孫雅馨 康旭蕾 唐 箏 陳 芳 胡小松

（中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院 國家果蔬加工工程技術研究中心農業(yè)部果蔬加工重點實驗室 食品非熱加工北京市重點實驗室 北京 100083）

胡蘿卜（Daucus carota L.）為傘形花科植物，富含β-胡蘿卜素，具有較高的營養(yǎng)價值和保健功能[1]。其較高的脆度和硬度適合于鮮切加工，是現(xiàn)代食品行業(yè)廣泛使用的食品原材料。硬度和多汁性是影響消費者對果蔬口感評價的兩大因素[2]。超高壓處理（High pressure processing，HPP）應用于食品加工，能夠較大程度保留食品的營養(yǎng)成分和感官品質[3-5]，實現(xiàn)微生物的殺滅[4，6]，延長食品貨架期。長期以來，大量關于高壓下果蔬質構品質變化的研究，主要圍繞不同溫壓組合[7]、溫壓對照[8-9]、預處理結合壓力[10-11]以及質構動力學[11]等方面展開。對于壓力所致質構損失的機理，研究認為與高壓下細胞膜損傷，膨壓損失[12-14]以及細胞壁果膠的降解與轉化[15-18]密切相關。

高壓處理過程涉及升壓和保壓兩個階段。有研究發(fā)現(xiàn)，在較高壓力下的升壓會導致質構損失[19-20]，而在較長的保壓階段，質構變化幅度遠小于升壓造成的損失[21-22]。針對不同壓力下的升壓階段果蔬質構變化的規(guī)律及其機制，目前尚未展開系統(tǒng)研究。此外，高壓作用往往不能充分鈍化，甚至會激活與質構相關的酶活[3]，在后期貯藏過程中極有可能引起質構進一步軟化。本文研究了升壓到不同壓力（100～600 MPa）時胡蘿卜硬度的變化規(guī)律，記錄高壓處理后（200，400，600 MPa，2 min）14 d低溫貯藏期內硬度波動情況，從細胞膜透性、細胞微觀結構變化和細胞壁果膠酶促降解與轉化方面探究質構變化機制，對于了解HPP對果蔬品質的影響具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

五寸參胡蘿卜（孟德爾808），山東青島；D-（+）半乳糖醛酸標準品、果膠（半乳糖醛酸（干基計）≥74.0%），阿拉丁試劑有限公司。

HPP-700-7L型超高壓設備，包頭科發(fā)高壓科技有限責任公司；842 Titrando自動電位滴定儀，瑞士Metrohm公司；V1800型可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司；TA-XT2i質地分析儀，英國SMS公司；FE30-Five Easy Plus電導儀，瑞士Mettler Toledo公司；Lecia EM UC6超薄切片機，德國Leica公司；H-7650B透射電子顯微鏡，日本Hitachi公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預處理 胡蘿卜洗凈，去皮，取中部切成厚約5 mm的薄片，混合后隨機取約40 g胡蘿卜片裝入PE袋（10 cm×15 cm），真空包裝。

1.2.2 超高壓處理 以水為傳壓介質，于室溫下分別升壓至 100，200，300，400，500，600 MPa（升壓速率120 MPa/min，降壓時間短于6 s），保壓0～2 min。以未經(jīng)高壓處理的胡蘿卜片為空白對照。

1.2.3 硬度測定[8]用直徑8 mm的打孔器在胡蘿卜片韌皮組織打孔，形成圓柱體小丁。采用TAXT2i質地分析儀，R/36探頭，對樣品進行2次咀嚼（TPA）測試，觸發(fā)力值5 kg。胡蘿卜的硬度用第1次壓縮形變30%的峰值力（N）表示。

1.2.4 相對電導率測定[23]取樣方法同硬度測定。取5 g胡蘿卜小丁于小燒杯，加入20 mL去離子水（電導率為5.2 μs/cm），于室溫下振蕩浸泡30 min，用電導儀測定電導率（R1）。沸水浴中加熱30 min，冷卻至室溫后再次測定電導率（R2）。相對電導率為R1與R2比值的百分比。

1.2.5 透射電鏡觀察[14]韌皮部取1 mm3的胡蘿卜小丁，依次固定于2.5%戊二醛、1%鋨酸固定液。按順序用 50%，60%，70%，80%，90%，100%的乙醇、100%的乙醇與丙酮1∶1、100%的丙酮脫水。依次用 1∶1，1∶2，1∶3的純丙酮與包埋液于室溫下各包埋12 h，再用純包埋液室溫包埋過夜。37℃烘箱過夜，60℃烘干24 h。采用超薄切片機切片70 nm，用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛進行雙染色后，于透射電鏡下觀察、拍照。

1.2.6 果膠甲酯酶（PME）活性測定[7]10 g胡蘿卜片于20 mL 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液打漿，4℃靜置12 h，過濾、離心，上清液即為PME粗酶液。以10 mg/mL果膠溶液為底物，在pH 8.0，35℃下采用自動電位滴定儀測定酶活。酶活以反應前期NaOH隨時間消耗的速率表示，酶活大小表示為空白對照的百分比。

1.2.7 多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性測定[7]用95%、80%的乙醇、50 mmol/L的乙酸鈉緩沖液提取PG粗酶液。酶活測定體系含0.3 mL粗酶液，0.3 mL 0.3%多聚半乳糖醛酸（0.04 mol/L醋酸鈉，pH 4.4），40℃反應2 h，加入0.1 mol/L硼酸緩沖液和1%氰乙酰胺，沸水加熱10 min，冷卻后測定276 nm吸光值。以滅活后的酶液作為對照。標準曲線用 0～100 mg/mL半乳糖醛酸繪制：y=0.0128x+0.007，R2=0.9965。 酶活單位 1 U＝1 mg 半乳糖醛酸/（h·gFW），酶活表示為空白對照的百分比。

1.2.8 醇不溶物制備與果膠組分分離[24]80%乙醇與胡蘿卜進行勻漿、煮沸，重復3次后，冷卻過濾，殘渣浸泡于90%二甲基亞砜4℃過夜，不溶物于氯仿與甲醇混和液（2∶1，體積比）浸泡，再用95%乙醇沖洗至均一、白色粉末狀固體，烘干恒重，即得細胞壁物質（AIR）。稱取0.1 g AIR于沸水中振蕩5 min，冷卻過濾、定容，即得水溶性果膠（WSP）；取水不溶性殘渣，以0.05 mol/L的乙二胺四乙酸（含0.1 mol/L KAc，pH 6.5）于 28℃抽提6 h，過濾定容，濾液即為螯合性果膠（CSP）；取不溶性殘渣，以0.05 mol/L Na2CO3（含0.02 mol/L NaBH4）于4℃ 抽提16 h，然后在 28℃下重復抽提6 h，過濾定容，濾液即為堿溶性果膠（NSP）。

1.2.9 果膠含量測定[25]果膠含量以其生成的半乳糖醛酸含量表示。果膠溶液中加入0.0125 mol/L濃硫酸-四硼酸鈉溶液，于沸水浴中降解后，與1.5 mg/mL間苯基苯酚溶液反應，測定520 nm處吸光值?？瞻诪? mg/mL NaOH溶液。標準曲線采用0～100 μg/mL D-半乳糖醛酸繪制：y=0.0112x-0.042，R2=0.9957。

1.2.10 果膠甲酯化度（DM）測定[20]20 mg AIR溶于去離子水，超聲振蕩10 min，加入2 mol/L NaOH于20℃反應1 h。加入2 mol/L HCl中和體系，于25℃反應15 min。過濾，濾液用磷酸緩沖液（pH 7.5）定容。取1 mL樣液與1 mL乙醇氧化酶（～1 U）于25℃反應15 min。加入乙酰丙酮于58℃反應15 min。冷卻后，于412 nm測定吸光值?？瞻子昧姿峋彌_液代替乙酰丙酮。

1.2.11 貯藏試驗 將高壓處理以及空白對照的胡蘿卜置于4℃貯藏14 d，每隔7 d測定以上數(shù)據(jù)，記錄貯藏期內各指標變化。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Origin 8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理與繪圖。用Turkey法進行差異顯著分析，P＞0.05表示差異不顯著，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 超高壓升壓階段胡蘿卜硬度變化及其機制

2.1.1 升壓階段胡蘿卜硬度的變化 保壓0 min能夠反映升壓過程中胡蘿卜硬度變化的情況。根據(jù)表1，升壓至200 MPa以上，胡蘿卜的硬度顯著下降（P＜0.05），說明升壓階段直接導致了胡蘿卜硬度的損失。100 MPa處理后，胡蘿卜硬度仍保持在90%以上，與空白對照無顯著差異（P＞0.05）。升壓至400 MPa硬度降至33.53%，繼續(xù)升壓，硬度無顯著變化（P＞0.05）。600 MPa保壓 0～2 min 硬度出現(xiàn)了回升，這與Basak等[22]觀察到的果蔬硬度在保壓過程中出現(xiàn)回升相符，他將該現(xiàn)象定義為“瞬時壓力軟化”。本研究中出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是胡蘿卜組織受到壓力應激后在持續(xù)的保壓過程中進行自我修復，組織剛性有所增加。

表1 不同保壓時間下胡蘿卜的硬度（n=10）Table1 Hardness of high pressure（100-600 MPa，0-2 min）processed carrot（n=10）

圖1 不同保壓時間下胡蘿卜的相對電導率Fig.1 Relative electrolytic leakage of high pressure(100-600 MPa，0-2 min)processed carrot

2.1.2 升壓階段胡蘿卜細胞膜透性的變化 相對電導率用以指示細胞膜通透性的改變，其值越大，細胞滲漏電解質的量越多，細胞膜破損程度越大。從圖1可知，除100 MPa外，升壓過程中相對電導率均顯著增加（P＜0.05），說明升壓階段直接導致了細胞膜的損傷。研究發(fā)現(xiàn)，超高壓處理會增加細胞膜透性[3]，一些溶質利用質外體途徑、共質體途徑或者跨膜運輸實現(xiàn)細胞間或細胞內向外的轉移[26]。100 MPa處理后，相對電導率低于6%，說明壓力在100 MPa以下不足以造成細胞膜的破損。升壓至400 MPa時，相對電導率已高達77.09%，隨壓力繼續(xù)升高，相對電導率無顯著變化（P＞0.05）。保壓過程中，除200 MPa處理組的相對電導率增加外，其余處理組的相對電導率均無顯著變化（P＞0.05）。此結果與硬度變化相符，說明壓力導致的細胞膜透性顯著增加是胡蘿卜硬度軟化的原因之一，而400 MPa有可能是壓力損傷界限值，高于此壓力，損傷將不再增加。張紅敏[27]在其研究中也得到了類似結果。

基于硬度和相對電導率的變化，本研究選取具代表性的高壓處理組（200，400，600 MPa，2 min）探究貯藏期內胡蘿卜的硬度變化及其機制。

2.2 高壓處理后貯藏期內胡蘿卜硬度變化及其機制

2.2.1 貯藏期胡蘿卜硬度的變化 圖2顯示了14 d貯藏期內胡蘿卜硬度的變化。200 MPa處理后，胡蘿卜的硬度在貯藏第7天出現(xiàn)顯著回升（P＜0.05），14 d 后又回到初始值。400，600 MPa處理組的硬度在貯藏期內無顯著變化（P＞0.05），說明高壓在一定程度上能夠減少貯藏期內胡蘿卜的質構軟化，而未處理組的胡蘿卜在貯藏14 d后硬度下降了17.9%。

2.2.2 貯藏期胡蘿卜細胞膜透性的變化 由圖3可知，除200 MPa外，胡蘿卜在貯藏過程中相對電導率變化不明顯，說明細胞膜透性并未發(fā)生顯著變化。200 MPa處理組在貯藏7 d后相對電導率顯著下降（P＜0.05），此時硬度有所增加（圖2），可能與貯藏前期細胞內抗氧化酶（過氧化物酶、過氧化氫酶）參與的氧化損傷修復有關[23]。

圖2 超高壓處理后貯藏期內胡蘿卜的硬度Fig.2 Hardness change of high pressure（200/400/600 MPa，2 min）processed carrot during storage

2.2.3 貯藏期胡蘿卜細胞形態(tài)與結構的變化 圖4顯示了高壓處理后胡蘿卜的細胞顯微結構。未處理的胡蘿卜細胞排列整齊，細胞壁光滑，胞間連接緊密，可觀察到完整的細胞膜與液泡膜（圖4a）。加壓處理后，細胞形變嚴重，細胞壁出現(xiàn)大幅褶皺、彎曲（圖4d、4g、4j）。 高壓下細胞形態(tài)變化與膨壓損失、細胞壁的機械性能受損有關[28]。200 MPa處理后細胞膜仍具有一定完整性（圖4f），400 MPa以上壓力處理后細胞膜出現(xiàn)破損（圖4i、4l）。600 MPa處理后細胞潰散嚴重，胞間層溶解（圖4j、4k）。此結果與其它研究結果一致，100～200 MPa會破壞細胞膜的完整性，引起細胞壁輕微的損傷，而300～400 MPa下細胞膜完全破裂，細胞壁增厚[13，20，29-30]。 Jung 等[31]觀察到胡蘿卜經(jīng) 400 MPa處理后韌皮部薄壁組織出現(xiàn)了穿孔和破裂；Préstamo等[32]則發(fā)現(xiàn)高壓處理會使花椰菜細胞破裂，膨壓損失，細胞內容物流出；菠菜葉的薄壁組織消失，出現(xiàn)空泡。圖4中細胞壁周圍的黑色片段可能是細胞膜發(fā)生氧化損傷生成的丙二醛，與蛋白質、肽類或脂類聚合、交聯(lián)形成的脂褐質[33]。

圖3 超高壓處理后貯藏期內胡蘿卜的相對電導率Fig.3 Relative electrolytic leakage of high pressure（200/400/600 MPa，2 min)processed carrot during storage

4℃貯藏使未經(jīng)處理的胡蘿卜胞間空隙增大，細胞壁出現(xiàn)一定程度的彎曲、褶皺，細胞膜與細胞壁有分離趨勢（圖4a-4c，圖5a-5c）。高壓處理后，隨施加壓力增大，細胞壁緊密結構的破壞以及胞間粘連作用的減弱在貯藏期間程度增加。200 MPa處理后第7天細胞膜與細胞壁出現(xiàn)分離（圖4f），14 d后則不能觀察到完整的細胞膜結構（圖5f）。400 MPa和600 MPa處理組在貯藏期內胞間隙明顯增加（圖4h，圖5k），貯藏 7 d 后，600 MPa處理組的胞間隙被溶質填滿（圖4k），同時胞間分離越來越顯著，細胞壁發(fā)生降解，表現(xiàn)為細胞壁增厚，邊緣不規(guī)則，胞間層容散直至消失（圖4k，4l，圖5k，5l）。洋蔥經(jīng)高壓處理后在貯藏過程中同樣出現(xiàn)細胞分離，細胞壁降解現(xiàn)象[33]，黃桃罐頭在貯藏中隨貯藏溫度升高，細胞分離程度增大[35]。

圖4 超高壓處理后貯藏7 d胡蘿卜的細胞顯微結構Fig.4 Microstructure of high pressure(200/400/600 MPa，2 min)processed carrot after 7 days’ storage

2.2.4 貯藏期胡蘿卜果膠的酶促降解 果膠的降解與果蔬加工、貯藏過程中質構的軟化密切相關[36]，PME、PG催化果膠去甲酯化和解聚[37-39]。由圖6a可得，未處理組的胡蘿卜DM為61.6%，600 MPa以上壓力處理會使DM顯著降低（P＜0.05），且在貯藏過程中400 MPa和600 MPa處理組的DM均有所下降，一方面與壓力激活的PME酶活相關（圖6b），另一方面壓力引起的細胞結構破壞有利于位于不同區(qū)室的底物與酶充分接觸，加速酶促降解[3，35]。200 MPa處理組在貯藏過程中DM出現(xiàn)下降波動，結合硬度在第7天出現(xiàn)回升的現(xiàn)象，分析其原因可能是去甲酯化的果膠與二價陽離子形成交聯(lián)，從而有利于質構保持[23，39]。

根據(jù)圖6b、6c，200～600 MPa的壓力均未引起PME、PG的鈍化，相反在貯藏期內其活性還得到了顯著激活（P<0.05）。PME的耐壓性以及熱敏性在諸多文獻中均有報道[16，40-41]，鈍化其酶活通常需要600 MPa以上壓力[42]。因此，600 MPa下DM的降低與壓力下激活的PME有關。而壓力處理后胡蘿卜在貯藏過程中并未見顯著的質構軟化，有可能是引起質構軟化的果膠酶促降解過程與質構保持相關的果膠交聯(lián)過程達到了動態(tài)平衡。

圖5 超高壓處理后貯藏14 d胡蘿卜的細胞顯微結構Fig.5 Microstructure of high pressure（200/400/600 MPa，2 min）processed carrot after 14 days’ storage

圖6 超高壓處理后貯藏期內胡蘿卜果膠的酶促降解Fig.6 Enzymatic degradation of pectin in high pressure（200/400/600 MPa，2 min）processed carrot during storage

2.2.5 貯藏期胡蘿卜果膠含量與組成的變化 高壓處理后不同果膠組分含量在貯藏期內的變化如圖7所示。由圖7a可知，高壓處理會導致總果膠含量降低。在貯藏期內未處理的胡蘿卜果膠損失較為嚴重，14 d后降至64.4%。除600 MPa外，14 d后200 MPa、400 MPa處理組的總果膠含量均高于空白處理，說明高壓處理在一定程度上限制了果膠在貯藏期內的降解。由圖7b可知，高壓處理會引起WSP損失，壓力越大，損失越嚴重，且在貯藏期內損失持續(xù)進行。這與DM值的降低相符，去甲酯化會引起果膠水溶性的降低[40]。根據(jù)圖7c可知，胡蘿卜經(jīng)高壓處理后CSP含量有所增加，結合DM的降低，其原因可能是果膠去甲酯化后與陽離子形成了交聯(lián)。除400 MPa外所有處理組的CSP含量在貯藏7 d后都出現(xiàn)了下降，14 d后又出現(xiàn)回升。NSP在貯藏期的變化如圖7d所示，600 MPa處理后NSP含量顯著增加（P<0.05），并在貯藏期內保持較高水平，有可能是高壓作用下果膠形成了特殊的可以與碳酸鹽結合的酯鍵[23]。貯藏期內400 MPa處理組的NSP含量呈上升趨勢。

圖7 超高壓處理后貯藏期內胡蘿卜果膠含量的變化Fig.7 Content of total pectin and fractions of high pressure(200/400/600 MPa，2 min)processed carrot during storage

胡蘿卜經(jīng)高壓處理后貯藏期內不同果膠組分比例變化如圖8所示。未處理的胡蘿卜果膠組成為WSP（39.4%），CSP（28.0%），NSP（32.6%）。 400 MPa以上壓力會使WSP比例顯著下降（圖8a），NSP比例顯著增加（P<0.05）；貯藏期內，所有壓力處理組均表現(xiàn)為WSP比例下降，NSP比例增加（圖8b-8c）。根據(jù)勒夏特列原理，壓力幾乎不會引起共價鍵的斷裂[43]，因此NSP得以保留。研究發(fā)現(xiàn)，高溫高壓（600 MPa/80℃）處理胡蘿卜后，WSP僅剩 14%，CSP、NSP 分別增至 44%，40%[23]。 Sila等[44]則發(fā)現(xiàn)胡蘿卜WSP含量與質構成負相關關系（r<-0.97），NSP含量與質構成正相關關系（r<0.98）。菜豆在貯藏過程中硬度增加也與NSP含量增加有關[45]。本研究中NSP的增加有可能是貯藏期內胡蘿卜硬度未進一步軟化的原因。

圖8 超高壓處理后貯藏期內胡蘿卜果膠組成的變化Fig.8 Proportion change of pectin fractions of high pressure（200/400/600 MPa，2 min）processed carrot during storage

3 結論

超高壓能夠引起胡蘿卜硬度損失，但能在一定程度上減少貯藏過程中的軟化。壓力所致的硬度損失主要發(fā)生在升壓階段。100 MPa對細胞無實質性損傷；200 MPa時，膜的完整性受到破壞；400 MPa有可能是壓力損傷臨界值，升壓階段導致了約70%的硬度損失；600 MPa則導致膜完全破裂，細胞壁發(fā)生降解，并在貯藏過程中加速細胞分離。超高壓引起的細胞膜機械損傷是胡蘿卜硬度損失的主要原因，與此同時，超高壓激活的果膠甲酯酶和聚半乳糖醛酸酶催化果膠去甲酯化和解聚，然而由于壓力作用有助于果膠形成新的連接，最終在貯藏期內并未引起顯著的質構軟化。本文為高壓下鮮切果蔬質構的變化規(guī)律及其機理提供了有利證據(jù)，然而針對高壓下細胞膜、細胞壁的損傷對質構影響程度的大小還有待進一步的定量分析。