趙 晶 李旭彤 梁學(xué)忠 王志城 崔 靜 陳 斌 吳立強 王省芬 張桂寅 馬峙英 張 艷

陸地棉漆酶基因家族鑒定及在黃萎病菌脅迫下的表達分析*

趙 晶**李旭彤**梁學(xué)忠 王志城 崔 靜 陳 斌 吳立強 王省芬 張桂寅 馬峙英 張 艷*

河北農(nóng)業(yè)大學(xué) / 華北作物種質(zhì)資源研究與利用重點實驗室 / 河北省棉花產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心, 河北保定 071001

黃萎病是降低棉花產(chǎn)量和品質(zhì)較為嚴(yán)重的維管束病害。棉花在抵抗病原菌的過程中, 抗病基因起著尤為重要的作用。漆酶是一種多功能氧化酶, 在植物木質(zhì)素合成和提高植株抗逆性等方面發(fā)揮著重要作用。高質(zhì)量版本的基因組是提升基因家族分析準(zhǔn)確性的必要條件。本研究以目前最新的陸地棉TM-1高質(zhì)量版本基因組為參考, 通過生物信息學(xué)分析鑒定了陸地棉基因組中的()基因家族, 并對其進行了理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、染色體定位以及在黃萎病脅迫下的表達模式分析。結(jié)果表明, 陸地棉TM-1基因組中共包含83個家族成員, 分布在24條染色體上, 所有GhirLAC蛋白均定位在胞外, 且具有相同/相似的保守基序。系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示,基因家族成員可分為7個亞組。結(jié)合黃萎病脅迫下棉花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 將基因家族各成員的表達分為3種模式, 其中第1類和第2類基因在黃萎病菌脅迫下分別呈現(xiàn)有規(guī)律的表達量升高和降低, 推測這些基因在棉花抗黃萎病反應(yīng)中發(fā)揮重要功能。熒光定量PCR結(jié)果表明,()、()和() 3個候選基因均受黃萎病菌誘導(dǎo)表達, 其表達趨勢與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相吻合。本研究為以后深入解析棉花基因的抗病功能及分子機制奠定基礎(chǔ)。

陸地棉; 漆酶; 基因家族; 黃萎病; 基因表達

棉花(spp)是世界上第一大天然纖維作物, 具有重要的經(jīng)濟價值, 也是食品、飼料和生物燃料的重要來源[1]。在生長過程中, 棉花的品質(zhì)和產(chǎn)量會受到多種生物和非生物脅迫, 其中危害最大的是由大麗輪枝菌(Kleb.)引起的黃萎病[2]。黃萎病菌寄主范圍極其廣泛, 其產(chǎn)生的菌核對極端溫度變化適應(yīng)能力強, 可在土壤中存活數(shù)十年, 因此防治難度很大, 每年造成巨大經(jīng)濟損失[3-4]。研究表明利用品種的遺傳抗性可以有效降低黃萎病帶來的危害, 實現(xiàn)棉花的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)[5]。

細(xì)胞壁是植物抵御病原體侵襲的天然屏障, 當(dāng)病原菌侵染時, 寄主植物細(xì)胞在細(xì)胞壁、胞間層、細(xì)胞質(zhì)等不同部位產(chǎn)生一系列抗性反應(yīng), 可以有效地阻止病原菌的再度侵染和蔓延[6-8]。已有研究表明, 在細(xì)胞壁的木質(zhì)化過程中, 從薄壁組織細(xì)胞內(nèi)合成的木質(zhì)醇單體分泌至胞外經(jīng)脫氫聚合反應(yīng)形成木質(zhì)素[9]。植物細(xì)胞壁的木質(zhì)化能夠抵抗病原菌侵入的機械壓力、抵抗真菌酶類對細(xì)胞壁的降解和阻斷病原菌與寄主植物間的物質(zhì)交流[10]。木質(zhì)素是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的成分之一, 而漆酶又是木質(zhì)素合成途經(jīng)中的關(guān)鍵酶之一, 因此漆酶在植物細(xì)胞壁形成和抗病過程中的作用值得深入研究。

漆酶屬于銅藍蛋白家族, 是一種結(jié)合多個銅離子的糖蛋白, 廣泛存在于細(xì)菌、真菌和動植物中。目前高等植物中已有部分漆酶基因成員的研究報道, 如短柄草對其細(xì)胞壁木質(zhì)化具有重要作用[11]; 亞洲棉漆酶基因?qū)胄陆畻詈竽軌驅(qū)е罗D(zhuǎn)基因植株中總木質(zhì)素含量的增加, 表明參與了植物木質(zhì)素的合成[12]; 趙先炎等[13]研究表明, 增強番茄中漆酶基因的活性, 可以提高植株對酚類物質(zhì)的抗性; 田奇琳等[14]克隆了龍眼基因, 并發(fā)現(xiàn)其可能參與茉莉酸、水楊酸和脫落酸的逆境脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑, 調(diào)控龍眼多種非生物脅迫應(yīng)答過程; 黃晨等[15]發(fā)現(xiàn)龍井茶樹在茉莉酸處理、機械損傷和茶尺蠖取食后, 漆酶基因和的表達量有明顯的變化。此外, 在水稻[16]、甜高粱[17]和亞麻[18]中, 漆酶基因家族成員也被相繼鑒定出來, 由此可見, 不同植物漆酶基因在生物和非生物脅迫中具有重要功能。

已有關(guān)于漆酶基因家族的研究多集中在二倍體植物[16-18], 棉花屬于異源四倍體, 基因組龐大而復(fù)雜, 目前漆酶基因在栽培棉花中的研究報道相對較少, 課題組前期基于SSH文庫篩選到, 研究發(fā)現(xiàn)其通過防御誘導(dǎo)的木質(zhì)素的合成增強黃萎病抗性[19]; Hu等[20]超表達棉花基因同時提高了植株對黃萎病菌及棉鈴蟲的抗性。Balasubramanian等[21-22]以2015年公布的陸地棉TM-1基因組為參考, 通過全基因組鑒定家族成員并明確了不同成員在陸地棉纖維發(fā)育中的表達模式。隨著測序技術(shù)的不斷提升和基因組質(zhì)量的進一步完善, Wang等[23]通過三代基因組獲得的最新的陸地棉TM-1基因組較之前版本基因組質(zhì)量有很大提升, 為全基因組基因家族分析提供更為可靠的參考序列; 另外棉花中漆酶基因家族除目前已報道的兩個成員外[19-20], 其他成員是否參與抗黃萎病反應(yīng)尚不清楚。因此, 本研究參考最新的陸地棉TM-1基因組, 利用生物信息學(xué)方法, 提取并鑒定得基因家族成員, 并對各成員的理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進化和染色體定位等方面進行系統(tǒng)分析, 結(jié)合黃萎病脅迫處理后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 明確基因家族成員的表達規(guī)律, 為深入解析棉花基因的抗病功能及分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 基于陸地棉TM-1三代基因組的漆酶基因家族的鑒定及理化性質(zhì)分析

本研究利用最新公布的陸地棉TM-1基因組序列為參考, 相關(guān)基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)從COTTONGEN (http://www.cottongen.org/)數(shù)據(jù)庫中下載[24]。借助基因結(jié)構(gòu)域的隱馬可夫模型(PF00394、PF07731和PF07732), 搜索棉花蛋白質(zhì)組中的LAC蛋白序列。去除冗余后, 將所有的候選基因在Pfam (http:// pfam.xfam.org/)數(shù)據(jù)庫中進行結(jié)構(gòu)域驗證, 對搜索出來的棉花基因家族成員進一步確認(rèn)。利用ExPASy軟件(http://cn.expasy.org/tools)計算棉花LAC蛋白序列的長度; 采用EuLoc在線軟件(http://euloc.mbc.nctu.edu.tw/)對棉花LAC蛋白進行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.2 陸地棉漆酶基因家族的系統(tǒng)進化分析

利用MEGA 7軟件中的Clustal W功能對83個陸地棉LAC蛋白序列和17個擬南芥LAC蛋白序列進行序列比對, 然后基于序列比對的結(jié)果, 采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹, 其中Bootstrap值設(shè)定為1000。

1.3 陸地棉漆酶基因家族的染色體定位、基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

從陸地棉基因組注釋文件中提取基因家族成員的染色體位置信息, 利用MapChart軟件2.32繪制基因的染色體定位圖, GSDS在線軟件(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制基因結(jié)構(gòu)圖, MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)分析LAC蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。

1.4 陸地棉漆酶基因家族在黃萎病脅迫下的表達模式分析

本課題組前期以抗病陸地棉品種農(nóng)大601為試驗材料, 獲得在處理組(黃萎病菌脅迫處理后) 2、6、12、24和48 h和對照組(各對應(yīng)時間點接種水)的根部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。將陸地棉基因家族各成員的表達量數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2(1+RPKM)處理后, 利用MEV軟件, 繪制基因家族各成員的表達熱圖。

1.5 陸地棉漆酶基因家族在黃萎病脅迫下的表達模式分析

根據(jù)陸地棉家族基因的cDNA信息, 采用Primer 5.0軟件在基因序列5′端、ORF或3′端的特異區(qū)域設(shè)計引物(表1), 擴增片段約為200 bp。分別以陸地棉農(nóng)大601根、莖、葉不同組織和接菌后6、12、24、36和48 h的根組織cDNA為模板, 利用qRT-PCR方法檢測候選基因的表達情況, 設(shè)置每個樣本3次重復(fù), 內(nèi)參基因為[25]。qRT-PCR體系為10.0 μL, 其中cDNA 1 μL、2×SYBR預(yù)混液5.0 μL、基因特異正向引物(10 μmol L–1) 0.5 μL、反向引物(10 μmol L–1) 0.5 μL、RNase-Free H2O 2.8 μL、ROX校正液0.2 μL。qRT-PCR在ABI7500儀器反應(yīng), 反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性30 s; 95℃變性5 s, 57℃退火5 s, 72℃延伸34 s, 40個循環(huán)。采用2–ΔΔCt方法計算基因的相對表達量[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉LAC基因家族成員的鑒定

通過Hmmsearch搜索和數(shù)據(jù)庫驗證, 在陸地棉基因組中共鑒定出83個LAC基因家族成員, 根據(jù)其在染色體上的位置信息, 命名為(表1), 其中和沒有定位到染色體上。除A亞組的第7染色體和D亞組的第7染色外, 其他染色體都不均勻地分布著LAC基因(圖1)。所有LAC基因所編碼蛋白的氨基酸數(shù)量在420~583個之間, 差異較小, 且所有基因的亞細(xì)胞定位結(jié)果都在胞外, 屬于分泌蛋白。

表1 陸地棉LAC基因家族信息

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

圖1 陸地棉LAC基因家族成員的染色體定位分析

2.2 陸地棉漆酶家族基因系統(tǒng)發(fā)育分析

用83個陸地棉GhirLACs蛋白序列和17個擬南芥AtLACs蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 并根據(jù)擬南芥漆酶基因的功能[27], 將棉花漆酶分為7組(圖2)。第1組包括23個陸地棉漆酶成員和2個擬南芥漆酶成員(和), 第2組包括22個陸地棉漆酶成員和4個擬南芥漆酶成員(、、和), 擬南芥、和在調(diào)控木質(zhì)素單體和細(xì)胞壁木質(zhì)化方面具有重要作用, 屬于參與木質(zhì)素生物合成的單木質(zhì)素漆酶, 基于該進化樹結(jié)果, 初步認(rèn)為棉花第1組與第2組漆酶成員具有類似的功能[27-29]。第3組包括13個陸地棉漆酶成員和4個擬南芥漆酶基因(、、和), 其中、和對ABA信號有響應(yīng)[29];第4組包括12個陸地棉漆酶成員和2個擬南芥漆酶基因(和), 可能與干旱、低溫和鹽脅迫有關(guān)[29]; 第5組包括9個陸地棉漆酶成員和3個擬南芥漆酶成員(、和); 第6組只有1個擬南芥漆酶成員第7組包括4個陸地棉漆酶成員和1個擬南芥漆酶成員(), 其在生物脅迫下表達會下調(diào)[30]。

圖2 陸地棉和擬南芥LACs基因家族進化樹分析

2.3 陸地棉漆酶基因家族的結(jié)構(gòu)和保守域分析

對陸地棉LAC基因家族83個成員的基因結(jié)構(gòu)和保守域分析結(jié)果如圖3所示, 所有LAC基因的外顯子個數(shù)在4~7個之間變化, 且基本都含有相同的保守結(jié)構(gòu)域(Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif4、Motif5、Motif 9和Motif 10; 圖4)。經(jīng)Pfam數(shù)據(jù)庫驗證, Motif 1和Motif 9完全對應(yīng)于Cu_oxidase_3結(jié)構(gòu)域; Motif 3與Cu_oxidase結(jié)構(gòu)域相對應(yīng); Motif2和Motif4則構(gòu)成了Cu_oxidase_2結(jié)構(gòu)域。某些保守基序只存在于某一亞組中, 如Motif 8只存在于第7亞組中, motif是蛋白質(zhì)分子中具有特定空間構(gòu)象和特定功能的結(jié)構(gòu)成分, 是結(jié)構(gòu)域的亞單位, 與特定的功能聯(lián)系在一起, 推測具有不同motif的漆酶成員在進化和功能上可能存在差異。

2.4 陸地棉漆酶基因家族在黃萎病脅迫下的表達分析

基于本課題組前期已有的抗病農(nóng)大601黃萎病菌脅迫下的根轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[31], 將不同處理時間點下的RPKM值進行l(wèi)og2(1+RPKM) 處理后, 構(gòu)建LAC基因家族成員的表達熱圖。結(jié)果顯示, 在83個陸地棉LAC基因中, 有80個基因的表達量在黃萎病脅迫下都發(fā)生了顯著的變化。80個差異基因在根中的表達模式分為3種類型, 第1類基因呈現(xiàn)出病原菌誘導(dǎo)后表達上調(diào), 包括、等24個成員。根據(jù)該類基因?qū)S萎病菌的響應(yīng)速度和程度, 進一步劃分為3個亞組, 即快速上調(diào)表達基因(I), 包括和, 這些成員在接菌后2 h基因表達達到高峰; 較快上調(diào)表達基因(II),包括77、等9個成員, 該亞組基因在接菌后6 h達到表達高峰; 以及第III亞組, 包括01等10個成員, 受黃萎病菌誘導(dǎo)后這些基因在12~24 h之間達到表達高峰。第2類基因受病原菌脅迫后呈現(xiàn)不同程度下調(diào)表達, 包括、、、等56個成員, 接菌后這些基因的表達明顯受到抑制, 暗示這些基因在棉花抗黃萎病反應(yīng)中起負(fù)調(diào)控作用; 第3類基因不響應(yīng)黃萎病菌處理, 推測其不參與棉花抗黃萎病過程, 包括、和(圖5)。

圖3 陸地棉LAC家族成員基因結(jié)構(gòu)分析

圖4 陸地棉LAC基因家族保守基序

2.5 陸地棉漆酶基因家族在黃萎病脅迫下的表達分析

結(jié)合抗病轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、全長cDNA文庫篩選以及功能尚未報道的前提, 本研究進一步挑選出3個分別與擬南芥、和直系同源的新基因, 分別命名為()、()和()。熒光定量PCR結(jié)果表明,在接黃萎病后6 h表達量顯著提高;受黃萎病菌誘導(dǎo)明顯, 接菌后6 h快速響應(yīng), 24 h達到表達高峰;的表達在接菌后各時間點均顯著上調(diào)。這3個基因的熒光定量結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的趨勢相吻合, 該結(jié)果在進一步明確三個基因的表達規(guī)律的同時也反映了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性(圖6)。組織特異性表達結(jié)果顯示3個基因在棉花根、莖、葉中均有表達;在莖中表達量最高,和在根中表達量最高(圖6)。

3 討論

基因組質(zhì)量的完整性是全基因組水平分析基因家族的基礎(chǔ)。隨著基因組測序技術(shù)的不斷深入, 棉花基因組從二倍體棉到四倍體陸地棉不斷更新[22,32-33]?；诙蚪M測序組裝獲得的四倍體陸地棉TM-1的基因組草圖為開展全基因組水平分析提供了可能, 但由于棉花屬于異源多倍體, 基因組龐大而復(fù)雜, 高質(zhì)量版本的基因組成為提升基因家族分析準(zhǔn)確性的必要條件。最新的研究釋放了基于超高深度測序、10×Genomics、BioNano光學(xué)圖譜及Hi-C數(shù)據(jù)等多技術(shù)聯(lián)合組裝的陸地棉TM-1基因組[23], 較以前發(fā)表的基因組草圖在連續(xù)性和完整性上提高了10~20倍, 并對具有高度重復(fù)的區(qū)域(如著絲粒)進行了成功組裝。此外, 新版本基因組預(yù)測出72,761。個高度可信的蛋白編碼基因, 較舊版本預(yù)測的70,478個蛋白編碼基因多出了2283個新基因。因此, 利用更新的陸地棉參考基因組分析復(fù)雜的基因家族, 將為深入研究該基因家族的功能提供更為準(zhǔn)確的信息

圖5 陸地棉LAC基因在黃萎病脅迫下的表達熱圖

圖6 黃萎病菌脅迫下GhLAC4、GhLAC11和GhLAC12基因的表達

本研究通過生物信息學(xué)方法從高質(zhì)量的陸地棉TM-1全基因組中鑒定出83個漆酶基因成員, 經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn), 所有基因的外顯子個數(shù)在4~7之間, 所編碼蛋白的氨基酸數(shù)量在500個左右, 且基本含有相同的保守基序, 表明基因家族不同成員之間具有較強的保守性。已有研究報道擬南芥、和屬于參與木質(zhì)素生物合成的單木質(zhì)素漆酶, 在木質(zhì)素合成方面具有重要功能, 基于本研究棉花漆酶與擬南芥直系同源基因進化樹分析, 初步推測分別與擬南芥、和基因聚為一組的棉花漆酶成員可能具有類似的功能[27-29]。本研究結(jié)果與2016年報道的一篇關(guān)于棉花漆酶基因家族的分析結(jié)果存在較大差異。本研究基于高質(zhì)量的TM-1基因組鑒定到83個LAC成員, 除At07和Dt07染色體外, 其他染色體都不均勻地分布著LAC基因, 其中At05和Dt05上LAC基因分布最多, 分別為8個; Balasubramanian等[21]基于舊版本的TM-1基因組草圖鑒定到84個LAC成員, 其結(jié)果顯示在3條染色體At07、Dt07、At08中均沒有LAC的分布, LAC成員分布最多的染色體位于At05, 分布著11個LAC基因。這些信息的不匹配性為我們深入研究LAC基因家族帶來很大困擾甚至是誤導(dǎo), 因此本研究以目前最高質(zhì)量的基因組版本系統(tǒng)分析LAC基因家族, 為深入研究LAC重要成員的功能奠定基礎(chǔ)。

細(xì)胞壁是抵御病原菌入侵的天然屏障, 木質(zhì)素是細(xì)胞壁的重要組成部分, 在植物抗病防御反應(yīng)中發(fā)揮重要功能。漆酶位于木質(zhì)素合成途徑的最后一步, 負(fù)責(zé)將G、S、H不同木質(zhì)素單體交聯(lián)聚合形成多聚物-木質(zhì)素。自然條件下, 細(xì)胞壁作為植物固有的基本組成部分保證植株生長發(fā)育, 在此過程中漆酶參與的木質(zhì)素合成被定義為specific-lignification, 如擬南芥、和[27-29]; Chezem等[34]研究表明擬南芥可以激活防御誘導(dǎo)的木質(zhì)素的合成, 參與該過程的木質(zhì)素合成基因受丁香加單包桿菌的誘導(dǎo)表達, 課題組前期的研究也發(fā)現(xiàn)()對黃萎病菌迅速響應(yīng), 其表達趨勢與本研究在轉(zhuǎn)錄組中的表達趨勢類似, 超表達基因通過增加植株防御誘導(dǎo)的木質(zhì)素的合成而提高抗病性[19]。Hu等[20]研究了棉花基因, 發(fā)現(xiàn)超表達的植株木質(zhì)素增加, 從而提高了對黃萎病和棉鈴蟲的抗性; 抑制基因植株苯丙烷代謝流發(fā)生改變, 木質(zhì)素合成降低而黃酮代謝增強, 同時還激活了植物激素茉莉酸的合成, 從而富集了更多對病蟲有害的次生代謝物質(zhì)。自然條件下, 植物生長面臨生物和非生物脅迫等復(fù)雜的外界環(huán)境, 植物通過能量與物質(zhì)的重新分配來調(diào)控生長與防御的平衡[35]。由此推測, 病菌脅迫條件下, 植物暫?；驎壕徤L發(fā)育進度, 能量物質(zhì)向防御反應(yīng)方向傾斜。從本研究的家族的表達結(jié)果來看, 其中屬于第二類的各成員受病菌脅迫后, 基因的表達量或快速、或大幅度下調(diào), 推測這些基因在調(diào)控生長與防御的平衡方面發(fā)揮重要作用。此外, 從第一類基因的表達來看, 該類基因的大部分成員在自然生長狀態(tài)下處于低或較低表達水平, 受病菌誘導(dǎo)后這些基因在某個時間點達到表達峰值, 隨后表達水平逐漸回落, 表明這些基因?qū)儆诜烙T導(dǎo)的一類抗病漆酶基因, 對病原菌迅速響應(yīng), 推測植株一旦防御體系建立, 為了協(xié)調(diào)防御和植株生長發(fā)育, 該類基因的表達隨后降低。綜上, 本研究基于表達, 認(rèn)為80個響應(yīng)黃萎病菌的成員在棉花抗黃萎病反應(yīng)中具有功能, 但第一類基因可能側(cè)重于增加木質(zhì)素的合成提高抗病性; 第二類基因可能側(cè)重于改變苯丙烷代謝流來提高抗病性; 二者也可能存在部分交叉。該研究結(jié)果為進一步研究的功能提供一定指導(dǎo)。

4 結(jié)論

本研究鑒定了陸地棉基因組中的Laccase基因家族, 83個家族成員分布在24條染色體上, 所有GhirLAC蛋白均定位在胞外, GhirLAC家族成員可分為7個亞組。黃萎病菌脅迫下,家族各成員的表達分為3種模式, 其中第1類和第2類基因在棉花抗黃萎病反應(yīng)中發(fā)揮重要功能。()、()和() 3個候選基因均受黃萎病菌誘導(dǎo)表達。本研究為以后深入解析棉花基因的抗病功能及分子機制奠定基礎(chǔ)。

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Genome-wide identification of Laccase gene family in updateL. genome and expression analysis understress

ZHAO Jing**, LI Xu-Tong**, LIANG Xue-Zhong, WANG Zhi-Cheng, CUI Jing, CHEN Bin, WU Li-Qiang, WANG Xing-Fen, ZHANG Gui-Yin, MA Zhi-Ying, and ZHANG Yan*

Hebei Agricultural University / North China Key Laboratory for Crop Germplasm Resources of Education Ministry / Co-Innovation Center for Cotton Industry of Hebei Province, Baoding 071001, Hebei, China

stress causes a disease in vascular bundle that decreases cotton yield and fiber quality. During cotton defense against pathogen infection, disease resistance genes play important roles. Laccase is a multifunctional oxidase that plays an important role in lignin synthesis and plant resistance. High-quality cotton reference genome is necessary to improve the accuracy of gene family analysis. In this study, the laccase () family genes in the update genome ofL. cv. TM-1 were identified by bioinformatics, and its physical and chemical properties, gene structure, chromosome location and expression pattern understress were analyzed. There were 83 members offamily in the genome ofL., which distributed on 24 chromosomes. All GhirLAC proteins predicted were located in extracellular and had the same conserved motif. Phylogenetic analysis showed that the members of thegenes family were divided into seven subgroups. According to the analysis results of cotton transcription understress, it was clear that the expression pattern ofgenes could be divided into three groups, of which, group 1 and group 2genes displayed down-regulation and up-regulation expression patterns, respectively, suggesting that these genes should play important roles in cottonresistance. Furthermore, we identified three candidate genes expression patterns induced by, including(),(), and(), the qPCR results were consistent with the expression trend based on transcriptome data. This study lays a foundation for further analysis of disease resistance function and molecular mechanism ofgene in cotton.

L.; laccase; gene family; Verticillium wilt; gene expression

本研究由河北省優(yōu)秀青年科學(xué)基金項目(C2017204011), 河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究重點項目(ZD2014019)和河北省青年拔尖人才支持計劃資助。

This study was supported by the Natural Science Foundation of Hebei Province (C2017204011), Key Scientific and Technological Research Projects of University in Hebei Province (ZD2014019), and Talents Support Program of Hebei Province.

張艷, E-mail: zhangyan7235@126.com

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

趙晶, E-mail: 824802835@qq.com

2019-04-02;

2019-06-22;

2019-07-13.

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190711.1619.006.html

10.3724/SP.J.1006.2019.94053