呂銘守，林美君，陳鳳蓮，張光，石彥國

(哈爾濱商業(yè)大學 食品工程學院，哈爾濱 150006)

乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)是一類革蘭氏陽性、不產(chǎn)孢、不運動、過氧化氫酶試驗呈陰性、耐氧且在缺少氧氣的環(huán)境中生長良好的菌群，其發(fā)酵代謝的最終產(chǎn)物為乳酸[1]，在自然界中分布廣泛。乳酸菌以益生菌形式在人體健康中起著至關(guān)重要的作用，是一種重要的工業(yè)微生物。乳酸菌及其代謝產(chǎn)物已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域[2,3]。在食品行業(yè)，乳酸菌有著極其廣泛的應(yīng)用，如發(fā)酵乳制品、肉類和蔬菜產(chǎn)品以及酒類的生產(chǎn)[4]。某種乳酸菌生產(chǎn)的抗生素或細菌素，在食品領(lǐng)域中已經(jīng)被用作生物防腐劑[5]。隨著科技的不斷進步，乳酸菌在發(fā)酵、生物、食品等領(lǐng)域的應(yīng)用和作用逐漸被人們注意到。因此，近年來，其相關(guān)領(lǐng)域的研究成為熱門。

代謝組學(metabolomics)又稱代謝物組學，其主要目標是識別、表征和量化包含生物體中存在的全部代謝物的代謝體，是對不同生物體內(nèi)代謝物的綜合分析，用于檢測生物體整體水平代謝特征的組學技術(shù)，并通過代謝物組成來確定生物體系的系統(tǒng)生化譜和功能調(diào)控[6]。它的重點是定性和定量分析構(gòu)成代謝體的初級和次級代謝產(chǎn)物等小分子量物質(zhì)[7]。代謝組學主要研究“已經(jīng)發(fā)生的生命過程”，是對蛋白質(zhì)組學、基因組學和轉(zhuǎn)錄組學方法的補充，也是目前組學領(lǐng)域研究的熱點之一[8,9]。因此，在代謝組學分析中代謝物數(shù)據(jù)庫是必不可少的，常見的微生物代謝數(shù)據(jù)庫有BioCyc Pathway、KEGG、NMD等。一些具有代表性的(微生物)代謝組學研究相關(guān)數(shù)據(jù)庫及其功能見表1。

代謝組學的研究方法主要有靶向(targeted metabolomics)和非靶向(untargeted metabolomics)分析兩種(見圖1)[10]。靶向代謝組學旨在研究與假設(shè)生物學問題相關(guān)的潛在生物標記物或預(yù)選代謝物，是對特定目標代謝物的檢測和分析，尤其是對單個或已知代謝途徑的檢測和分析。在敏感性、準確性和絕對定量指標方面具有顯著優(yōu)勢。但有通量低、需采用分析標準品進行準確的定性定量分析的缺點。相反，非靶向涉及對所有內(nèi)源性代謝物進行無偏向性的分析，具有通量高、操作簡單等優(yōu)勢，但在敏感性、準確性和定量方面劣勢明顯，同時較依賴公共數(shù)據(jù)庫，難以發(fā)現(xiàn)新物質(zhì)。發(fā)展至今，代謝組學在系統(tǒng)醫(yī)學、動物和植物研究、微生物等領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用[11-14]。

圖1 代謝組學與代謝物組學及其分類研究內(nèi)容

鑒于乳酸菌在與人類生活密切相關(guān)的重要領(lǐng)域都具有很高的應(yīng)用價值，眾多學者在乳酸菌相關(guān)研究中，已嘗試使用代謝組學技術(shù)，并在菌種鑒定、研究代謝路徑和代謝產(chǎn)物以及評價發(fā)酵食品等方面取得了一定的成果。本文就乳酸菌代謝組學的研究進展進行了綜述，以期進一步推動代謝組學在乳酸菌研究領(lǐng)域的應(yīng)用。

表1 (微生物)代謝組學研究相關(guān)數(shù)據(jù)庫

1 代謝組學在乳酸菌分類和鑒定中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的乳酸菌分類方法需要做大量的生理生化試驗，且過程繁瑣，結(jié)果不穩(wěn)定[15]。隨著分子生物學的飛速發(fā)展，基于基因型進行菌種分類的方法得到了廣泛的應(yīng)用，但是，由于基因復雜性，這類分類方法可能會產(chǎn)生一定的錯誤或者對遺傳關(guān)系近的菌株的區(qū)分效果不好。而代謝物是細胞生命活動的終端產(chǎn)物，通?；蛏系奈⑿∽兓紩a(chǎn)生明顯不同的代謝表型，所以利用代謝組學分析方法研究微生物代謝物譜的差異可以實現(xiàn)不同菌株的表型分類。

熊萍等[16]采用1H-NMR代謝組學方法研究了變異鏈球菌、血鏈球菌和嗜酸乳桿菌的胞外代謝產(chǎn)物，結(jié)果表明：代謝組學方法能夠檢測不同菌株的差別，在微生物鑒定中有良好的應(yīng)用前景；Samelis等[17]采用傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared, FTIR)方法獲得了傳統(tǒng)希臘Graviera奶酪中乳酸菌胞外代謝物的紅外光譜圖，通過與數(shù)據(jù)庫比較實現(xiàn)了乳酸菌的鑒定；Yang等[18]將三重四極質(zhì)譜儀(MS)與線性離子阱-軌道雜交質(zhì)譜(MS)相結(jié)合，利用靶向和非靶向代謝組學技術(shù)，研究了它們在破譯4個密切相關(guān)的乳桿菌/菌株中細微代謝差異方面的能力和性能。實驗通過檢測到的代謝物數(shù)量、變異系數(shù)(CV)分布、信號強度分布等進一步評價數(shù)據(jù)質(zhì)量。在相同的生長條件下，所建立的平臺最終被用于區(qū)分4種乳酸菌。

長期以來，人們認識到乳酸菌的生理生化鑒定的復雜和不確定性?，F(xiàn)有的DNA-DNA雜交技術(shù)是一種費時費力的方法，甚至阻礙了我們對乳酸菌物種分類關(guān)系的認識。此外，乳酸菌種類間營養(yǎng)需求的相似性也妨礙了傳統(tǒng)方法的鑒定。代謝組學方法分析速度快、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點使其在細菌檢測和鑒定中的應(yīng)用成為可能。此外，組合代謝組學方法在快速鑒別與人類健康密切相關(guān)的乳酸菌菌株方面具有巨大的潛力，在今后的研究中對它們在更復雜的細菌生長條件下的效用進行驗證。

2 代謝組學在發(fā)酵工程中的應(yīng)用

乳酸菌在不同的環(huán)境下會產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，主要是碳水化合物、揮發(fā)性的醇、酮、氨基酸、短鏈有機酸、長鏈脂肪酸和一些復雜的成分(抑菌物質(zhì)、肽類等)，所以監(jiān)測乳酸菌代謝過程中產(chǎn)物的變化尤為重要。

Suzanne等[19]采用綜合二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜代謝物譜分析方法(GC×GC-TOF/MS)，進行揮發(fā)性和非揮發(fā)性化合物的非目標檢測，測定了布赫內(nèi)氏乳桿菌LA1147厭氧發(fā)酵黃瓜腐爛以及自然微生物繁殖腐敗過程中發(fā)生的變化。單因素方差分析與層次聚類分析相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)92個代謝物在腐爛過程中發(fā)生了變化。大多數(shù)代謝物的變化先于乳酸的利用，表明乳酸不是發(fā)酵黃瓜厭氧腐壞菌的首選基質(zhì)。研究檢測乳酸利用前的生化變化的能力顯示，瓜氨酸、海藻糖和纖維二糖作為化合物，在任何顯著的產(chǎn)品降解之前，都可能表明布赫內(nèi)氏乳桿菌菌株的代謝活性；Satoru等[20]采用核磁共振和固相微萃取-GC/MS兩種代謝組學方法，對54個水溶性化合物和62個揮發(fā)性化合物進行了化學成分分析。此研究分析了日本Kiso地區(qū)以蘿卜葉為原料生產(chǎn)的一種傳統(tǒng)的無鹽乳酸發(fā)酵泡菜Sunki的組成特征。主成分分析表明，根據(jù)農(nóng)產(chǎn)品加工廠和生產(chǎn)年份的不同，樣品具有不同的組成。這種差異是由于Sunki泡菜自發(fā)發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乳酸細菌群落和蘿卜葉初始營養(yǎng)成分的差異所致；Li等[21]通過氨基酸、膽汁、脂肪酸、葡萄糖等代謝途徑，證實了植物乳桿菌NCU116對高脂血癥大鼠的改善作用。他們采用超高效液相色譜-四極飛行時間質(zhì)譜(UPLC-QTOF/MS)的代謝組學方法，研究了植物乳桿菌NCU116對高脂飼料喂養(yǎng)高脂血癥大鼠模型代謝產(chǎn)物的影響，鑒定了9種潛在的生物標志物(泛酸、5-羥基吲哚乙醛、甘膽酸、膽綠素IX、L-亮氨酸、2-苯乙醇葡萄糖醛酸、牛膽堿、吲哚丙烯酸和2-花生四烯醇甘油)，并利用質(zhì)譜軟件(MPP)分析了其途徑特征。

發(fā)酵工藝的監(jiān)控和優(yōu)化需要檢測大量的參數(shù)，利用代謝組學研究工具可以減少實驗數(shù)量，提高檢測通量，并有助于揭示發(fā)酵過程的生化網(wǎng)絡(luò)機制，從而有利于理性優(yōu)化工藝過程。此外，通過對代謝動力學的相關(guān)研究，可以掌握代謝途徑以及代謝網(wǎng)絡(luò)中的酶動力學關(guān)鍵參數(shù)，這對于關(guān)鍵參數(shù)的調(diào)控對代謝工程的優(yōu)化將產(chǎn)生直接的促進作用。可見，代謝組學相關(guān)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用使系統(tǒng)分析或控制復雜的發(fā)酵過程成為可能。

3 代謝組學在評價發(fā)酵食品中的應(yīng)用

許多發(fā)酵食品中既有營養(yǎng)成分又有非營養(yǎng)成分，它們具有調(diào)節(jié)人類健康的潛力。代謝組學在食品科學領(lǐng)域被用于監(jiān)測原材料和最終產(chǎn)品的質(zhì)量、加工、安全和微生物學，以提高消費者的健康和信心。世界上90%的天然發(fā)酵食品是在傳統(tǒng)條件下發(fā)酵產(chǎn)生的[22]。根據(jù)原料的不同，利用特定、生態(tài)位適應(yīng)的乳酸菌屬和物種進行發(fā)酵，生產(chǎn)各種發(fā)酵食品和飲料，如酸奶、發(fā)酵乳、泡菜等。參與發(fā)酵的乳酸菌在發(fā)酵過程中起主導作用，能夠提高發(fā)酵食品的營養(yǎng)價值[23]，同時，乳酸菌本身代謝也能產(chǎn)生核酸、腺苷、鳥嘌呤、次黃嘌呤等，使其發(fā)酵的食品產(chǎn)生獨特的風味[24]，基于以上乳酸菌的生物學特性，使其在食品發(fā)酵中被廣泛應(yīng)用。乳酸菌發(fā)酵食品的實例和所涉及的菌種見表2[25]。此外，在評定發(fā)酵食品的感官和營養(yǎng)品質(zhì)方面，代謝組學也發(fā)揮著重要的作用。

表2 乳酸菌在發(fā)酵食品及飲料中的應(yīng)用

續(xù) 表

Frank等[26]利用氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜(ultrafast gas chromatography coupled to time of flight mass spectrometry,ultrafast GC/TOF-MS)聯(lián)用儀構(gòu)建揮發(fā)性風味物質(zhì)的指紋圖譜，同時采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)的代謝組學方法研究個別乳酸菌菌株以及不同乳酸菌菌株組合對于發(fā)酵乳風味的影響；Sarn等[27]采用固相微萃取-氣相色譜/質(zhì)譜和1H-NMR輔助代謝組學方法，分別鑒定出37種揮發(fā)性代謝物和43種非揮發(fā)性代謝物。結(jié)果表明，鼠李乳桿菌GG和動物雙歧桿菌BB-12均不影響乳酸的酸度和關(guān)鍵香氣揮發(fā)性代謝產(chǎn)物。然而，在貯藏過程中，鼠李糖的存在對酸奶的非揮發(fā)性代謝物譜有一定的貢獻；李汴生等[28]利用植物乳桿菌LP-115 400B對幾種不同果蔬汁進行發(fā)酵，并通過靜態(tài)-頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)和氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)分析各果蔬汁發(fā)酵前后揮發(fā)性風味和滋味物質(zhì)的變化，同時結(jié)合定量描述分析(quantitative descriptive analysis, QDA)方法進行感官評價，探討了乳酸菌發(fā)酵對果蔬汁風味感官品質(zhì)產(chǎn)生的影響和適配性問題，結(jié)果表明，乳酸菌發(fā)酵代謝對不同果蔬汁風味影響差異較大。

利用發(fā)酵食品中代謝物譜的研究，觀察發(fā)酵過程中代謝物的變化，以及預(yù)測發(fā)酵終產(chǎn)物感官和營養(yǎng)質(zhì)量已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。代謝組學可以作為一種重要的信息工具，適合于快速選擇菌株/底物組合，并能夠同時增加發(fā)酵食品的感官和健康促進特性。

4 代謝組學在評價乳酸菌益生效果方面的應(yīng)用

近年來，益生菌的研究在全球范圍內(nèi)已經(jīng)形成熱潮，益生作用已被國際公認并不斷發(fā)現(xiàn)新的功能[29]。乳酸菌是乳酸菌群的主要屬，在人體中起著重要的作用。它們是重要的微生物群，可在許多人體部位被發(fā)現(xiàn)。許多乳酸菌種常被用作益生菌，在適當?shù)膭┝肯驴梢杂幸嬗谒拗鞯慕】怠＝陙?，乳酸菌對健康的作用持續(xù)受到了國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。

Hong等[30]采用1H-NMR和多元數(shù)據(jù)分析相結(jié)合的方法，對雄性小鼠糞便提取物進行代謝譜分析，評價益生菌對結(jié)腸炎癥的影響。結(jié)果表明，益生菌不僅可以促進細胞因子表達，還可以提升血漿中部分短鏈脂肪酸、氨基酸、核苷酸、碳水化合物和乳酸含量；感染性乳腺炎是泌乳婦女的常見疾病，以葡萄球菌和鏈球菌為主要病因。在這方面，從母乳中分離出的一些乳酸菌株似乎對治療乳腺炎有良好的效果，因此，是抗生素治療的一種有吸引力的選擇?；诤舜殴舱竦拇x組學的應(yīng)用使人們能夠確定益生菌消費對患乳腺炎婦女的總體影響，并強調(diào)了這種方法在評估益生菌消耗成果方面的潛力。Rosa等[31]采用1H-NMR代謝組學方法，檢測女性乳腺炎患者服用益生菌株(唾液乳桿菌PS2)后代謝組學差異。此外，Huynh等[32]研究了以半乳糖(GOS)和植物乳桿菌7-40菌株組成的飼糧共生體對凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)免疫應(yīng)答、免疫相關(guān)基因表達及對溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)的抗藥性的協(xié)同效應(yīng)。采用1H-NMR代謝組學分析方法，對肝胰臟代謝產(chǎn)物進行了研究，并用反相高效液相色譜(RP-HPLC)和分光光度法對肝胰臟和血漿中的代謝產(chǎn)物進行了鑒定。

代謝組學是研究益生菌對宿主健康影響的有力工具。通過結(jié)合宿主蛋白質(zhì)組學和基因組學的研究，可以提供有關(guān)益生菌對消費者健康影響的新信息。此外，代謝組學還可以提供有關(guān)使用益生菌株對健康受試者和患有不同疾病的人的代謝行為影響的信息。

5 代謝組學在乳酸菌代謝物淬滅和提取的研究進展

微生物代謝組學中沒有關(guān)于微生物代謝活性瞬間淬滅、代謝物綜合提取和相關(guān)代謝物分析的標準，因此細胞內(nèi)代謝物的有效和可靠定量一直受到阻礙。雖然快速過濾法和微分法能有效地抑制代謝活性[33,34]，減少滲漏，但這些方法都是微生物特異性的[35]，無法防止代謝物的泄漏。因此，在制定精準定量細胞內(nèi)代謝物的淬滅方案時，由于不同生物體細胞壁結(jié)構(gòu)和膜組成的固有差異，人們不得不為每1種實驗微生物確定最佳的淬滅或提取方法。

最常用的淬滅方法是在-40 ℃左右使用60%(V/V)的甲醇(MeOH)水溶液。該方法最初是針對釀酒酵母開發(fā)的[36]，并廣泛應(yīng)用于其他微生物，無需優(yōu)化或驗證。然而，在低溫和高濃度MeOH引起冷沖擊和嚴重泄漏后[37,38]，出現(xiàn)了較溫和的淬滅方法，但各種方法的優(yōu)缺點并未進行系統(tǒng)的對比。

Jensen等[39]提出了一種測定乳酸乳球菌胞內(nèi)磷酸化糖濃度的實驗方法。先將小體積的生長介質(zhì)快速取樣到60%(V/V)的甲醇中，預(yù)冷卻到-35 ℃，使所有代謝活動迅速完全停止。而后氯仿在-25 ℃條件下進行液體-液體萃取，確保細胞膜對所需代謝物的總滲透性，以及可改變酶水平的失活。最后使用與磷酸化組分具有高度親和力的柱進行固相萃取。但是實驗過程中當乳酸乳球菌與冷甲醇接觸時其代謝物就會從細胞中漏出，并存在于介質(zhì)中和淬火后的生物質(zhì)中；植物乳桿菌(L.plantarum)作為一種與人類密切相關(guān)的微生物，其代謝產(chǎn)物的研究卻很少受到重視。Faijes等通過比較了4種不同的水淬液(均含60%甲醇)的效率，發(fā)現(xiàn)只有含有70 mmol/L HEPES或0.85%(W/V)碳酸銨(pH 5.5)的溶液可以顯著地減少細胞內(nèi)代謝物的滲漏。研究人員同時比較了冷甲醇、高氯酸、煮沸乙醇、氯仿/甲醇(1∶1)和氯仿/水(1∶1)的5種不同提取方法，并對具有代表性的細胞內(nèi)代謝物進行定量測定，結(jié)果表明，冷甲醇、沸騰乙醇和高氯酸的提取效果最好；Yang等[40]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)，對乳發(fā)酵中常用的重要乳酸菌ZS2058的淬滅和提取工藝進行了評價。定量評價了8種不同濃度MeOH、乙醇Etoh、GOC和二甲基亞砜DMSO在不同溫度下的淬滅方法，并分別用碘化丙啶(PI)和系統(tǒng)能荷(EC)法評價了它們對細胞膜完整性和代謝失活的影響。此外，對甲基特丁基醚(MTBE)/MeOH/水、乙腈(ACN)/水、ACN/MeOH/水等溶劑的萃取效率進行了評價。研究優(yōu)化了植物ZS2058代謝物的分析方法，可為植物ZS2058代謝物特異性生物標志物的鑒定和代謝特性的分析提供依據(jù)。

乳酸菌代謝組學中關(guān)于乳酸菌代謝物的淬滅、提取方法和技術(shù)僅限于特定單一的菌株，且僅是能夠?qū)⒋x物泄露降到最低，并不能從根本上解決泄露問題。同時，由于乳酸菌種中代謝物的復雜性，很難通過單一的方法對全部代謝物進行提取，因此未來的發(fā)展可以將多種組學技術(shù)和多種提取方法相結(jié)合進行深入研究。

6 展望

首先，微生物領(lǐng)域正在出現(xiàn)許多代謝組學數(shù)據(jù)庫，但它們僅限于特定的微生物(酵母菌和大腸桿菌)。由于微生物代謝物的多樣性和復雜性，目前關(guān)于許多微生物包括乳酸菌的標注代謝數(shù)據(jù)庫目前還沒有完善。

其次，哺乳動物的代謝途徑似乎不能完全應(yīng)用于微生物，因為哺乳動物中不存在許多微生物反應(yīng)，例如次級代謝物的生物合成。由于現(xiàn)有的途徑數(shù)據(jù)不能完全滿足微生物代謝組學的需要，因此有必要為微生物識別建立特定的代謝途徑和網(wǎng)絡(luò)。

最后，目前的微生物代謝組學研究大多只關(guān)注代謝物，很少考慮代謝物的來源。例如，來自微生物和宿主的葡萄糖在化學上是相同的，但其生物學意義和導致它們差異調(diào)節(jié)的機制各不相同。因此，對微生物和宿主的代謝變化進行不同的研究，尤其是對微生物與宿主相互作用的研究具有重要意義。

總之，隨著代謝組學技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，其在乳酸菌研究中將發(fā)揮更重要的作用。