陳 磊 Philip Haselberger 田 芳 蔡小堃 毛穎異 劉 爽 趙艷榮 王 碩* 關 巖*

（1 雅培營養(yǎng)品上海研發(fā)中心 上海 200233

2 雅培營養(yǎng)品 美國哥倫布 OH43219

3 南開大學醫(yī)學院 天津 300350）

母乳寡聚糖（Human milk oligosaccharides，HMOs）是母乳中重要的營養(yǎng)物質與活性成分[1]。母乳寡聚糖不僅能抑制嬰兒腸道內有害菌的粘附能力，提高嬰兒免疫力[2]，還能促進腸道內益生菌的生長，改善胃腸道微生態(tài)[3-5]。母乳中的寡聚糖約有200多種，可定量分析的約有30多種[6-7]。HMOs按照單糖組成可分為3類：巖藻糖基化的中性HMOs，非巖藻糖基化的中性HMOs與唾液酸化的酸性HMOs。其中3-巖藻糖基乳糖（3-fucosyllactose，3-FL）與 2’-巖藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）、乳糖-N-新四糖（lacto-N-neotetraose，LNnT）與乳糖-N-四糖（lacto-N-tetraose，LNT）、6’-唾液酸乳糖（6’-sialyllactose，6’-SL）與 3’-唾液酸乳糖（3’-sialyllactose，3’-SL）分別在3類HMOs中含量較高[8]，具有一定的代表性。唾液酸（N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac）是構成酸性HMOs的重要單糖衍生物，并且對于促進嬰兒的大腦發(fā)育，提高嬰兒認知能力具有重要作用[9-10]。因此，對于母乳中這6種母乳寡聚糖及唾液酸的快速定量分析具有重要意義。

目前，對于母乳寡聚糖的檢測方法主要有高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）法[11-12]、液相色譜-質譜聯(lián)用（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）法[13-14]、核磁（Nuclear magnetic resonance，NMR）法[15]以及離子色譜（Ion chromatography，IC）法[8，16-17]。 采用HPLC法通常需對樣品衍生后測定，操作繁瑣且重復性較差。LC-MS法由于乳品復雜的基質導致回收率不理想，并且很難找到合適的內標消除誤差。NMR法的樣品需求量較大，并且靈敏度較差，不適用于母乳中寡聚糖的檢測。近年來，IC法由于不需要樣品的衍生在糖類檢測方面有廣泛應用，對于母乳寡聚糖的檢測也多有報道。然而就目前報道的方法，仍有兩個方面需要改善。首先，母乳寡聚糖種類繁多，采用IC法檢測時容易產生相互干擾。此外，按照Lewis血型劃分的分泌型與非分泌型媽媽產生的母乳中巖藻糖基化的HMOs組分含量差異明顯[8，18]，并且各HMOs組分會隨著泌乳期發(fā)生明顯變化[12]。IC法中HMOs的分離度、量限與檢測范圍仍需進一步優(yōu)化。母乳中唾液酸的檢測方法主要有HPLC法[19]與LC-MS法[20]。HPLC法是通過將唾液酸與衍生試劑反應產生具有熒光性質的化合物進行檢測。LC-MS法中樣品經離心過濾后可直接檢測。也有報道采用IC法[21]測定牛乳及乳制品中唾液酸的含量，然而還未應用于母乳中唾液酸的檢測。同時檢測母乳寡聚糖與游離唾液酸的方法國內外還未見報道。

本研究建立了采用離子色譜法，通過兩種洗脫條件分離與測定母乳中6種主要母乳寡聚糖與游離唾液酸的方法，并在母乳基質中進行方法學驗證。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

乳粉（34%蛋白，52%乳糖），市售產品；母乳樣品：成熟乳基質樣品、初乳樣品1、過渡乳樣品1、成熟乳樣品1、初乳樣品2、過渡乳樣品2、成熟乳樣品2，其中，3段乳樣品1為分泌型，3段乳樣品2為非分泌型，所有母乳樣均從天津市南開醫(yī)院收集獲得。

質量分數50%的氫氧化鈉溶液、乙酸鈉，美國Sigma-Aldrich 公司；3-FL、2’-FL、LNnT、LNT、6’-SL 與 3’-SL，英國 Carbosynth 公司；Neu5Ac，加拿大Toronto Research Chemicals公司；試驗用水為超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設備

Dionex ICS-5000離子色譜儀，美國Thermo Fisher公司，配有四元梯度泵、脈沖安培檢測器、Chromeleon 6.8色譜工作站；Milli-Q Advantage A10超純水儀，美國Millipore公司；Thermo REL5004V 冰箱、CarboPacTM PA1離子色譜柱（4 mm ×250 mm）、CarboPacTM PA1保護柱（4 mm ×50 mm），美國 Thermo Fisher公司；移液器（1 mL），德國 Eppendorf公司；尼龍濾膜（0.2 μm），英國Whatman公司。

1.3 標準溶液

按照表1中 3-FL，2’-FL，LNnT，LNT，Neu5Ac，6’-SL，3’-SL的質量濃度配制混合標準系列工作液。

表1 標準系列工作液中分析組分的質量濃度Table1 The mass concentration of each analyte in working standard solutions

1.4 離子色譜測定條件

CarboPacTMPA1離子色譜柱（4 mm×250 mm），CarboPacTMPA1保護柱（4 mm × 50 mm）；柱溫25℃；檢測器溫度25℃；流量1 mL/min；進樣量5 μL；淋洗液為水、500 mmol/L氫氧化鈉溶液、300 mmol/L乙酸鈉溶液；梯度洗脫程序1用于洗脫測試 3-FL，2’-FL，LNnT，LNT（表2），梯度洗脫程序 2 用于洗脫測試 6’-SL，3’-SL，Neu5Ac（表3）。

1.5 樣品處理

準確量取200 μL母乳樣品于塑料離心管中，加入超純水1 800 μL，混勻。然后放入4℃冰箱靜置 10 min 后，用 Whatman 尼龍濾膜（0.2 μm）過濾得濾液，按照離子色譜測定條件進樣分析6’-SL，3’-SL，Neu5Ac，濾液用超純水稀釋一倍后再次進樣分析 3-FL，2’-FL，LNnT，LNT。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS V22.0進行數據處理與分析。獨立樣本T檢驗來評估兩類樣本間數據差異的顯著性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 離子色譜法中梯度洗脫的選擇

選擇梯度洗脫條件時，比較了一次梯度洗脫測定與兩種梯度洗脫程序分兩次分析測定7種分析組分。一次梯度洗脫前期使用梯度洗脫程序1，至43 min時承接梯度洗脫程序2的條件。采用同一標準品溶液進樣比較發(fā)現，一次梯度洗脫時，6’-SL與3’-SL的分離度為1.78，并且3’-SL譜峰有一定的拖尾，對稱性較差（圖1），而分2次梯度洗脫的分離度可以提高至1.83，并且譜峰沒有產生拖尾現象，同時，Neu5Ac由于是重新采用較高洗脫能力的梯度洗脫，其保留時間較短，峰形較為尖銳，峰高是一次梯度洗脫的1.7倍（圖1），因此可以達到更低的檢出限和定量限。由于游離的Neu5Ac在母乳中含量很低[9]，尖銳的峰形更有利于Neu5Ac的檢出與定量。

表2 梯度洗脫程序1Table2 Program of gradient elution 1

表3 梯度洗脫程序2Table3 Program of gradient elution 2

圖1 不同洗脫程序的6’-SL、3’-SL、Neu5Ac離子流圖Fig.1 Ion current chromatograms of 6’-SL，3’-SL and Neu5Ac with different elution programs

2.2 標準曲線線性范圍

通過混合標準系列工作液做線性，各分析組分在設定的濃度范圍內呈良好的線性關系（表4），相關系數均大于0.999，線性范圍以mg/L母乳樣品計。

表4 分析組分線性范圍與標準曲線Table4 The linear range and standard curve of each analyte

2.3 檢出限與定量限

由于母乳基質中各分析組分含量較高，不適用于定量限加標。因此選用各分析組分含量較低的乳粉作為基質，并調整基質中宏量營養(yǎng)素的含量得到乳粉基質溶液以匹配母乳基質（母乳中乳糖含量約6%，蛋白含量約1%[22]）。

在乳粉基質溶液中加標給定質量濃度的分析組分評估定量限，同時計算該溶液的3 s/n得出檢出限。由表5可知，對于給定的加標量得到的回收率在92.6%～103.1%之間，相對標準偏差（Relative standard deviation，RSD）小于3.2%，該加標量可以作為方法的定量限，即 3-FL，2’-FL，LNnT，LNT，Neu5Ac，6’-SL，3’-SL的定量限分別為19.8，9.8，19.9，19.7，5.0，9.9，9.9 mg/L。從各分析組分得出 s/n 計算檢出限（3 s/n）為5.2，0.4，2.8，2.5，0.5，1.0，1.8 mg/L。

表5 方法檢出限與定量限的驗證結果（n=6）Table5 Validation results of LOD and LOQ（n=6）

2.4 精密度與回收率

取成熟乳基質樣品按照樣品處理步驟處理后進樣分析，測定6次后得出平均值，各組分RSD均小于3.7%。然后按照成熟乳基質樣品中各組分質量濃度的50%與100%進行加標試驗，評估方法的精密度與回收率。兩組加標試驗均做6次平行計算平均值，組分RSD均小于2.1%，回收率在91.8%～106.1%之間，說明該方法具有良好的精密度與回收率。

2.5 方法的應用

媽媽的Lewis血型決定了α-1-2-L-巖藻糖基轉移酶是否正常表達分泌，而根據該酶的表達分泌狀況可以將母乳分為分泌型與非分泌型，具體表現為分泌型母乳中含有大量的α-1-2-L-巖藻糖基化低聚糖，如2’-FL等，而非分泌型則較少[8，18]。另外研究顯示母乳中各HMOs隨著泌乳期會發(fā)生明顯變化[12]。因此本文選擇了分泌型與非分泌型的初乳、過渡乳、成熟乳共6個樣品，采用該方法分別測定樣品中 3-FL，2’-FL，LNnT，LNT，Neu5Ac，6’-SL，3’-SL的含量，每個樣品做 3 個平行，用以考察方法在不同類型、不同階段母乳中的適用性，測定結果如表7所示。

表6 方法精密度與回收率的驗證結果（n=6）Table6 Validation results of precision and recovery（n=6）

表7 不同類別母乳樣品中分析組分含量（n=3）Table7 The content of analytes in various human milk samples（n=3）

從表7中可以發(fā)現，分泌型3段乳中3-FL含量明顯小于非分泌型 3段乳（P<0.05），而 2’-FL含量明顯大于非分泌型3段乳（P<0.05）。所有樣品中的游離的Neu5Ac質量濃度均低于30.9 mg/L。 3-FL，2’-FL，LNnT，LNT，Neu5Ac，6’-SL 與 3’-SL在這6種母乳樣品中的最低濃度分別為42.3，24.7，74.4，493.8，10.0，98.2 mg/L 與 57.8 mg/L，均大于建立方法的定量限。對比已報道文獻中這7種分析組分在母乳中的含量（表7）發(fā)現，由于該方法的定量限較低，個別樣品中2’-FL與3-FL的含量低于文獻中范圍，其余的5種分析組分含量均在文獻報道的范圍內。并且所有已報道分析組分的檢測值均高于本方法的定量限，且在線性范圍內。因此該方法可滿足母乳研究中主要HMOs與游離唾液酸含量的準確測定。

在目前可查的報道檢測HMOs方法的文獻中，HPLC法、LC-MS法以及 IC法報道較多[8，11-14，16-17]，其中 LC-MS 法與 IC 法均未對定量限進行驗證，HPLC法中僅Sean等[11]建立的方法驗證了定量限，方法中指出了3-FL與2’-FL的定量限分別為43 mg/kg與53 mg/kg，并發(fā)現哺乳期8個月內的母乳中有21%的樣品中2’-FL無法定量測定，這部分樣品均屬于非分泌型母乳。由于非分泌型母乳中2’-FL含量較低，目前對于2’-FL的研究僅針對分泌型母乳。本文為進一步研究非分泌型母乳中2’-FL含量變化以及與其它HMOs的關系提供更為有效的方法。此外，2’-FL是劃分分泌型與非分泌型母乳的一個重要指標，具有低定量限的方法能夠覆蓋更多低2’-FL含量的母乳樣品的定量分析，為分泌型母乳與非分泌型母乳的具體劃分提供更為有效的方法。同時，該HPLC方法指出了哺乳期8個月內的母乳中有2%的樣品中3-FL含量低于定量限43 mg/kg，主要集中在分泌型母乳中。本研究建立的方法對更全面的研究母乳樣品的3-FL的含量分布及在不同泌乳期的變化趨勢提供可能。

另外，研究顯示，成熟乳中 LNnT，LNT，6’-SL與3’-SL的含量與分泌型母乳中2’-FL含量會隨著泌乳期迅速降低[23]。為研究泌乳后期母乳中LNnT，LNT，6’-SL，3’-SL 與 2’-FL 含量變化與相互關系，建立更為靈敏準確的定量方法也很有必要。與已報道的方法相比，本文建立的方法6’-SL，3’-SL 與 2’-FL 具有較低的定量限，同時樣品制備的過程中不經稀釋進樣可以進一步降低LNnT，LNT與2’-FL的定量限，在檢測研究泌乳后期母乳中 LNnT，LNT，6’-SL，3’-SL 與 2’-FL含量變化更有優(yōu)勢。

母乳中另一種活性成分唾液酸主要以糖鍵合、蛋白鍵合、脂質鍵合以及游離4種形式存在，游離的唾液酸占比較低，僅占總唾液酸的3%左右。試驗發(fā)現哺乳期3個月內的母乳中游離狀態(tài)的唾液酸含量為9.3～59 mg/L，并且其含量隨著泌乳期會進一步降低[10]。對于報道采用HPLC、LCMS以及IC測定唾液酸的方法[19-21]中，并未進行方法的定量限驗證。本文建立的方法對定量限進行了完整驗證，能夠準確定量母乳中含量較低的游離唾液酸，對于整個泌乳期母乳中游離唾液酸含量變化的研究提供一個有效的方法。

3 結論

采用離子色譜建立了測定母乳中3-FL，2’-FL，LNnT，LNT，6’-SL，3’-SL 6 種主要 HMOs 以及游離唾液酸的方法，該方法操作簡單，具有良好的分離度、精密度與準確性以及較低的檢出限與定量限，研究證明對于分泌型與非分泌型3段乳中的這7種組分均能夠準確定量。該方法可以應用于母乳研究中主要HMOs與游離唾液酸的常規(guī)檢測與分析。