活CaMKⅡ與Mg2+/ATP結(jié)合而起催化作用[23]。CaMKⅡα是Ca2+的重要靶酶，在腦組織含量最高，通過(guò)磷酸化許多底物蛋白來(lái)傳導(dǎo)Ca2+信號(hào)，神經(jīng)元的可塑性、神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放、LTP和細(xì)胞骨架修飾等都起著重要作用，可定位于神經(jīng)元胞漿、軸突、樹突及突觸的前后膜[24]。CaMKⅡ可引起CREB磷酸化，從而調(diào)節(jié)海馬區(qū)基因轉(zhuǎn)錄，通過(guò)下游基因的表達(dá)加強(qiáng)海馬區(qū)LTP的形成[25]。

APP/PS雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型已廣泛用于實(shí)驗(yàn)研究，該模型小鼠優(yōu)勢(shì)在于將APPswe和PS1dE9這2個(gè)易感基因結(jié)合在一起，彌補(bǔ)了單一突變基因所引起的病理改變相對(duì)單一、病理變化時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)的缺陷。有研究表明，該模型小鼠3月齡時(shí)在其大腦內(nèi)未檢測(cè)到明顯老年斑，但已存在記憶缺陷的表現(xiàn)，而到4～5月齡時(shí)其大腦皮層開始出現(xiàn)老年斑[26]。上述研究結(jié)果表明，這種小鼠模型模擬了人類早發(fā)型AD的部分疾病特征，可用于預(yù)防或治療AD的藥理實(shí)驗(yàn)研究。雖然該模型能模擬人類AD患者年齡依賴性老年斑的形成、膠質(zhì)細(xì)胞增生和突觸減少等部分神經(jīng)病理特征，并表現(xiàn)出與AD臨床相似的行為學(xué)障礙，也有助于AD的病因、發(fā)病機(jī)制及治療策略等相關(guān)研究，但其未見(jiàn)神經(jīng)纖維纏結(jié)這一AD特征性病理改變，故在應(yīng)用過(guò)程中仍具有一定的局限性[27]。

前期研究顯示，未治療的7月齡AD模型小鼠已經(jīng)出現(xiàn)明顯行為學(xué)異常，而經(jīng)黑逍遙散干預(yù)后小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力顯著提升[28]。本研究結(jié)果表明，黑逍遙散能明顯降低AD模型小鼠海馬神經(jīng)元Ca2+濃度，下調(diào)海馬區(qū)CaM基因和蛋白表達(dá)，上調(diào)CaMKⅡα基因和蛋白表達(dá)，因此推斷黑逍遙散可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Ca2+-CaM/CaMKⅡα通路關(guān)鍵因子的表達(dá)而發(fā)揮防治AD作用的，具體機(jī)制還需今后深入研究。

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（收稿日期：2019-04-22）

（修回日期：2019-05-14;編輯：華強(qiáng)）