田野，李亞楠，吳征，王紫薇，陳鳳蓮，曲敏

(哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院黑龍江省普通高校食品科學與工程重點實驗室,哈爾濱 150076)

植物冰結構蛋白(ice structural proteins，ISPs)，又稱熱滯蛋白(thermal hysteresis protein，THP)或抗凍蛋白(antifreeze protein，AFPs)，是植物體經(jīng)低溫誘導后產(chǎn)生的抗逆蛋白，普遍存在于寒冷、高海拔地區(qū)的越冬植株體內(nèi)[1,2]，通過控制冰晶生長和抑制細胞外重結晶，以減小大冰晶對機體的損傷。相比魚類和昆蟲ISPs，植物ISPs具有熱滯活性低和較強的重結晶抑制功能[3]，通過范德華表面張力的作用以及可能參與的氫鍵作用使冰核和ISPs緊密結合，從而抑制冰核生長[4]。植物ISPs的起步較晚，19世紀末，Griffith等[5]首次在冬黑麥葉子中分離純化ISPs，隨后在許多多年生的植物，如胡蘿卜(Daucuscarota)、小麥(Triticumaestivum)、女貞葉(Ligustrumlucidum)、苜蓿(MedicagosativaL.)等40余種植株體內(nèi)檢測出ISPs[6-9]。2006年，我國衛(wèi)生部公布ISPs可以作為新型食品添加劑添加到冷凍食品中。由于魚類ISPs價格昂貴，不適于在大規(guī)模的食品工業(yè)加工中應用，因此，探索來源廣泛、價格低廉、食物源的植物ISPs成為研究熱點。

分蘗洋蔥(AlliumcepaL.var.multiplcansBailey syn.var.AgrogatumDon)又名毛蔥或珠蔥，為百合科蔥屬，植株叢生，分蘗能力強[10]。分蘗洋蔥生育期短，適宜在黑土地生長，具有很強的抗寒性，是黑龍江傳統(tǒng)栽培品種[11]。本研究采用冰結合磷酸鹽緩沖溶液法提取分蘗洋蔥冰結構蛋白(Alliumice structural proteins，AISPs)，采用SDS-PAGE確定AISPs的分子量，并將其應用于安琪酵母的抗凍保護中以期得到廉價的植物食物源ISPs，拓寬ISPs的種質(zhì)資源，并對分蘗洋蔥抗凍機理提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮分蘗洋蔥(市售)：產(chǎn)地黑龍江；安琪耐低糖高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；磷酸氫二鈉、無水乙醇、甘油、甲醇：天津市天力化學試劑有限公司；考馬斯亮藍G250、考馬斯亮藍R250：上海邁坤化工有限公司；十二烷基硫酸鈉：北京生東科技有限公司；冰醋酸：上海豪申化學試劑有限公司；溴酚藍：沈陽先創(chuàng)化工有限公司；二硫代蘇糖醇：上海前塵生物科技有限公司；Tris buffer：上海葉舟生物科技有限公司；丙烯酰胺、TEMED、蛋白Marker：天津市旭泰化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TGL-16型高速臺式離心機 上海醫(yī)療器械六廠；BCD-216YH電冰箱 美的集團；SDS-PAGE電泳儀、R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 北京市君意機電技術公司；UV-紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；DL-1冷凍干燥機 寧波市雙嘉儀器有限公司；ESJ 180-4型電子天平 沈陽龍騰電子稱量儀器公司；DYCZ-24DN粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；LG10磁力攪拌器 天津市歐諾儀器儀表有限公司；SHB-1循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；Motic BA200電子顯微鏡 深圳顯盛儀器有限公司。

1.3 AISPs的提取

1.3.1 提取方法及工藝流程

AISPs提取工藝流程圖見圖1。

圖1 AISPs提取工藝流程圖

1.3.2 單因素試驗

由于ISPs具有能結合于冰表面并與冰形成不可逆的結合特點，本研究采用本組改進的冰結合PBS溶液法提取AISPs。分別考察磷酸緩沖溶液(PBS)的濃度、料液比、冰球添加量對AISPs提取率的影響。

將新鮮分蘗洋蔥去皮，除雜洗凈，切成小塊放入粉碎機中粉碎，并用4層紗布過濾取汁，棄去濾渣。將濾汁于4000 r/min離心5 min，收集上清液。將上清液與PBS溶液混合，在磁力攪拌器作用下連續(xù)攪拌1.5 h，設定轉(zhuǎn)速為800～1000 r/min。采用考馬斯亮藍法測定此時蛋白含量，計算質(zhì)量，記為M1[12]。

在攪拌提取后的溶液中加入直徑為1 cm的冰球，在-18 ℃環(huán)境下靜置2 min，分離出冰球并棄去溶液，收集冰球待自然融化，測量此時蛋白含量，計算質(zhì)量，記為M2。

待蛋白冰提液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮后，在-18 ℃下冷凍，待冷凍透徹后放入冷凍干燥機中制成蛋白質(zhì)凍干粉。

1.3.2.1 PBS溶液的濃度對AISPs提取率的影響

離心除雜后的分蘗洋蔥濾汁中加入5倍體積pH 8.0的PBS溶液，濃度分別為80，100，120，140，160 mmol/L進行提取，計算蛋白提取率。

1.3.2.2 料液比對AISPs提取率的影響

在離心除雜后的分蘗洋蔥濾汁中加入pH 8.0，濃度為100 mmol/L的PBS溶液，按料液體積比分別為1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9進行提取，計算蛋白提取率。

1.3.2.3 冰球添加量對AISPs提取率的影響

分別按每100 mL混合液20，30，40，50，60個的比例加入冰球，在-18 ℃環(huán)境下靜置2 min。

1.3.3 響應曲面

根據(jù)單因素試驗結果，采用響應面法對AISPs提取工藝進行優(yōu)化，選取料液體積比(A)、緩沖溶液的濃度(B)和冰球的添加量(C)為考察因素，以蛋白提取率為考察指標，進行響應面試驗，見表1。

表1 響應面分析試驗設計因素與水平

采用BBD試驗設計方法設立17組試驗，各因素和響應面值(蛋白提取率)見表2，對數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合，分析各因素的效應，最后得到AISPs提取最佳工藝。

(1)

式中：M1為冰提前混合液中的蛋白質(zhì)含量(mg)；M2為冰提后的蛋白質(zhì)含量(mg)。

1.4 冰結構蛋白全波長掃描

稱取AISPs凍干粉加入蒸餾水配制成濃度為0.5%的蛋白溶液，使用pH 8.0，濃度為91.87 mmol/L的PBS溶液做對照，用UV-紫外可見分光光度計做全波長紫外掃描。

1.5 SDS-PAGE電泳

本試驗根據(jù)曲敏等的方法進行SDS-PAGE凝膠電泳。

1.6 AISP對酵母的保護作用

用YPD培養(yǎng)基將市售安琪酵母干粉活化，制成酵母細胞懸液。取5組菌液分別加入0%、0.5%、1%、1.5%、2%濃度梯度的AISPs，將其放入溫度為-18 ℃的冰箱中進行冷凍處理，以1 d為1個周期，凍融5個周期。采用平板劃線法對每個周期的酵母存活數(shù)進行測定。用美蘭染劑染色后，于40×顯微鏡下觀察拍照菌體形態(tài)。

2 結果與討論

2.1 蛋白標準曲線的測定

圖2 蛋白標準曲線

由圖2可知，蛋白溶液的吸光值與酪蛋白濃度存在正比例關系，線性關系良好，可用于后續(xù)試驗。

2.2 PBS溶液濃度對AISPs提取率的影響

圖3 PBS濃度對蛋白提取率的影響

由圖3可知，隨著PBS溶液濃度的增加，蛋白的提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當PBS濃度在80～100 mmol/L時，洋蔥蛋白所帶的電荷不斷增多，蛋白與水之間的相互作用不斷增大，蛋白與蛋白之間的相互作用不斷減小[13，14]，AISPs提取率逐漸增大。當PBS溶液濃度達到100 mmol/L時，洋蔥蛋白已經(jīng)達到最大的溶解限度，蛋白中的氫鍵斷裂，提取率達到最大值，為38.15%。表明磷酸溶液濃度的增加有利于分蘗洋蔥中的蛋白更充分地溶解于PBS溶液中，從而提高蛋白提取率。而當提取達到飽和時，增加PBS溶液的濃度，則會導致AISPs提取率下降，綜上，冰法提取AISPs的PBS溶液最適濃度為100 mmol/L。

2.3 料液比對AISPs提取率的影響

圖4 料液比對蛋白提取率的影響

由圖4可知，隨著料液比的增加，蛋白的提取率逐漸增大，當料液比達到1∶5時，提取率達到最大值，此后蛋白提取率隨著料液比的增大反而減小。試驗結果表明，料液比的增加有利于分蘗洋蔥中的蛋白更充分地溶解于PBS溶液中[15]。而當料液比大于溶劑用量時，則會導致單位液體中AISPs的含量相對減少，從而降低冰結構蛋白的含量。綜上，冰法提取AISPs的最適料液比為1∶5。

2.4 冰球添加量對AISPs提取率的影響

圖5 冰球添加量對蛋白提取率的影響

由圖5可知，隨著冰球添加量的逐漸增加，蛋白提取率逐漸增高，當冰球添加量達到30個/dL時，提取率達到最大值，此后隨著冰球數(shù)的逐漸增加，蛋白的提取率開始下降。這是由于隨著冰球的不斷增加，冰結構蛋白與冰球接觸的表面積不斷增加，有利于冰與冰結構蛋白之間的特異性結合。隨著冰球數(shù)量的增加，冰結構蛋白逐漸被提取完全。而當冰球過量時，則相當于在提取蛋白溶液中增加溶劑，使冰結構蛋白濃度降低，導致提取率下降。冰法提取AISPs的最適冰球添加量為30個/dL。

2.5 AISPs提取工藝優(yōu)化

2.5.1 回歸方程的建立與方差分析

利用軟件對試驗結果見表2。

表2 AISPs提取率響應曲面試驗設計和結果

進行回歸分析，擬合得到AISPs提取率的二次元回歸方程為：

Y=67.01+2.43A+2.83B+2.16C+4.94AB+2.84AC+3.58BC-12.6A2-12.14B2-6.4C2。

(2)

表3 AISPs提取率回歸模型

由表3可知，失擬項不顯著，表明模型的擬合程度良好，未知因素對試驗結果的干擾較少，模型的方差分析說明該模型已經(jīng)達到顯著水平(P<0.05)。由P值可知各因素對AISPs提取率的影響為：冰球個數(shù)>料液比>PBS濃度。校正系數(shù)RAdj2為0.95，變異系數(shù)(C.V.)為7.33%<10%，決定系數(shù)R2為0.98，說明多項式模型的利用性和精密度是可行的，通過此模型方程能預測出AISPs在任何變量值下的提取率。

2.5.2 響應面分析及驗證

因素(料液比、PBS濃度、冰球添加量)交互影響的響應面圖和等高線圖，見圖6～圖8。

圖6 料液比和PBS溶液濃度對蛋白提取率的交互影響

由圖6可知，隨著料液比的增大，冰結構蛋白提取率呈現(xiàn)先增加后緩慢降低的趨勢。PBS濃度為80～120 mmol/L時，提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢；等值線區(qū)域水平表示料液比與PBS濃度之間具有顯著的交互作用。

圖7 料液比和冰球數(shù)量對蛋白提取率的交互影響

圖8 PBS溶液濃度和冰球數(shù)量對蛋白提取率的交互影響

由圖7可知，隨著冰球數(shù)量的不斷增加，提取率呈現(xiàn)先增大后趨于平穩(wěn)的趨勢；隨著料液比的逐漸增大，提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。

由圖8可知，隨著PBS溶液濃度的不斷增高，提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。

通過二次多項式回歸分析求最大值，得到AISPs的最佳工藝為：分蘗洋蔥濾汁與PBS溶液的體積比為1∶5.32，PBS濃度為91.87 mmol/L，冰球添加量為32.57個/dL，在此條件下，AISPs提取率的理論預測值為67.753%。結合最優(yōu)工藝參數(shù)和實際生產(chǎn)可操作性，對各因素進行修訂，最終確定最優(yōu)工藝為：分蘗洋蔥濾汁與PBS溶液的體積比為1∶5.32，PBS濃度為91.87 mmol/L，冰球添加量為33個/dL。在最佳工藝條件下，經(jīng)過3次重復試驗驗證，AISPs的提取率為65.23%，與預測值相近，說明優(yōu)化工藝重復性良好，最優(yōu)工藝的結果可靠。

2.6 全波長掃描結果

圖9 全波長掃描曲線圖

由圖9可知，在波長200～500 nm范圍內(nèi)對蛋白溶液進行紫外-可見光圖譜掃描，可見AISPs在波長為280 nm處有最大吸收峰，且其他波長處曲線較平緩，未見明顯雜峰，而蛋白溶液的紫外-可見分光光譜的最大吸收峰在280 nm波長附近?？芍崛〉牡鞍准兌容^高，說明溶液有蛋白質(zhì)性質(zhì)，蛋白粉中有微量雜質(zhì)或小分子肽存在，屬于正常范圍內(nèi)，進而可以說明本試驗采用AISPs法提取的蛋白純度較高，方法可行。

2.7 AISPs分子量的確定

圖10 SDS-PAGE電泳膠片

注：0為Marker；1,2為AISPs。

由圖10可知，SDS-PAGE電泳結果顯示AISPs由4個蛋白組分組成，其相對分子量分別約為52，29，22，15 kDa。其中，52，22，15 kDa 3個條帶顏色較深，顯示該3個組分含量較高。AISPs條帶較為清晰、筆直顏色較窄，沒有出現(xiàn)明顯的拖尾，說明具有較高的靈敏度和較好的重復性，同時，再次說明冰結合磷酸緩沖溶液法制備的AISPs純度較高，方法可行。

2.8 AISPs對酵母的抗凍保護作用

圖11 耐低糖安琪酵母菌落形態(tài)與菌體圖(40×)

注：A為安琪酵母菌落圖(稀釋涂布105倍)；A1為安琪酵母菌體形態(tài)圖；B為對照、未加AISPs凍融5 d/次的安琪酵母菌落圖(稀釋涂布105倍)；B1為對照、未加AISPs凍融5 d/次的安琪酵母菌體形態(tài)圖(藍色為死亡酵母)；C為1% AISPs、凍融5 d/次的安琪酵母菌落圖(稀釋涂布105倍)；C1為1% AISPs、凍融5 d/次的安琪酵母菌體形態(tài)圖。

由圖11可知，耐低糖安琪酵母菌體呈橢圓形，菌落形態(tài)為乳白色的半圓珠形，具有光澤，平坦，邊緣整齊。未加AISPs、凍融5 d/次的安琪酵母大量死亡，冷凍使酵母細胞壁遭到破壞，美蘭染液進入細胞，呈現(xiàn)藍色；而加入AISP，大部分酵母在AISPs的保護下仍具有很高的存活率。

圖12 不同濃度AISPs對安琪酵母菌活菌數(shù)量的影響

逆境條件下，尤其是冷凍會使酵母的新陳代謝變慢，同時影響酵母細胞的RNA二級結構、蛋白質(zhì)翻譯率和折疊速率，降低細胞膜的流動性，導致錯誤折疊蛋白質(zhì)積累、酶失活、營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運速率和細胞繁殖速率的降低，甚至使細胞處于休眠狀態(tài)[16,17]。

由于植物ISPs具有很強的修飾冰晶形態(tài)與抑制重結晶的特性，它可以保護細胞免受由低溫造成的破壞，避免體液結為大的冰晶[18]。由圖12可知，在冷凍脅迫條件下，酵母菌落數(shù)隨著凍融周次的不斷增加呈不斷下降的趨勢。其中空白對照組在凍融第5周期時活菌數(shù)為3.57×105個，存活率為25.89%。而加入不同濃度的 AISP使酵母存活率得到明顯提高，其中1.0% AISPs添加量時酵母菌活菌數(shù)最高，菌落數(shù)達到6.73×105個，存活率為51.45%，與對照組相比，活菌數(shù)提高了88.5%，存活率提高了25.56%。說明AISP對反復凍融的耐低糖酵母細胞具有很好的抗凍保護作用。劉朋帥[19]將小胸鱉甲ISPs(MpAFP698)添加入大腸桿菌菌液中，發(fā)現(xiàn)ISPs濃度在0.005～0.08 mmol/L時，保護作用越明顯，與本研究的結論一致。

3 結論

通過單因素和響應面法優(yōu)化AISPs提取率試驗，得到最佳工藝參數(shù)為：分蘗洋蔥濾汁與PBS溶液的體積比為1∶5.32，PBS濃度為91.87 mmol/L，冰球添加量為33個/dL，此時AISPs提取率為65.23%。

全波長紫外掃描AISPs溶液，在280 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，說明其具有蛋白性質(zhì)并且純度較高。利用SDS-PAGE確定了AISPs有4個蛋白組分組成，其分子量分別為52，29，22，15 kDa。

將AISPs添加到耐低糖酵母菌懸液中，當AISPs添加量為1.0%、凍融5 d/次時，酵母菌的活菌數(shù)最高，菌落數(shù)為6.73×105個，存活率為51.45%，分別比對照組提高了88.5%和25.56%。