李素云，劉興麗，張艷艷，張華，李星科，吳燕青

(鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,鄭州 450002)

1 概述

小麥蛋白又稱面筋蛋白，是小麥淀粉加工的副產(chǎn)物，由于其具有較強(qiáng)的粘彈性、延伸性、薄膜成型性、吸脂乳化性等多種獨(dú)特物理性質(zhì)，因此在食品工業(yè)中具有重要應(yīng)用[1]。但是小麥蛋白分子遇水極易交聯(lián)形成粘彈性強(qiáng)的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，分散性差，不溶于水，這些特性使得小麥蛋白的應(yīng)用具有一定的局限性。因此，許多研究利用物理、化學(xué)和生物等技術(shù)改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和分子排布，進(jìn)而改善蛋白質(zhì)的功能特性[2,3]。

本文擬通過超聲處理小麥蛋白過程中產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)剪切、空化等作用改變其空間結(jié)構(gòu)，促進(jìn)蛋白質(zhì)與多糖的相互作用，協(xié)同對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，從而改善蛋白的功能、界面性質(zhì)和乳化性質(zhì)。通過超聲協(xié)同殼聚糖改善后的小麥蛋白有許多用途，比如用于保鮮的可食用膜以及微膠囊包埋營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和調(diào)味料等[4，5]。

本文的研究思路是利用濁度法、掃描電鏡分析法、紫外-可見吸收光譜法和熒光光譜法研究超聲處理作用調(diào)控小麥蛋白與殼聚糖所形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，解析不同pH值下小麥蛋白-殼聚糖復(fù)合物在加熱、鹽離子、不同復(fù)合比等條件下的狀態(tài)變化和作用機(jī)理，為研究超聲作用下的蛋白和陽(yáng)離子多糖的相互作用提供理論基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

小麥蛋白(蛋白質(zhì)含量82%)：徐州澳凱小麥淀粉有限公司；殼聚糖(食品級(jí))：平均分子量在150～500 kDa，脫乙酰度大于90%，水分8.0%，灰分0.7%：鄭州優(yōu)然食品配料有限公司；主要試劑冰乙酸、氫氧化鈉等：均為化學(xué)試劑，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

VCX750超聲波細(xì)胞破碎儀 上海苑勝儀器設(shè)備有限公司；UV-3200S紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；F-7000熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；SEM、JSM-6490LV掃描電鏡 日本JEOL公司。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 小麥蛋白的超聲處理

稱取一定質(zhì)量的小麥蛋白分散于去離子水中,配制成蛋白濃度為5 mg/mL，然后進(jìn)行超聲預(yù)處理。超聲參數(shù)為：超聲功率169 W/cm2，超聲10 min，間歇比為4/2 s，得到超聲預(yù)處理的小麥蛋白溶液。

2.3.2 小麥蛋白-殼聚糖溶液的制備

制備濃度為10 mg/mL的殼聚糖溶液：稱取一定質(zhì)量的殼聚糖溶解在濃度為0.1 mol/L、pH為3.0的乙酸緩沖液中，在室溫下(20 ℃)攪拌3 h，放入冰箱中水化靜置12 h。

小麥蛋白-殼聚糖溶液的制備：將蛋白與殼聚糖按照一定質(zhì)量比、不同比例混合后，通過補(bǔ)足乙酸緩沖液，調(diào)節(jié) pH 的方式制得。本文討論的復(fù)合溶液是在不同pH(3.0～8.0)、不同蛋白質(zhì)-殼聚糖復(fù)合比(簡(jiǎn)稱不同復(fù)合比)、不同離子強(qiáng)度(氯化鈉)和加熱條件下(60 ℃)形成的。通過觀察其濁度來表征復(fù)合溶液的穩(wěn)定性。

2.3.3 復(fù)合物濁度的測(cè)定

利用分光光度計(jì)來檢測(cè)小麥蛋白-殼聚糖復(fù)合溶液的濁度。復(fù)合溶液靜置穩(wěn)定30 min后將待測(cè)樣品倒入比色皿中，在600 nm處測(cè)其吸光值，每組樣品平行3次，取平均值。

2.3.4 復(fù)合物粉末的制備

在pH為6的條件下將殼聚糖、小麥蛋白、小麥蛋白-殼聚糖(WP-CS)、超聲處理的小麥蛋白-殼聚糖(超聲WP-CS)溶液進(jìn)行真空冷凍干燥處理，得到固體粉末。

2.3.5 復(fù)合物的熒光光譜分析

將依據(jù)2.3.4制得的凍干粉末用0.1 mol pH為7的磷酸緩沖液溶解稀釋，使蛋白質(zhì)含量為0.25 mg/mL，離心取上清液。采用F-7000型熒光光譜儀進(jìn)行熒光測(cè)定，實(shí)驗(yàn)選擇260 nm下激發(fā)，掃描范圍為270～450 nm，掃描速度為240 nm/min,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬為5 nm，所用樣品池長(zhǎng)為1.0 cm。

2.3.6 復(fù)合物溶液紫外-可見吸收光譜分析

將2.3.5制得的上清液用0.1 mol pH為7的磷酸鹽緩沖液適度稀釋，使得蛋白質(zhì)含量為0.06 mg/mL，用于紫外-可見光譜分析，光波波長(zhǎng)設(shè)定范圍為220～400 nm，分辨率為0.5 nm，測(cè)定時(shí)以磷酸鹽緩沖液作為空白。

2.3.7 復(fù)合物掃描電鏡分析

使用SEM測(cè)復(fù)合物的微觀形態(tài)。首先取少量均勻的粉末狀樣品用雙面膠固定，將固定后的樣品放入離子濺射裝置中涂金作為導(dǎo)電膜，時(shí)間設(shè)定為120～130 s。

3 結(jié)果分析

3.1 不同pH值對(duì)小麥蛋白-殼聚糖復(fù)合體系溶解性的影響

體系的pH值對(duì)大生物聚合物電荷密度影響很大，從而影響聚合強(qiáng)度。不同pH 值對(duì)殼聚糖、小麥蛋白和WP-CS(2∶1)溶解性的影響見圖1。

圖1 不同pH 值對(duì)殼聚糖、小麥蛋白和小麥蛋白-殼聚糖(2∶1)溶解性的影響

由圖1可知，溶液體系有澄清、半透明、渾濁，部分相分離和完全相分離狀態(tài)。CS在pH 7～8時(shí)狀態(tài)為渾濁，其他狀態(tài)都是澄清的，這是因?yàn)殡S著 pH 增高并達(dá)到 CS 的 pKa 值以后，CS所帶的正電荷逐步降低，發(fā)生聚集并產(chǎn)生渾濁狀態(tài)。小麥蛋白在 pH 7～8時(shí)發(fā)生部分相分離，這是由小麥蛋白的等電點(diǎn)決定的。當(dāng)在WP溶液中加入CS時(shí)，相分離的pH 范圍從pH 5～7上升到 pH 6～8。這是由于當(dāng)pH值大于等電點(diǎn)時(shí)小麥蛋白攜帶負(fù)電荷，隨著帶有陽(yáng)離子性質(zhì)的殼聚糖的增加，混合物出現(xiàn)了不同程度的凝聚現(xiàn)象。

3.2 超聲預(yù)處理小麥蛋白對(duì)復(fù)合物在不同復(fù)合比條件下膠體穩(wěn)定性的影響

圖2 超聲預(yù)處理小麥蛋白-殼聚糖復(fù)合物在不同復(fù)合比條件下的膠體穩(wěn)定性

研究證實(shí)，體系中蛋白與多糖的比例會(huì)影響其復(fù)合物的穩(wěn)定性[6]。由圖2(a)可知，未經(jīng)過超聲處理的復(fù)合物，復(fù)合體系的濁度隨著pH值的增加而變大，當(dāng)pH達(dá)到6時(shí)，濁度最大；但是隨著復(fù)合比中蛋白含量的增加，濁度出現(xiàn)先增大后減少的趨勢(shì)，并在復(fù)合比為2∶1時(shí)達(dá)到最高。這是因?yàn)榈鞍走^高會(huì)導(dǎo)致過多的蛋白聚集在復(fù)合物表面，產(chǎn)生排斥力，因而濁度下降，此研究結(jié)果和Dickinson E等[7]研究的β-乳球蛋白與黃原膠的復(fù)合體系結(jié)論相似。

由圖2(b)可知，經(jīng)過超聲處理的WP-CS復(fù)合體系，其濁度的變化趨勢(shì)和未超聲的復(fù)合物體系相同，但是濁度的最大值與未超聲處理相比顯著降低?？赡苁且?yàn)槌曌饔檬沟鞍踪|(zhì)內(nèi)部的氨基酸殘基暴露在外，增加了蛋白質(zhì)的表面電荷，加大了與殼聚糖的結(jié)合，進(jìn)而改變復(fù)合物的溶解性。Yang等[8]研究表明，超聲處理能夠明顯提高蛋白質(zhì)的溶解性、蛋白質(zhì)懸浮液的乳化、蛋白質(zhì)亞基的聚合。綜上所述，選擇復(fù)合比為2∶1進(jìn)行其他影響因素研究。

3.3 超聲預(yù)處理小麥蛋白-殼聚糖復(fù)合物在加熱條件下對(duì)膠體穩(wěn)定性的影響

溫度是影響蛋白質(zhì)-殼聚糖復(fù)合物膠體穩(wěn)定性的另一個(gè)重要因素，WP-CS復(fù)合物通過加熱處理會(huì)在短時(shí)間內(nèi)改變體系間相互作用力的平衡，從而改變復(fù)合體的穩(wěn)定性[9]。

圖3 超聲預(yù)處理小麥蛋白-殼聚糖復(fù)合物在加熱條件下對(duì)膠體穩(wěn)定性的影響

由圖3可知，僅對(duì)復(fù)合物進(jìn)行加熱處理可以引起體系濁度的降低，這是由于熱處理在短時(shí)間內(nèi)會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性，使處在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的部分疏水基團(tuán)裸露在外部，導(dǎo)致蛋白質(zhì)與殼聚糖之間的疏水作用增強(qiáng)；當(dāng)超聲和加熱協(xié)同作用時(shí)，和未超聲相比，濁度在低pH和高pH沒有顯著性差異，但是在pH 6～8之間，加熱聯(lián)合超聲使復(fù)合體系的濁度急劇下降，推測(cè)原因可能是超聲的空穴效應(yīng)加大了與液體的接觸面積并且形成的大量氣泡使蛋白質(zhì)周圍的壓強(qiáng)增大[10]，促使親水氨基酸暴露出來，聚合體更加穩(wěn)定，從而使復(fù)合體系的濁度降低。

3.4 超聲預(yù)處理小麥蛋白對(duì)復(fù)合物在鹽離子條件下膠體穩(wěn)定性的影響

鹽離子的存在會(huì)屏蔽殼聚糖鏈上的正電荷，改變蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈上的電荷分布，使蛋白質(zhì)與殼聚糖的相互作用減小，造成結(jié)合能力降低。

圖4 超聲預(yù)處理小麥蛋白-殼聚糖復(fù)合物在鹽離子條件下對(duì)膠體穩(wěn)定性的影響

由圖4可知，鹽離子的存在導(dǎo)致復(fù)合體系濁度降低，這可能是小麥蛋白中的球蛋白溶于鹽溶液的原因。但是超聲對(duì)復(fù)合體系的濁度影響是在低pH時(shí)升高的，在高pH時(shí)濁度降低，原因可能是低pH時(shí)超聲導(dǎo)致球蛋白溶解性降低，在較高pH 時(shí)使部分蛋白聚集成大分子，從而使?jié)岫冉档汀?/p>

3.5 超聲預(yù)處理小麥蛋白對(duì)復(fù)合物凝膠體系的熒光強(qiáng)度影響

內(nèi)源性熒光對(duì)蛋白質(zhì)的色氨酸殘基的微環(huán)境變化和空間結(jié)構(gòu)變化具有較高的靈敏度和選擇性等優(yōu)點(diǎn)[11]，成為研究WP-CS復(fù)合體系相互作用最有效的方法。

圖5 小麥蛋白-殼聚糖復(fù)合物溶液的熒光光譜

由圖5可知，殼聚糖的加入以及超聲處理都對(duì)小麥蛋白產(chǎn)生一定的影響，復(fù)合物的熒光強(qiáng)度明顯大于純蛋白，且峰值發(fā)生輕微的藍(lán)移。推測(cè)可能是由于殼聚糖的加入使小麥蛋白色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生輕微的變化。超聲處理后的WP-CS復(fù)合物較未超聲處理的復(fù)合物熒光強(qiáng)度降低，說明超聲處理改變了蛋白質(zhì)的三級(jí)空間結(jié)構(gòu)，使酪氨酸和色氨酸殘基暴露，進(jìn)而影響了與殼聚糖之間的相互作用，使熒光強(qiáng)度較未超聲處理的降低。

3.6 超聲預(yù)處理小麥蛋白對(duì)復(fù)合物凝膠體系的紫外-可見吸收光譜影響

紫外-可見光譜法是研究蛋白質(zhì)的三級(jí)構(gòu)象是否發(fā)生改變的一種最常用的實(shí)驗(yàn)手段，通過對(duì)其進(jìn)行紫外分析來獲得更多蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的信息[12]。

圖6 小麥蛋白-殼聚糖復(fù)合體系的紫外可見吸收光譜

由圖6可知，隨著殼聚糖的加入，WP-CS復(fù)合體系的最大吸收峰增加并發(fā)生了輕微的紅移，可能是由于蛋白質(zhì)與殼聚糖之間的相互作用改變了蛋白質(zhì)所處的微環(huán)境。同時(shí)，超聲處理WP-CS復(fù)合體系，使最大吸收峰降低并發(fā)生了紅移，這說明蛋白質(zhì)的三級(jí)構(gòu)象發(fā)生改變，這是由于超聲處理使氨基酸殘基向更加疏水的環(huán)境中移動(dòng)。

3.7 超聲預(yù)處理小麥蛋白對(duì)復(fù)合物凝膠體系的微觀結(jié)構(gòu)影響

圖7 小麥蛋白-殼聚糖復(fù)合體系的電鏡分析

通過掃描電鏡觀察復(fù)合物的微觀結(jié)構(gòu)可以推測(cè)出蛋白分子的功能性質(zhì)如何改變。由圖7(a)可知，殼聚糖呈扁平狀分布，體積較大；圖7(b)中蛋白質(zhì)呈無規(guī)則顆粒、球狀，體積較??；而圖7(c)呈現(xiàn)出蛋白附著在扁平塊狀上，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)溶液在高于其等電點(diǎn)時(shí)開始帶負(fù)電荷，與殼聚糖帶正電荷相互靜電作用，出現(xiàn)了凝聚現(xiàn)象。圖7(d)中復(fù)合物經(jīng)過超聲處理，與圖7(c)相比，顆粒分布均勻，蛋白附著在殼聚糖表面上的顆粒增加。這是因?yàn)榻?jīng)過超聲處理，使更多的疏水基團(tuán)暴露于蛋白表面，蛋白質(zhì)分子打開，增大了與殼聚糖的溶解性，使復(fù)合物形成一種致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

4 結(jié)論

本研究選擇超聲和未超聲的小麥蛋白與殼聚糖形成復(fù)合水溶液體系，并通過調(diào)控 pH 值、復(fù)合比、溫度和離子強(qiáng)度來對(duì)比研究WP-CS和UWP-CS所形成的復(fù)合體系的相行為，得到如下結(jié)論：

WP-CS和UWP-CS形成穩(wěn)定膠體的最佳條件均是WP∶CS為2∶1，pH為6，溫度為20 ℃，無鹽離子情況下，在低超聲功率下，UWP-CS的穩(wěn)定性強(qiáng)于WP-CS。在加熱和添加鹽離子的條件下，UWP-CS復(fù)合體系的濁度要低于WP-CS，說明超聲處理使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部分打開，柔性增強(qiáng)，加大了與殼聚糖結(jié)合的能力；通過紫外-可見吸收光譜、熒光光譜和掃描電鏡對(duì)WP-CS和UWP-CS復(fù)合物結(jié)構(gòu)性質(zhì)分析可知，與未超聲的復(fù)合物相比，超聲處理可使蛋白質(zhì)的三級(jí)構(gòu)象和所處的微環(huán)境改變，凝聚物減少，可溶性復(fù)合物增加，與殼聚糖的相互作用加強(qiáng)，從而影響復(fù)合體系的穩(wěn)定性及其他相關(guān)性質(zhì)。