楊明鎮(zhèn)　趙逵

[摘要]目的 研究哇巴因體外逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥Bel-7402/（阿霉素）ADM細胞機制。方法 選用人肝癌Bel-7402細胞株，正常Bel-7402作為對照組，ADM大劑量間斷沖擊法建立Bel-7402/ADM模型作為耐藥組，采用Real-Time-PCR檢測哇巴因干預前后腫瘤多藥耐藥性（MDR-1）RNA表達，噻唑藍溴化四唑（MTT）檢測哇巴因耐藥性并計算其耐藥倍數(shù)、逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。結(jié)果 耐藥組對ADM耐藥性顯著高于對照組（P<0.05），耐藥組耐藥倍數(shù)顯著高于對照組（P<0.05），哇巴因干預后對照組和耐藥組IC50均顯著低于干預前（P<0.05），耐藥組逆轉(zhuǎn)效果顯著高于對照組（P<0.05），耐藥組在哇巴因干預前后MDR-1RNA表達均顯著高于對照組（P<0.05），干預后MDR-1RNA表達顯著低于干預前（P<0.05）。結(jié)論 哇巴因可通過降低MDR-1RNA表達體外逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥Bel-7402/ADM細胞，值得臨床推廣，但哇巴因是否還參與其他耐藥機制還待進一步研究。

[關(guān)鍵詞]哇巴因;肝癌;耐藥;阿霉素

[中圖分類號] R735.7 ? ? [文獻標識碼] A ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）9（b）-0060-03

Experimental study on the reversal of hepatocarcinoma-resistant Bel-7402/ADM cells by Ouabain in vitro

YANG Ming-zhen1? ?ZHAO Kui2

1. Department of Intervention， Affiliated Hospital of Zunyi Medical College， Guizhou Province， Zunyi? ?563003， China; 2. Department of Gastroenterology， Affiliated Hospital of Zunyi Medical College， Guizhou Province， Zunyi? ?563003， China

[Abstract] Objective To study the mechanism of Ouabain in reversing the hepatocarcinoma-resistant Bel-7402/ Adriamycin （ADM） in vitro. Methods Human hepatoma Bel-7402 cell line was selected. A high-dose intermittent impact method was used to establish Bel-7402/ADM model as drug-resistant group and normal Bel-7402 was used as control group. Real-Time-PCR was used to detect tumor multidrug resistance （MDR-1） RNA expression before and after Ouabain intervention and Thiazolyl Blue tetrazolium bromide （MTT） was used to detect the effects of Ouabain resistance， calculating the drug resistance factor and reversal factor. Results The drug resistance of ADM was significantly higher in the drug-resistant group than that in the control group （P<0.05）. The resistance factor in the drug-resistant group was significantly higher than that in the control group （P<0.05）. IC50 in the control group and drug-resistant group after Ouabain intervention was decreased compared with pre-intervention （P<0.05）， and the reversal effect of the drug-resistant group was significantly higher than that of the control group （P<0.05）. The expression of MDR-1RNA in the drug-resistant group was significantly higher than that in the control group before Ouabain intervention （P<0.05）; the expression of MDR-1RNA after intervention was significantly lower than that before intervention （P<0.05）. Conclusion Ouabain reverses hepatocarcinoma-resistant Bel-7402/ADM cells in vitro by reducing MDR-1 RNA expression.

哇巴因[11-12]是細胞膜上鈉鉀泵（Na+/K+-ATP ase）抑制劑，鈉鉀泵作為細胞膜上ATP酶，通過消耗ATP可以將細胞外低濃度K+納入細胞內(nèi)，并將細胞內(nèi)低濃度Na+外排出細胞，維持細胞膜兩側(cè)鈉鉀濃度，保持細胞處于靜止電位，幫助傳輸和調(diào)整細胞體積。研究表明[13]，P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是MDR基因編碼重要跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，廣泛分布與全身各個器官及組織，參與藥物體內(nèi)轉(zhuǎn)運?？衫肁TP水解能量將疏水親脂性化療藥物（如ADM）在尚未發(fā)揮作用時排出細胞，導致細胞耐藥性。而P-gp外排需要依賴ATP水解能量，哇巴因[14]可通過與鈉鉀泵特異性結(jié)合抑制其ATP酶功能，導致細胞內(nèi)ATP分解減少，Na+濃度上升，引起細胞膜超極化，Ca2+內(nèi)流，其濃度升高，阻斷MDR-1基因轉(zhuǎn)錄翻譯P-gp，P-gp表達降低外排能力減弱，細胞外排化療藥物減少，從而減少其對化療藥物耐藥性。

本研究采用RT-PCR測量MDR-1RNA表達及MTT測定耐藥性，RT-PCR[15]檢測法特異性強，敏感度高，可避免同位素污染，可從基因、蛋白水平反映LC細胞耐藥本質(zhì)，測得MDR-1RNA表達準確有效。其通過提取樣本總RNA合成cDNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，紫外燈照像，激光掃描定量分析。因RNA提取、cDNA逆轉(zhuǎn)率、PCR擴增等環(huán)節(jié)可能導致MDR-1 RNA定量精確度，因此選擇與MDR-1基因擴增動力學相似的β1微球蛋白為內(nèi)參標，以兩者比值大小衡量MDR-1RNA水平高低，從而盡可能消除各種因素引起的定量誤差。細胞線粒體脫氫酶通過將黃色MTT還原成紫色晶狀物[16]，溶解釋放后檢測吸光度，吸光度值的高低與活細胞數(shù)量成正比，通過與空白組對比可間接反映活細胞數(shù)量，計算耐藥倍數(shù)、逆轉(zhuǎn)倍數(shù)，結(jié)果準確可靠。結(jié)果顯示耐藥組對ADM耐藥性顯著高于對照組，哇巴因干預后對照組和耐藥組IC50顯著低于干預前，耐藥組在哇巴因干預前MDR-1RNA表達顯著高于對照組，干預后MDR-1RNA表達顯著低于干預前（P<0.05），提示哇巴因有效降低MDR-1RNA表達，逆轉(zhuǎn)細胞耐藥性，其中對已耐藥細胞更為顯著。不足之處在于本實驗未能直接檢測LC細胞耐藥前后及哇巴因干預前后ADM含量，其數(shù)值可準確反映P-gp作用水平，本研究因時間緣故采用MTT檢測，只能大致反映P-gp功能，以ADM含量檢測和MTT藥敏性檢測兩相結(jié)合可以使數(shù)據(jù)更具說服力。

綜上所述，哇巴因可通過降低MDR-1RNA表達體外逆轉(zhuǎn)LC耐藥Bel-7402/ADM細胞，值得臨床推廣，但哇巴因是否還參與其他耐藥機制還待進一步研究。

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（收稿日期：2019-01-14? 本文編輯：崔建中）