陳頤，張笑，楊志懷，胡彬彬，徐鴻飛，鄒聰明，冀新威

1 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，昆明 650031；2 云南省香料煙有限責(zé)任公司，保山 678000；3 云南省煙草公司，昆明 650011；4 云南省煙草公司紅河州公司，紅河 652300

蛋白質(zhì)是煙草中含量最為豐富的一類十分重要的化學(xué)組分，它們不僅具有重要的生理功能，能調(diào)控?zé)熑~內(nèi)的能量代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)化，而且對(duì)煙葉最終質(zhì)量有決定性影響[1-2]。煙葉在成熟過程中，蛋白質(zhì)含量、組分和結(jié)構(gòu)不斷發(fā)生變化，而這些變化直接影響著煙葉的烘烤特性和烤后煙葉質(zhì)量[3-4]。煙葉成熟度不同，其蛋白質(zhì)含量差異很大，烘烤過程中控制煙葉蛋白質(zhì)含量并不追求一味地降低，而是降至一個(gè)適宜的范圍。因此，從煙葉采摘成熟度出發(fā)，通過合理調(diào)控密集烘烤參數(shù)對(duì)促進(jìn)煙葉蛋白質(zhì)的降解和煙葉品質(zhì)的提高是現(xiàn)代煙葉烘烤技術(shù)的重要組成部分。

目前，國(guó)內(nèi)外圍繞烘烤過程煙葉蛋白質(zhì)降解規(guī)律開展了大量研究。李婷婷等[5]對(duì)不同烘烤方式下煙葉蛋白質(zhì)含量及相關(guān)酶活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)煙葉蛋白酶活性呈現(xiàn)“上升-下降-上升-下降”的“雙峰曲線”，并且初步得出“兩燉一停”密集烘烤方式最有利于提高煙葉蛋白質(zhì)酶活性，從而加速蛋白質(zhì)分解。艾復(fù)清等[6-7]研究了K326和紅花大金元品種中上部煙葉烘烤過程中蛋白質(zhì)以及相關(guān)酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)延長(zhǎng)變黃期時(shí)間，調(diào)控變黃相對(duì)濕度可降低不同部位煙葉蛋白質(zhì)含量。李常軍等[8-9]分別從溫度和濕度單一變量入手研究了煙葉蛋白質(zhì)變化，結(jié)果表明蛋白質(zhì)的降解程度主要受煙葉中蛋白酶活力水平的影響，酶活性又受溫濕度的影響，蛋白質(zhì)降解的實(shí)質(zhì)就是在一定溫濕度條件下，相關(guān)酶作用的結(jié)果。賀帆等[10]研究發(fā)現(xiàn)，密集烘烤低溫中濕變黃處理煙葉蛋白酶活性較高，有利于煙葉內(nèi)蛋白質(zhì)的降解。目前，植物體內(nèi)蛋白質(zhì)的降解被普遍認(rèn)為先由內(nèi)肽酶起作用，將蛋白質(zhì)水解成多肽，再由外肽酶將多肽水解成氨基酸，其中外肽酶根據(jù)其所剪切肽鏈末端的不同又分為氨肽酶和羧肽酶[11]。上述研究對(duì)煙葉烘烤過程中蛋白質(zhì)變化機(jī)理上雖有所探觸，但不夠系統(tǒng)。

本文研究了K326品種不同成熟度中部煙葉在密集烘烤過程中蛋白質(zhì)含量、內(nèi)肽酶活性、外肽酶活性和游離氨基酸含量的動(dòng)態(tài)變化，旨在為闡明煙葉烘烤過程中蛋白質(zhì)降解機(jī)理以及提高煙葉質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2018年4月～9月于云南省玉溪市江川區(qū)九溪鎮(zhèn)（東經(jīng)102°38′，北緯24°18′，海拔1730 m）進(jìn)行，供試品種為K326，由玉溪中煙種子有限責(zé)任公司提供。選取中部煙葉尚熟、適熟和過熟3種成熟度檔次鮮煙葉樣品作為試驗(yàn)材料，3種成熟度檔次標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 K326鮮煙葉不同成熟度檔次標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 The classification standard of tobacco leaves K326 with different maturity

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

不同成熟度煙葉采摘、編竿，確保煙葉部位均衡一致，采用當(dāng)?shù)孛芗痉恐羞M(jìn)行烘烤。烘烤工藝依據(jù)玉溪煙區(qū)主推烘烤模式進(jìn)行（見圖1）。

煙葉取樣：煙葉烘烤前取樣1次，在整個(gè)烘烤過程中每12個(gè)小時(shí)取樣一次，共取樣13次。每次選取烘烤過程中各處理具有代表性的葉片5片，切去葉尖和葉基部，留葉中間部分，每次取樣必須是裝在同一層相同葉位的煙葉，干冰保存，并放入-80℃低溫冰箱待用。

圖1 玉溪煙區(qū)密集烤房烘烤技術(shù)主推工藝圖Fig.1 Main technical diagram of flue-curing barn in Yu-xi tobacco area

1.3 測(cè)定方法

煙葉蛋白質(zhì)含量和游離氨基酸含量：采用考馬斯亮藍(lán)法和茚三酮法進(jìn)行測(cè)定[12-13]。所用儀器Lambda 650紫外可見分光光度計(jì)（美國(guó)PerkinElmer公司）。煙葉蛋白質(zhì)含量和游離氨基酸含量變化幅度的計(jì)算方法[14]：PCt%=（ECt1-ECt2）/ECt1×100 %。式中：ECt1表示任意取樣時(shí)刻t樣品的物質(zhì)含量；ECt2表示任意時(shí)刻t下一次樣品的物質(zhì)含量。

煙葉內(nèi)肽酶（endopeptidase）活性：采用ELLISA法用植物內(nèi)肽酶酶聯(lián)免疫分析測(cè)定試劑盒（武漢伊艾博科技有限公司）進(jìn)行測(cè)定。稱取煙樣0.1 g，加入1 mL的PBS緩沖液（pH7.4），低溫下快速研磨，4℃離心10 min（8000 r/min），收集上清液待檢測(cè)酶活。在酶標(biāo)板上空白孔加樣品稀釋液50 μL，余孔分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品50 μL。接著在每孔加入檢測(cè)溶液A工作液50 μL。蓋上覆膜，輕拍以混勻，37℃孵育60 min。然后棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗滌液洗滌3次，每次浸泡1～2 min，大約300 μL/孔，甩干。每孔加入檢測(cè)溶液B工作液100 μL，酶標(biāo)板覆膜37℃孵育60 min。然后棄去孔內(nèi)液體，甩干，再洗滌3次，每次浸泡1～2 min，大約300 μL/孔，甩干。然后依序每孔加底物溶液90 μL，覆膜，37℃避光孵育10～20 min（標(biāo)準(zhǔn)孔前3～4孔有梯度藍(lán)色顯現(xiàn)）。然后依序每孔加入終止溶液50 μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色，注意混勻。然后立即用酶聯(lián)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下各孔的吸光值（OD值）。然后以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度即為樣品的實(shí)際濃度。所用儀器為SpectraMax 190光吸收型酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司) ，AC8洗板機(jī)(Thermo Labsystems)。

煙葉氨肽酶（aminopeptidase）活性：采用ELLISA法用植物氨肽酶酶聯(lián)免疫分析測(cè)定試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司）進(jìn)行測(cè)定。稱取煙樣0.1 g，加入1 ml的PBS緩沖液（pH7.4），低溫下快速研磨，4℃離心10 min（8000 r/min），收集上清液待檢測(cè)酶活。在酶標(biāo)包被板上加入待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)孔里加入標(biāo)準(zhǔn)品 50 μL，待測(cè)樣品孔先加樣品稀釋液 40 μL，然后再加待測(cè)樣品10 μL（樣品最終稀釋度為 5 倍），空白孔不加。然后覆膜后置于37℃溫育30 min。然后棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗滌液洗滌5次，每次浸泡30秒，大約300 μL /孔，拍干。每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外。然后覆膜后置于37℃溫育30 min。然后棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗滌液洗滌5次，每次浸泡30 s，大約300 μL /孔，拍干。然后每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，混勻，37℃避光顯色10 min。然后每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。然后立即用酶聯(lián)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下各孔的吸光值（OD值）。測(cè)定應(yīng)在15 min內(nèi)進(jìn)行。然后以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的 OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即為樣品的實(shí)際濃度。

煙葉羧肽酶（Carboxypeptidase）活性測(cè)定同氨肽酶活性測(cè)定方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)均采用EXCEL 2016、SPSS 22.0和Origin 8.0分析軟件進(jìn)行方差分析、計(jì)算和統(tǒng)計(jì)作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 烘烤過程中煙葉蛋白質(zhì)含量的變化

圖2 烘烤過程中煙葉蛋白質(zhì)含量變化Fig.2 Changes of the protein content in tobacco leaves during flue-curing process

不同成熟度煙葉烘烤過程中蛋白質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)變化見圖2。由圖可知，在烘烤過程中隨著時(shí)間延長(zhǎng)，不同成熟度煙葉蛋白質(zhì)平均含量從14%持續(xù)下降至5%左右，并且在24～36 h范圍下降幅度最大。由表2可知，在烘烤時(shí)間24～36 h和36～48 h期間，不同成熟度煙葉蛋白質(zhì)含量的下降幅度均存在極顯著性差異（P＜0.01）。其中過熟和適熟煙葉蛋白質(zhì)含量降解速率較快，兩者降幅均達(dá)到19%以上，而尚熟煙葉蛋白質(zhì)含量降解速率較緩慢。這表明在烘烤過程變黃期過熟和適熟煙葉蛋白質(zhì)分解較充分，而尚熟煙葉蛋白質(zhì)分解不夠充分。

表2 烘烤過程中不同成熟度煙葉蛋白質(zhì)含量的下降幅度Tab.2 The descent range of the protein content in tobacco leaves with different maturity during flue-curing process

2.2 烘烤過程中煙葉內(nèi)肽酶活性的變化

不同成熟度煙葉烘烤過程中內(nèi)肽酶活性的動(dòng)態(tài)變化見圖3。由圖中可知，隨密集烘烤時(shí)間延長(zhǎng)，不同成熟度煙葉內(nèi)肽酶活性變化趨勢(shì)基本一致，呈現(xiàn)“上升-下降-上升-下降”的“雙峰曲線”。這表明煙葉中可能存在兩種結(jié)構(gòu)、活性或分布不同的內(nèi)肽酶同工酶[16]。其中第1個(gè)波峰出現(xiàn)在烘烤36 h，酶活力為116.46 ng/g，第2個(gè)酶活性最高峰出現(xiàn)在烘烤84 h，酶活為77.12 ng/g，此后急劇下降。這說明煙葉內(nèi)肽酶主要在烘烤變黃前期大量表達(dá)，隨著溫度進(jìn)一步升高，其中一種內(nèi)肽酶同工酶變性失活，而另一種活性低的內(nèi)肽酶隨之表達(dá)。不同成熟度煙葉內(nèi)肽酶活性在烘烤時(shí)間24 h、36 h和48 h均存在極顯著性差異（P＜0.01），其中過熟和適熟煙葉內(nèi)肽酶活性極顯著高于尚熟煙葉，這表明內(nèi)肽酶耐溫性較低，烘烤溫度超過36 ℃ 將導(dǎo)致該酶逐漸變性失活，且尚熟煙葉由于內(nèi)肽酶表達(dá)量相對(duì)較少，故相同溫度條件下酶活性更低。

圖3 烘烤過程中煙葉內(nèi)肽酶活性變化Fig.3 Changes of the endopeptidase activity in tobacco leaves during flue-curing process

2.3 烘烤過程中煙葉氨肽酶活性的變化

不同成熟度煙葉烘烤過程中氨肽酶活性的動(dòng)態(tài)變化見圖4。由圖中可知，烘烤過程中隨烘烤時(shí)間的延長(zhǎng)，煙葉的氨肽酶活性均增加，當(dāng)烘烤時(shí)間達(dá)到72 h的變黃后期時(shí)，氨肽酶活性達(dá)到最高值300.52 ng/g，此后酶活性快速下降。這表明烘烤煙葉氨肽酶活性的最適溫度在變黃后期42 ℃左右，超過此溫度該酶將迅速變性失活。此外，不同成熟度煙葉氨肽酶活性在烘烤時(shí)間36 h、48 h、60 h和72 h均存在極顯著性差異（P＜0.01），其中煙葉氨肽酶活性表現(xiàn)為尚熟煙葉＞適熟煙葉＞過熟煙葉。

2.4 烘烤過程中煙葉羧肽酶活性的變化

圖4 烘烤過程中煙葉氨肽酶活性變化Fig.4 Changes of the aminopeptidase activity in tobacco leaves during flue-curing process

不同成熟度煙葉烘烤過程中羧肽酶活性的動(dòng)態(tài)變化見圖5。與氨肽酶變化趨勢(shì)相似，在烘烤時(shí)間達(dá)到72 h時(shí)，羧肽酶活性達(dá)到最高值，為47.26 ng/g，此后酶活性快速下降。這表明烘烤煙葉羧肽酶活性的最適溫度在變黃后期42 ℃左右，超過此溫度該酶活性急劇下降。不同成熟度煙葉羧肽酶活性在烘烤時(shí)間36 h、48 h、60 h和72 h均存在極顯著性差異（P＜0.01），其中煙葉羧肽酶活性表現(xiàn)為尚熟煙葉＞適熟煙葉＞過熟煙葉，與氨肽酶活性變化表現(xiàn)出相同的規(guī)律。

2.5 烘烤過程中煙葉游離氨基酸含量的變化

圖6 烘烤過程中煙葉游離氨基酸含量變化Fig.6 Changes of the amino acid content in tobacco leaves during flue-curing process

不同成熟度煙葉烘烤過程中游離氨基酸含量的動(dòng)態(tài)變化見圖6。由圖可知，隨著烘烤時(shí)間延長(zhǎng)，不同成熟度煙葉游離氨基酸含量變化差異很大，其中尚熟煙葉游離氨基酸平均含量呈現(xiàn)持續(xù)上升的變化趨勢(shì)，而適熟和過熟煙葉呈現(xiàn)“上升-下降-上升”的變化趨勢(shì)。這說明適熟和過熟煙葉中的游離氨基酸含量在烘烤時(shí)間72～84 h范圍內(nèi)達(dá)到最大值后，隨著美拉德反應(yīng)而轉(zhuǎn)化為美拉德產(chǎn)物，而尚熟煙葉中的美拉德反應(yīng)受某種因素影響，游離氨基酸不能轉(zhuǎn)化為美拉德產(chǎn)物，因而游離氨基酸隨蛋白質(zhì)降解而持續(xù)升高[17]。由表3可知，在烘烤時(shí)間24～144 h期間，不同成熟度煙葉游離氨基酸含量的變化幅度存在極顯著性差異（P＜0.01）。其中在烘烤變黃期和定色前期（烘烤時(shí)間24～84 h），尚熟煙葉游離氨基酸含量上升幅度較快，而在烘烤定色后期和干筋期（烘烤時(shí)間120～144 h），適熟和過熟煙葉游離氨基酸含量上升幅度較快。

表3 烘烤過程中不同成熟度煙葉游離氨基酸含量的變化幅度Tab.3 The change range of the amino acid content in tobacco leaves with different maturity during flue-curing process

3 討論與結(jié)論

煙葉烘烤是煙葉內(nèi)大分子的有機(jī)物降解、轉(zhuǎn)化的生理生化變化過程和煙葉脫水干燥的物理過程的統(tǒng)一[18-20]。本研究結(jié)果表明，過熟和適熟煙葉蛋白質(zhì)含量降解速率較快，而尚熟煙葉蛋白質(zhì)含量降解速率較緩慢；過熟和適熟煙葉內(nèi)肽酶活性極顯著高于尚熟煙葉，但氨肽酶和羧肽酶活性均表現(xiàn)為尚熟煙葉＞適熟煙葉＞過熟煙葉。由此可見，由于過熟和適熟煙葉成熟度高，煙葉細(xì)胞壁和細(xì)胞膜較疏松，水分含量多，內(nèi)肽酶表達(dá)量高，因而有利于煙葉蛋白質(zhì)快速水解[15]。而尚熟煙葉成熟度低，煙葉細(xì)胞壁和細(xì)胞膜較緊密，水分含量相對(duì)較少，內(nèi)肽酶表達(dá)量較低，因而蛋白質(zhì)降解速率慢，雖然尚熟煙葉的氨肽酶和羧肽酶活性相對(duì)高于過熟和適熟煙葉，但受內(nèi)肽酶作用的限制，氨肽酶和羧肽酶難以將分子量較大的多肽鏈水解為氨基酸[21]。因此，尚熟烘烤煙葉的蛋白質(zhì)含量高，是其煙葉感官評(píng)吸質(zhì)量差的主要原因，這與徐興陽(yáng)等[22]人研究結(jié)果相符。

肽酶是一類促進(jìn)可溶性蛋白質(zhì)降解為游離氨基酸的關(guān)鍵酶。按剪切多肽鏈位置的不同，肽酶可分為內(nèi)肽酶和外肽酶兩大類，其中外肽酶根據(jù)作用肽鏈末端的不同，又分為氨肽酶和羧肽酶兩類，它們是多肽鏈最后生成游離氨基酸的限速酶[23-24]。本研究結(jié)果表明，適熟和過熟煙葉的氨肽酶和羧肽酶活性最大時(shí)的溫度（烘烤時(shí)間72 h）明顯高于內(nèi)肽酶，并且內(nèi)肽酶活性最大時(shí)的溫度（烘烤時(shí)間36 h）與蛋白質(zhì)含量最大下降幅度相對(duì)應(yīng)，氨肽酶和羧肽酶活性最大時(shí)的溫度（烘烤時(shí)間72 h）與游離氨基酸含量最高值相對(duì)應(yīng)。由此可見，烘烤過程中煙葉蛋白質(zhì)的含量高低與內(nèi)肽酶活性密切相關(guān)，煙葉游離氨基酸含量與氨肽酶和羧肽酶活性密切相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，煙葉內(nèi)肽酶活性變化呈現(xiàn)“上升-下降-上升-下降”的“雙峰曲線”。這表明煙葉中可能存在兩種結(jié)構(gòu)、活性或分布不同的內(nèi)肽酶同工酶[16]。有關(guān)烤煙中內(nèi)肽酶的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及分布還有待今后進(jìn)一步研究。

賀帆等[10]研究表明烘烤過程中煙葉內(nèi)肽酶活性變化與中性蛋白酶活性相似，分別在烘烤24 h和36 h達(dá)到酶活最大值。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同成熟度煙葉蛋白質(zhì)含量在烘烤24～48 h范圍下降幅度最大；內(nèi)肽酶在烘烤36 h活性最高，氨肽酶和羧肽酶在烘烤72 h活性最高；適熟和過熟煙葉中的游離氨基酸含量在烘烤變黃期轉(zhuǎn)入定色期的72～84 h范圍內(nèi)達(dá)到最大值。由此可見，烘烤時(shí)間在24～72 h范圍是內(nèi)肽酶、氨肽酶和羧肽酶催化蛋白質(zhì)有效降解的關(guān)鍵時(shí)期，超過該烘烤時(shí)間范圍，隨著這些蛋白水解酶的變性失活，蛋白質(zhì)的降解將終止。此外，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，尚熟煙葉游離氨基酸含量持續(xù)上升，而適熟和過熟煙葉呈現(xiàn)“上升-下降-上升”的變化趨勢(shì)。造成這現(xiàn)象的原因可能與適熟和過熟煙葉烘烤過程中游離氨基酸發(fā)生非酶棕色化反應(yīng)有關(guān)[25-26]。唐樂攀等[27]研究指出反應(yīng)溫度和時(shí)間是美拉德反應(yīng)重要的動(dòng)力學(xué)因素，隨著反應(yīng)溫度的升高，反應(yīng)速率加快。根據(jù)Hodge提出的美拉德反應(yīng)路線可以看出，反應(yīng)時(shí)間決定著美拉德反應(yīng)所處的階段，初級(jí)階段主要是氨基酸和還原糖的消耗。本研究也表明，烘烤時(shí)間是影響美拉德反應(yīng)將煙葉游離氨基酸轉(zhuǎn)化為美拉德產(chǎn)物的決定因素。有關(guān)煙葉成熟過程中的蛋白質(zhì)積累和肽酶基因表達(dá)及其與烘烤過程中蛋白質(zhì)降解和美拉德產(chǎn)物形成的機(jī)理還有待今后進(jìn)一步研究。