覃 嶺，代艷超，孫堅(jiān)萍，趙 艷，孫煥芹，張永宏

流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，在世界范圍內(nèi)暴發(fā)和流行，病死率較高，給社會(huì)和人民生活帶來(lái)嚴(yán)重影響。流感病毒主要分為甲、乙、丙3型，其中甲型流感病毒常發(fā)生變異，其典型的臨床癥狀為急起高熱、全身疼痛、顯著乏力和輕度呼吸道癥狀，秋、冬季節(jié)是高發(fā)期，引起的并發(fā)癥和死亡現(xiàn)象非常嚴(yán)重。在流感發(fā)生發(fā)展中，細(xì)胞因子參與機(jī)體抗流感病毒免疫應(yīng)答，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。研究證實(shí)，流感患者體內(nèi)細(xì)胞因子會(huì)發(fā)生一定的變化，但目前關(guān)于流感患者體內(nèi)細(xì)胞因子與病毒載量的關(guān)系報(bào)道甚少[1-3]。故本研究將著重探討流感患者體內(nèi)細(xì)胞因子分泌水平與流感病毒載量的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取2014年11月—2015年3月北京佑安醫(yī)院急診科收治的流感患者共36例（流感組）作為研究對(duì)象，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《流行性感冒診斷與治療指南（2011年版）》[4]及《流行性感冒診療方案（2018年版修訂版）》[5]。健康對(duì)照者為2014—2015年間公開(kāi)招募的近6個(gè)月未患流感的健康大學(xué)生志愿者，共 40例（健康組）。排除標(biāo)準(zhǔn)：①?lài)?yán)重心、腦、肝及腎等器官性疾病者；②出血性疾病、惡性腫瘤及精神類(lèi)疾病者。所有入組人員均簽署知情同意書(shū)。

1.2 標(biāo)本收集 采集咽拭子標(biāo)本并置于3 ml保存液的專(zhuān)用采集管，-80 ℃保存；血清樣本經(jīng)不含抗凝劑的真空采血管采集，2200 rpm 離心7 min后，提取，-80 ℃保存。

1.3 儀器和試劑 Bio-Plex細(xì)胞因子試劑盒與Luminex技術(shù)檢測(cè)儀器購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司；甲型/乙型流感病毒抗原檢測(cè)試劑盒（膠體金法）購(gòu)于北京莊笛浩禾生物醫(yī)學(xué)科技有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)于德國(guó)QIAGEN公司。

1.4 細(xì)胞因子檢測(cè) 按照Bio-Plex細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)流感組和健康組血清中TNF-α和IL-10水平。待凍存的血清室溫溶解后，按照1︰4的比例稀釋血清樣本，備用；準(zhǔn)備好室溫預(yù)熱30 min的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)瑐溆?；將含有針?duì)多種細(xì)胞因子的微球磁珠與空白對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品及稀釋后的血清混合，振蕩反應(yīng)30 min；用磁力架去除液體，洗滌液wash buffer洗3 min后，加入檢測(cè)抗體，混合振蕩反應(yīng)30 min，再用磁力架去除液體，洗滌液wash buffer洗3次，加入1倍稀釋的藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親和素，混合振蕩反應(yīng)10 min，用wash buffer洗滌3次。最后加入125 μl的試劑稀釋液重懸磁珠，混勻30 s后，通過(guò)Luminex檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞因子濃度。

1.5 流感病毒核酸拷貝數(shù)測(cè)定 從咽拭子中提取流感病毒RNA，-80 ℃保存，經(jīng)干冰運(yùn)輸，委托北京市疾病預(yù)防控制中心對(duì)流感病毒RNA拷貝數(shù)測(cè)定。結(jié)果判讀如下：在陰陽(yáng)性對(duì)照均成立條件下，CT＜36為陽(yáng)性；CT≥40或無(wú)數(shù)值為陰性；36≤CT＜40重新檢測(cè)，重復(fù)檢測(cè)結(jié)果若CT＜36為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析作圖，計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn)，2組計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson法。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般臨床資料 健康組對(duì)照者40例（年齡17～22歲，平均18.9歲），男18例，女22例；流感組患者36例（年齡17～76歲，平均43.5歲），男16例，女20例。流感組患者年齡顯著高于健康組對(duì)照者（t=7.341，P=0.000），性別構(gòu)成比上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.002，P=0.961）。其中流感組患者平均發(fā)熱天數(shù)為2.45 d，體溫最高為40.2 ℃，最低為37.7 ℃，平均體溫為（38.67±0.10） ℃，且均未用藥治療。本研究中流感組患者的血常規(guī)檢測(cè)值均在正常參考值范圍內(nèi)，見(jiàn)表1。

表1 流感組患者血常規(guī)檢查結(jié)果Table 1 Routine blood examination results of influenza group

2.2 病毒核酸拷貝數(shù)測(cè)定結(jié)果 流感組患者1年內(nèi)均未接種過(guò)流感疫苗，經(jīng)咽拭子檢測(cè)，均為甲型流感病毒陽(yáng)性，提示：所感染的流感病毒亞型為甲型流感病毒；經(jīng)過(guò)流感病毒核酸檢測(cè)和拷貝數(shù)測(cè)定，流感組患者的流感病毒載量最大為35 copies/ml，最小為14 copies/ml，平均為（33.57±4.29）copies/ml。

2.3 細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果 流感組患者TNF-α和 IL-10水平分別為（18.18±1.53）pg/ml和（9.64±0.88）pg/ml，均顯著高于健康組的（5.03±0.40）pg/ml 和（1.78±0.52）pg/ml，P=0.000，見(jiàn)圖1。

2.4 TNF-α和IL-10水平與流感病毒載量相關(guān)性分析 流感患者分泌的TNF-α水平與病毒載量相關(guān)系數(shù)r=0.200，無(wú)顯著相關(guān)性；IL-10水平與病毒載量相關(guān)系數(shù)r=0.677，呈中等程度正相關(guān)，見(jiàn)圖2。

3 討 論

流感是急性呼吸道傳染病，其主要特征為傳染性強(qiáng)、傳播快、潛伏期短、發(fā)病率高等，易出現(xiàn)暴發(fā)流行。雖然流感大多為自限性，但仍有一部分患者易出現(xiàn)肺炎等并發(fā)癥，甚至發(fā)展為重癥流感，由于病情的進(jìn)展較快最終可因呼吸窘迫或多臟器衰竭而死亡。在流感發(fā)展過(guò)程中，細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，但其是否與流感病毒載量有相關(guān)性尚無(wú)定論。

本研究納入36例流感患者和40例健康對(duì)照者，對(duì)其相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行分析，著重探討細(xì)胞因子水平與流感病毒載量的相關(guān)性。結(jié)果顯示，36例流感患者均處于急性期，TNF-α和IL-10水平均顯著高于健康對(duì)照者，上述結(jié)果與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致[6-7]。此外，Rogo 等[8]和 Martinez-Oca?a 等[9]做了更深入的研究發(fā)現(xiàn)TNF-α和IL-10基因多態(tài)性對(duì)流感病毒有影響。TNF-α是一種促炎因子，過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴，使細(xì)胞因子功能失調(diào)，打破免疫平衡，從而加重病情。IL-10是一種可以監(jiān)測(cè)感染流感病毒后易患肺炎的一個(gè)重要指標(biāo)[10]，與流感患者病情進(jìn)展有一定的關(guān)系[11]，另外IL-10還是一種抑制性細(xì)胞因子，對(duì)免疫應(yīng)答有抑制作用，Yamamura等[12]發(fā)現(xiàn)，IL-10可能會(huì)抑制機(jī)體對(duì)流感病毒的清除。而本研究也發(fā)現(xiàn)，IL-10水平與流感病毒載量呈正相關(guān)（r=0.677），進(jìn)一步驗(yàn)證了IL-10對(duì)流感病毒清除作用的抑制性，提示IL-10分泌量可能是流感患者體內(nèi)病毒復(fù)制的指標(biāo)之一。

圖1 健康組和流感組TNF-α和IL-10水平比較A.2組TNF-α水平； B.2組IL-10水平Figure 1 Comparison of the levels of TNF-α and IL-10 between healthy group and influenza group

圖2 流感病毒載量與TNF-α和IL-10水平相關(guān)性分析A.TNF-α水平與流感病毒載量相關(guān)性分析； B.IL-10水平與流感病毒載量相關(guān)性分析Figure 2 Correlation of influenza virus load with levels of TNF-α and IL-10

本研究對(duì)TNF-α水平與流感病毒載量相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示TNF-α水平與病毒載量無(wú)顯著相關(guān)性。TNF-α是一種促炎因子，過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴，使細(xì)胞因子功能失調(diào)，打破免疫平衡，從而加重病情。但是與流感病毒載量的相關(guān)性目前未見(jiàn)報(bào)道。

雖然本研究發(fā)現(xiàn)了一些有意義的結(jié)果，但是也存在一些問(wèn)題，例如因樣本量較小的原因，無(wú)法對(duì)IL-10和TNF-α的水平是否與年齡有關(guān)進(jìn)行深入探討。有文獻(xiàn)報(bào)道，TNF-α在老年人中出現(xiàn)高水平分泌[13]；IL-10在青年人和正常老年人中的水平無(wú)顯著差異，在有感染的老年人中分泌水平顯著增高[14]。而楊蓬勃等[15]研究發(fā)現(xiàn)IL-10和TNF-α水平在不同年齡組和不同性別人群中差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，IL-10和TNF-α的水平與年齡的相關(guān)性須要進(jìn)一步增大樣本量加以研究證實(shí)。

綜上所述，在流感患者中高表達(dá)的細(xì)胞因子主要是TNF-α與IL-10，且IL-10水平與流感病毒載量呈中等程度正相關(guān)，本研究認(rèn)為IL-10可以作為流感病毒在體內(nèi)復(fù)制的一個(gè)潛在的免疫學(xué)監(jiān)測(cè)指標(biāo)。