李建國 薛曉夢 張照華 王志慧 晏立英 陳玉寧 萬麗云 康彥平 淮東欣 姜慧芳 雷 永 廖伯壽

單?；ㄉ饕舅岷拷t外預測模型的建立及其應(yīng)用

李建國 薛曉夢 張照華 王志慧 晏立英 陳玉寧 萬麗云 康彥平 淮東欣*姜慧芳 雷 永*廖伯壽

中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所/ 農(nóng)業(yè)部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室, 湖北武漢 430062

脂肪酸組成是影響花生營養(yǎng)價值和貨架壽命的主要因素, 高油酸花生以其營養(yǎng)保健價值高、化學穩(wěn)定性好、耐儲藏等特點, 深受廣大消費者和花生加工企業(yè)的喜愛。因此, 培育高油酸品種是花生育種的重要目標, 建立快速、高效、準確檢測花生中主要脂肪酸含量的無損方法是加快花生脂肪酸改良和高油酸品種選育進程的重要技術(shù)保障。本研究利用近紅外光譜技術(shù)建立了可以非破壞性地快速檢測單粒花生中油酸、亞油酸、棕櫚酸含量的數(shù)學模型, 其中油酸模型的決定系數(shù)(2)為0.907, 均方差為3.463; 亞油酸模型的決定系數(shù)為0.918, 均方差為2.824; 棕櫚酸模型的決定系數(shù)為0.824, 均方差為0.782。使用100?；ㄉ炞C該模型的準確性, 結(jié)果油酸、亞油酸和棕櫚酸的近紅外預測值與化學值的相關(guān)系數(shù)分別為0.88、0.90和0.71, 表明此模型可以準確地預測單粒花生中這3種脂肪酸的含量。本研究借助該模型建立了一種不依賴分子標記的快速、高效選育高油酸花生的方法, 并成功應(yīng)用于高油酸花生育種, 選育出高油酸花生品種中花215。

單?；ㄉ? 脂肪酸; 近紅外模型; 高油酸; 育種方法

花生(L)是我國重要的油料與經(jīng)濟作物[1]。在國內(nèi)大宗油料作物中, 花生總產(chǎn)、單位面積產(chǎn)油量、種植業(yè)產(chǎn)值均居首位, 在花生總產(chǎn)僅一半用于榨油的情況下, 花生油年產(chǎn)量約270萬噸, 占國產(chǎn)植物油產(chǎn)量的四分之一, 是國產(chǎn)植物油的第二大來源, 僅次于菜籽油[2]。脂肪酸組成是影響花生及其加工產(chǎn)品的營養(yǎng)保健價值、加工特性與效率、耐儲性以及市場競爭力的關(guān)鍵品質(zhì)性狀?；ㄉN子的脂肪酸以油酸(C18:1)、亞油酸(C18:2)、棕櫚酸(C16:0)為主,三者之和占脂肪酸總量的90%以上, 這3種脂肪酸的含量是花生品質(zhì)的重要影響因素[3]。油酸是單不飽和脂肪酸, 它能選擇性地降低人體血液中有害的低密度膽固醇, 而保持有益的高密度膽固醇, 有效預防心血管疾病的發(fā)生。亞油酸是多不飽和脂肪酸, 具有2個雙鍵, 在加工和儲存過程中易被氧化變質(zhì), 含量過多不利于儲存和加工[4]。棕櫚酸是飽和脂肪酸, 攝入過多棕櫚酸會引起人體血清中總膽固醇的升高, 增加心血管疾病的發(fā)病率, 不利于人體健康[5-6]。因此, 培育油酸含量高、亞油酸和棕櫚酸含量低的優(yōu)質(zhì)品種是花生育種的重要目標, 而建立花生中這3種脂肪酸含量的快速、高效、準確的檢測技術(shù)是加快育種進程的重要技術(shù)保障。

目前, 利用氣相色譜法(gas chromatography, GC)檢測花生中的脂肪酸組成是最準確的方法, 但是該方法對花生種子具有破壞性[7-8], 且費時費力、操作繁瑣, 還需要專業(yè)人員和昂貴設(shè)備, 檢測成本高。Chamberlin等[9]開發(fā)利用毛細管電泳檢測花生油亞比, 該方法測定結(jié)果與GC測定值的決定系數(shù)(2)高達0.96, 但是該方法從制備到分析出實驗結(jié)果仍需5~6 h。近年來, 鑒于近紅外光譜檢測技術(shù)具有成本低、無損、快速等優(yōu)點, 花生中也建立了相應(yīng)的近紅外檢測脂肪酸的方法。禹山林等[10]利用近紅外光譜技術(shù)建立檢測花生中油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸含量的方法。之后, 花生中又相繼開發(fā)了一系列用于分析花生中主要脂肪酸含量的近紅外模型[11-13]。但是, 目前建立的這些方法都需要10~100 g (20~ 150粒)花生種子作為樣品, 難以應(yīng)用于早期雜交分離世代(F2~F4)基因型高度復雜群體中少量純合單粒的篩選, 不能有效縮減育種規(guī)模, 因此, 建立更加高效的檢測單?；ㄉ兄饕舅岬募夹g(shù)非常必要[14-15]。Tillman等[16]建立了檢測單粒花生中油酸和亞油酸含量的近紅外模型。Kavera等[17]也建立了單粒花生脂肪酸含量的近紅外模型, 但建模樣品油酸含量均低于70%, 因此該模型用于花生高油酸育種中的選擇效果不佳。國內(nèi)尚未開發(fā)出可用于檢測單?；ㄉN子中脂肪酸含量的近紅外模型。

分子標記輔助選擇是當前高油酸花生育種主要采用的選擇鑒定方法。FAD2 (D12脂肪酸脫氫酶)是脂肪酸生物合成途徑中催化油酸在第12碳位引入雙鍵生成亞油酸的關(guān)鍵酶[18-19], 花生中已針對基因的突變位點開發(fā)了AS-PCR、CAPS、KASP等分子標記[20-21], 但是使用這些分子標記費時費力、操作繁瑣, 還需要專業(yè)人員和昂貴設(shè)備, 檢測成本高。本團隊通過研究發(fā)現(xiàn)單?；ㄉN子中突變的基因個數(shù)與其油酸含量存在累加效應(yīng): 當4個基因都發(fā)生突變(基因型為aabb)時, 其油酸含量平均為80% (變異范圍79.0%~82.5%), 均在75%以上; 當3個基因發(fā)生突變(基因型為Aabb或aaBb)時, 其油酸含量在64.5%~74.4%之間; 當突變的基因數(shù)目少于3個(基因型為AaBb、AAbb、aaBB、AABb、AaBB或AABB)時, 其油酸含量不超過70% (45.3%~70.0%)[22]。根據(jù)此規(guī)律, 利用近紅外光譜檢測單?；ㄉN子中油酸的含量, 根據(jù)油酸含量就可以快速選擇出基因型為aabb的高油酸花生種子。如果將單?；ㄉ兄舅岷康慕t外檢測模型應(yīng)用于高油酸花生育種, 可實現(xiàn)在雜交的早期世代對單?；ㄉ杏退岷慷ㄏ蚩焖龠x擇, 大大降低育種的人工和時間成本, 提高選擇效率。

本研究針對上述問題, 選用1202粒有代表性的花生種子, 分別建立單?；ㄉ杏退?、亞油酸和棕櫚酸含量的近紅外分析模型, 利用上述模型開發(fā)了一種不依賴分子標記的快速、高效選育高油酸花生的方法, 并成功選育出高油酸花生新品種。

1 材料與方法

1.1 材料

第一部分是建立油酸、亞油酸和棕櫚酸預測數(shù)學模型的標準樣品集, 共來源于520份材料的1202粒飽滿花生種子, 其中包含中國花生微微核心種質(zhì)99份(297粒)、ICRISAT花生微核心種質(zhì)184份(368粒)、栽培品種及地方品種237份(537粒); 第二部分是近紅外模型的外部驗證樣品集, 包含100粒飽滿的花生種子; 第三部分是雜交親本及其后代分離材料, 以普通油酸含量花生品種冀花4號(油酸含量51.9%)為母本, 高油酸花生品種開農(nóng)58(油酸含量為80.5%)為父本。以上所有材料均由中國農(nóng)業(yè)科學院油料研究所花生研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 標準樣品集近紅外光譜的測定 近紅外光譜儀預熱后, 將干燥除雜后的花生種子置近紅外光譜掃描操作臺。近紅外光譜掃描譜區(qū)范圍為4000~12,500 cm-1, 取每個樣品1粒種子, 重復掃描3次, 并且第2次和第3次掃描時要將花生換個角度重新放置在掃描孔上, 以得到同一樣品的多個近紅外光譜[23]。

1.2.2 標準樣品集化學值的測定 參照GB/T17377-2008, 由中國農(nóng)業(yè)科學院油料所花生研究室測定標準樣品集化學值。

1.2.3 NIRS模型的建立 對單?；ㄉ杏退?、亞油酸和棕櫚酸的化學值和近紅外光譜預測值分別進行擬合光譜處理, 采用偏最小二乘法(PLS)的化學計量學方法建立數(shù)學模型, 反復采用內(nèi)部交叉驗證剔除奇異值, 通過比較模型的決定系數(shù)(2)和標準差(RMSECV)衡量模型質(zhì)量, 篩選最佳模型, 并通過比較樣品預測值與化學值的決定系數(shù)(2)和均方差(RMSECV)來衡量模型的質(zhì)量[24-25]。

1.2.4 模型的外部驗證 選取100粒飽滿的花生種子, 利用本方法檢測其油酸、亞油酸和棕櫚酸的含量, 記錄近紅外光譜(NIR)的預測值, 再利用氣相色譜法(GC)分析每粒種子的脂肪酸組成, 比較每粒種子NIR預測值與GC化學值的相關(guān)性和準確性。

1.2.5 品種選育過程 2013年春季, 以普通油酸含量花生品種冀花4號為母本, 高油酸花生品種開農(nóng)58為父本配置雜交組合, 并收獲F1。2013年冬季, 將F1種植于三亞, 并收獲F2。2014年春季, 使用近紅外檢測單粒F2種子中油酸含量, 選擇油酸含量在70%以上的種子, 種植于武漢, 并收獲F3。2014年冬季, 使用近紅外檢測單粒F3種子中油酸含量, 選擇油酸含量在75%以上的種子, 種植于三亞, 并收獲F4。2014年春季, 將收獲的F4按株系種植于武漢, 調(diào)查其農(nóng)藝性狀, 并收獲F5。利用氣相色譜法分析各株系的脂肪酸組成, 淘汰油酸含量低于75%的株系。2014年冬季, 三亞擴繁篩選出的株系。2015— 2016年間持續(xù)進行株系選擇和擴繁, 篩選出優(yōu)異株系, 編號15-2015。通過參加2017—2018年的多點試驗(品系代號中花215), 收集相關(guān)數(shù)據(jù), 預計于2019年登記高油酸花生品種中花215。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生籽粒的近紅外反射光譜分析

共使用1202粒飽滿的花生種子用于構(gòu)建近紅外分析模型?；ㄉ鷺藴蕵悠芳慕t光譜曲線趨勢大致相同(圖2), 但不同樣品的吸收峰強度不同, 即脂肪酸含量不同。結(jié)果表明, 花生籽粒的近紅外光譜圖可以用于花生籽粒脂肪酸組成的定量分析。

2.2 花生籽粒的化學值測定

1202粒用于脂肪酸含量建模的花生種子經(jīng)過氣相色譜分析, 其油酸含量變異范圍為32.8%~ 80.8%; 亞油酸含量變異范圍為0.7%~43.9%; 棕櫚酸含量變異范圍為5.9%~16.6% (表1)。本研究選取的花生種子脂肪酸含量變幅較寬, 滿足建立近紅外模型的要求。

圖1 本試驗中使用的近紅外檢測儀Unity-SpectrastarXL

圖2 樣品集的光譜分析

表1 建立數(shù)學模型使用的單?；ㄉN子的油酸、亞油酸和棕櫚酸含量

2.3 模型構(gòu)建

對單?；ㄉ杏退?、亞油酸和棕櫚酸的化學值和采集的近紅外光譜數(shù)據(jù)分別進行擬合光譜處理, 采用偏最小二乘法(PLS)的化學計量學方法建立數(shù)學模型, 反復采用內(nèi)部交叉驗證剔除奇異值, 通過比較模型的決定系數(shù)(2)和標準差(RMSECV)衡量模型質(zhì)量, 篩選最佳模型。油酸模型的決定系數(shù)為0.907, 均方差為3.463 (圖3-A); 亞油酸模型的決定系數(shù)為0.918, 均方差為2.824 (圖3-B); 棕櫚酸模型的決定系數(shù)為0.824, 均方差為0.782 (圖3-C)。油酸和亞油酸模型的決定系數(shù)均大于0.9, 可以進行有效預測, 由于花生中棕櫚酸含量相對油酸、亞油酸較低, 其決定系數(shù)低于油酸、亞油酸, 但大于0.8, 均方差為0.782, 也可以進行有效預測。

2.4 模型的外部驗證

另取100粒飽滿的花生種子作為外部驗證樣品, 檢驗模型的預測效果(附表1)。油酸的NIR預測值與GC化學值的相關(guān)系數(shù)達到0.88 (圖4-A), 亞油酸的NIR預測值與GC化學值的相關(guān)系數(shù)達到0.90 (圖4-B), 棕櫚酸的NIR預測值與GC化學值的相關(guān)系數(shù)為0.71 (圖4-C), 表明利用本方法得到的NIR預測值準確。

2.5 模型在高油酸花生育種中的應(yīng)用

2.5.1 F1種子的獲取 以冀花4號(油酸含量51.9%)為母本, 開農(nóng)58 (油酸含量為80.5%)為父本, 進行雜交, 收獲12粒F1種子。

2.5.2 F2~F3種子油酸含量測定與篩選 將F1代自交, 分單株收獲, 共得174粒F2種子。利用近紅外儀配合本研究建立的脂肪酸檢測模型, 檢測單粒F2花生種子中油酸的含量(附表2), 共篩選到38粒油酸含量在70%以上的花生種子; 將F2代按照油酸含量由高到低種植, 自交, 分單株收獲, 共得563粒F3種子; 利用近紅外光譜檢測單粒F3花生種子中油酸的含量(附表3), 共篩選到196粒油酸含量在75%以上的花生種子; 將F3代按照油酸含量由高到低種植, 自交, 根據(jù)其農(nóng)藝性狀嚴格選擇, 收獲農(nóng)藝性狀優(yōu)異的10個F4單株。

2.5.3 F4優(yōu)異單株、株系選擇與油酸測定及基因型確證 利用近紅外光譜檢測同一株收獲的10粒F4種子中油酸含量, 發(fā)現(xiàn)其油酸含量全部高于75%。再將上述10粒種子混合取樣并利用氣相色譜分析發(fā)現(xiàn), 其油酸含量均在80%及以上(表2)。將來源于同一單株F4種子種植于1~3行內(nèi), 按行收集該行內(nèi)每一單株的一片新葉, 提取混合樣的DNA, 利用KASP標記檢測AhFAD2的基因型, 發(fā)現(xiàn)這10個F4株系基因型全部為aabb (表3)。

圖3 本方法中油酸模型、亞油酸模型和棕櫚酸模型的決定系數(shù)

圖4 檢驗使用的單?；ㄉN子的油酸(A)、亞油酸(B)、棕櫚酸(C)近紅外預測值與化學值相關(guān)性

C18:1: 油酸; C18:2: 亞油酸; C16:0-棕櫚酸。

C18:1: oleic acid; C18:2: linoleic acid; C16:0: palmitic acid.

2.5.4 優(yōu)良品系多點試驗 根據(jù)農(nóng)藝性狀精選, 通過擴大繁殖、參加株系和產(chǎn)量比較試驗, 最終選育出高油酸花生品種中花215。中花215屬普通型高油酸花生品種, 全生育期123 d, 株高37.4 cm, 平均單產(chǎn)莢果370.98 kg 667 m–2, 籽仁252.93 kg 667 m–2, 百果重194.8 g 667 m–2, 百仁重84.16 g 667 m–2, 出仁率67.45%, 油酸含量80.2%, 亞油酸含量1.6%, 含油量53.3%, 準備于2019年登記。

3 討論

3.1 本研究建立的單粒花生脂肪酸近紅外模型適用性廣

本研究成功建立了利用近紅外技術(shù)檢測單?；ㄉN子中油酸、亞油酸和棕櫚酸含量的模型。雖然之前國際上已建立了一些利用近紅外檢測單?；ㄉ舅岷康哪Ｐ? 但是Tillman等[16]建立的模型僅使用了132?；ㄉN子, 涉及89個花生品種和品系, Kavera等[17]則使用的是1000份突變體材料遺傳背景單一。本研究在建立模型時使用了1200多?；ㄉN子, 而且來源于遺傳背景非常豐富的花生種質(zhì)資源, 其中包括中國微微核心種質(zhì)、ICRISAT微核心種質(zhì)以及地方品種和育成品種, 選擇的材料遺傳背景豐富且復雜, 涉及到的材料也十分廣泛, 非常具有代表性。因此, 本研究建立的模型適用性更廣。

表2 單粒近紅外光譜檢測花生F4種子中的油酸含量(%)及其混樣氣相色譜檢測結(jié)果

a: 品系名稱; b: 單粒近紅外檢測結(jié)果; c: 混樣氣相檢測結(jié)果。

a: the name of the strain; b: oleic acid content of single seed detected by NIR; c: GC for mixed seeds.

表3 各F4株系A(chǔ)hFAD2的基因型

3.2 單粒花生脂肪酸近紅外模型在高油酸花生育種中應(yīng)用的關(guān)鍵點

將單?；ㄉ舅峤t外模型應(yīng)用于高油酸花生育種的關(guān)鍵在于如何在雜種的早期世代確定保留種子的油酸含量標準, 如果選擇的條件過于嚴苛(油酸含量標準定的過高), 例如只選油酸含量75%以上的種子, 可能造成保留的F2代種子太少, 難以在其后代中篩選到農(nóng)藝性狀優(yōu)良的單株; 如果選擇的條件過于寬松, 例如選擇油酸含量高于65%的種子, 可能造成引入攜帶AaBb、AAbb或aaBB這些基因型的種子, 當這些種子再自交一代后, AaBb基因型材料自交后代分離復雜, AAbb或aaBB基因型的材料不可能再分離產(chǎn)生高油酸花生, 都為后續(xù)的田間種植和選擇工作增加了負擔。本研究所建立的育種方法選擇在F2代時保留油酸含量在70%以上的花生種子, 是依據(jù)“當突變的基因數(shù)目少于3個(基因型為AaBb、AAbb、aaBB、AABb、AaBB或AABB)時, 其油酸含量不超過70%”[26-27]。這一規(guī)律確定的, 并不是單純的折中選擇, 選用70%油酸含量為標準, 確保所選種子的基因型為aabb、Aabb和aaBb之一, 其后代分離簡單, 易于選擇, 并且為后續(xù)的農(nóng)藝性狀篩選保留了足夠多的F2種子。而在F3代時選擇保留油酸含量在75%以上的花生種子, 此時提高選擇條件可以確保所選擇的花生種子基因型都為aabb, 不再混入其他基因型的種子, 在后續(xù)選擇中可以不再針對油酸性狀, 有效減少工作量。

3.3 單?；ㄉ舅峤t外模型應(yīng)用于高油酸花生育種的優(yōu)勢

本研究建立了利用近紅外檢測單粒花生主要脂肪酸含量的模型, 使用該模型配合高油酸性狀的遺傳特性, 可高效地用于高油酸花生品種培育, 該方法不依賴分子標記和基因型鑒定, 依然可以實現(xiàn)在雜交早期后代對油酸含量進行快速、高效選擇。該方法快速、高效、簡便、成本低廉、易操作, 可以顯著加快高油酸花生品種的育種進程。

4 結(jié)論

使用遺傳背景廣泛的1202?；ㄉN子, 建立了基于近紅外光譜技術(shù)檢測單?；ㄉ杏退帷営退岷妥貦八岷康哪Ｐ?。同時, 利用該模型開發(fā)了育種方法, 該方法基于單?；ㄉN子中基因突變個數(shù)與其油酸含量的規(guī)律, 不依賴分子標記, 可以在雜交的早期世代對油酸含量進行選擇, 有效加快育種進程, 并成功選育出高油酸花生品種中花215。

附表 請見網(wǎng)絡(luò)版: 1) 本刊網(wǎng)站http://zwxb.china-crops.org/; 2) 中國知網(wǎng)http://www.cnki.net/; 3) 萬方數(shù)據(jù)http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuowxb. aspx。

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Establishment and applicant of near-infrared reflectance spectroscopy models for predicting main fatty acid contents of single seed in peanut

LI Jian-Guo, XUE Xiao-Meng, ZHANG Zhao-Hua, WANG Zhi-Hui, YAN Li-Ying, CHEN Yu-Ning, WAN Li-Yun, KANG Yan-Ping, HUAI Dong-Xin*, JIANG Hui-Fang, LEI Yong*, and LIAO Bo-Shou

Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062, Hubei, China

Profile of fatty acid is the main factor determining the nutritional value and shelf life of peanut. High oleate peanut has been increasingly favored by customers and peanut processing enterprises, as it provides a prolonged shelf-life and a beneficial effect on human health. Therefore, creating high oleate peanut cultivar is an important objective for peanut breeding. Developing a nondestructive method which could detect the fatty acid composition in peanut rapidly, efficiently and accurately is an important technical support for accelerating the processing. In this study, models for predicting the contents of main fatty acids (oleic acid, linoleic acid and palmitic acid) in a single peanut seed were built up using near-infrared reflectance spectroscopy (NIRS). The coefficient of multiple determination (2) and the root mean squared error of external calibration (RMSECV) of prediction models were 0.907 and 3.463 for oleic acid, 0.918 and 2.824 for linoleic acid, 0.824 and 0.782 for palmitic acid, respectively. One hundred peanut seeds were analyzed by both NIR and gas chromatography (GC) to validate the accuracy of the prediction models. The correlation coefficients of oleic acid, linoleic acid and palmitic acid between NIR values and GC values were 0.88, 0.90, and 0.71, respectively, suggesting that these models could accurately predict the contents of the three main fatty acids in a single peanut seed. Furthermore, based on these prediction models, a breeding method of high oleate peanut without assistance of molecular marker was developed, and a high oleate peanut cultivar Zhonghua 215 was successfully bred.

single peanut seed; fatty acid; near infrared model; high oleic acid; breeding method

本研究由瑪氏-中國高油酸花生育種計劃項目(MARS-China HOAP 2013-2018), 國家自然科學基金項目(31671734, 31461143022, 31770250, 31371662), 中央級科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項(Y2018PT52)和國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-13)資助。

This study was supported by the Mars-China High Oleic Acid Peanut Breeding Project (MARS-China HOAP 2013-2018), the National Natural Science Foundation of China (31671734, 31461143022, 31770250, 31371662), the Fundamental Research Funds for Central Non-profit Scientific Institution (Y2018PT52), and the China Agriculture Research System (CARS-13).

淮東欣, E-mail: dxhuai@caas.cn; 雷永, E-mail: leiyong@caas.cn

E-mail: 15611821765@163.com

2019-05-15;

2019-06-20;

2019-07-16.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190715.1610.006.html

10.3724/SP.J.1006.2019.94016