余忠寧　張卓旻　李攻科

摘?要?神經(jīng)遞質(zhì)（Neurotransmitters， NTs）是一類在生物體內(nèi)起著重要調(diào)節(jié)作用的內(nèi)源性化合物，生物樣品中NTs含量的準確測定對疾病早期診斷、藥物開發(fā)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域的研究均具有重要意義。但是，生物樣品基體組成復(fù)雜，NTs含量極低，因此研發(fā)高效樣品前處理技術(shù)是實現(xiàn)復(fù)雜生物樣品中痕量NTs快速準確分析的關(guān)鍵。微萃取技術(shù)是使用微量富集介質(zhì)為核心的綠色萃取技術(shù)，具有成本低、使用方便、適于生物微（無）損分析、環(huán)境友好等優(yōu)點，是生物樣品內(nèi)源性物質(zhì)分析的優(yōu)秀前處理技術(shù)。本文系統(tǒng)評述了固相微萃?。⊿olid?phase microextraction， SPME）、微固相萃取（Micro?solid?phase extraction， μ?SPE）和液相微萃取（Liquid?phase microextraction， LPME）等微萃取技術(shù)在生物樣品中痕量NTs的高效富集及分析檢測中的應(yīng)用研究進展，并對該領(lǐng)域的研究進行了總結(jié)與展望。

關(guān)鍵詞?微萃取技術(shù); 神經(jīng)遞質(zhì); 生物樣品; 評述

1?引 言

神經(jīng)遞質(zhì)（Neurotransmitters， NTs）是一類在突觸傳遞中擔當“信使”的內(nèi)源性化學(xué)物質(zhì)，目前已在生物體中鑒定出200余種NTs化學(xué)信使分子[1]。根據(jù)化學(xué)組成的不同，神經(jīng)遞質(zhì)大致可分為單胺類（Monoamine neurotransmitters， MNTs）、氨基酸類（Amino acid neurotransmitters， AANTs）、肽類和其它類NTs。MNTs是神經(jīng)元釋放的主要化學(xué)信使，可分為兒茶酚胺（Catecholamines， CAs）和吲哚胺兩大類。兒茶酚胺主要包括去甲腎上腺素（Norepinephrine， NE）、腎上腺素（Epinephrine， E）和多巴胺（Dopamine， DA）。吲哚胺主要包括血清素5?羥色胺（5?Hydroxytryptamine， 5?HT）、異丙腎上腺素和酪胺等。AANTs是具有神經(jīng)遞質(zhì)功能的氨基酸，由色氨酸（Tryptophan， Trp）、酪氨酸（Tyrosine， Tyr）、谷氨酸、天冬氨酸、γ?氨基丁酸、甘氨酸和?；撬岬冉M成。肽類神經(jīng)遞質(zhì)是神經(jīng)元所分泌的肽類化學(xué)物質(zhì)[2，3]。NTs在調(diào)節(jié)人體的神經(jīng)、免疫和心血管系統(tǒng)功能方面起著重要作用，人體中NTs及其代謝物的含量變化已成為多種疾病診療過程中重要的診斷指標。如已證明帕金森病和精神分裂癥與DA神經(jīng)傳遞缺乏有關(guān)[4]，Trp代謝失衡與肺癌和乳腺癌的發(fā)展密切相關(guān)[5]，人尿液中CAs含量的增加與抑郁癥的發(fā)生有潛在關(guān)系[6]。因此，生物樣品尤其是人體中痕量NTs的準確測定，對疾病早期診斷、藥物開發(fā)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域有重要的科學(xué)指導(dǎo)意義。

早期的NTs含量測定方法主要為放射酶和免疫學(xué)方法，由于不具備分離功能，其選擇性和靈敏度較低，影響了分析結(jié)果的準確度。20世紀80年代以來，隨著色譜技術(shù)的飛速發(fā)展，液相色譜技術(shù)（High performance liquid chromatography， HPLC）和毛細管電泳（Capillary electrophoresis， CE）等技術(shù)逐漸取代放射酶和免疫學(xué)方法，成為NTs分析測定的主流方法[7]。色譜技術(shù)具有強大的分離分析功能，且所需樣品量少，非常適合復(fù)雜生物樣品中痕量NTs的準確測定。同時，色譜技術(shù)可與多種檢測器聯(lián)用，如熒光（Fluorescence detection， FLD）[8，9]、電化學(xué)（Electrochemical detection， ECD）[10]、紫外檢測（Ultraviolet detection， UV）[11]、化學(xué)發(fā)光[12]、生物傳感器[13]、酶聯(lián)免疫吸附[14]和質(zhì)譜（Mass spectrometry， MS）[15～17]等，大大擴展了生物樣品中種類多樣的NTs檢測范圍。尤其是色譜?質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC?MS）兼具定性與定量分析功能，選擇性好，靈敏度高，目前已成為復(fù)雜生物樣品中痕量NTs分析的常用方法。

雖然，色譜及色譜?質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，較好地解決了NTs的檢測問題，但是生物樣品基體組成復(fù)雜，存在大量蛋白質(zhì)、脂類、磷酸鹽等基體成分，易在NTs的分析過程中產(chǎn)生嚴重干擾。同時，NTs含量低，化學(xué)穩(wěn)定性不佳，容易發(fā)生自發(fā)異構(gòu)現(xiàn)象。此外，生物樣品常難以獲取，數(shù)量受限制[18]。因此，研發(fā)適合的高效樣品前處理技術(shù)是有效提高復(fù)雜生物樣品中痕量NTs分析靈敏度及準確度的關(guān)鍵。目前，文獻報道了尿液、腦脊液、血漿、唾液、血清和血小板等生物樣品NTs分析的前處理技術(shù)，主要包括液?液萃取法（Liquid?liquid extraction， LLE）、固相萃取法（Solid?phase extraction， SPE）、微透析技術(shù)（Microdialysis， MD）和微萃取技術(shù)。LLE是NTs分析的早期樣品前處理方法，操作繁瑣耗時，使用大量有機溶劑，萃取選擇性不佳[19]。SPE是目前NTs分析研究中應(yīng)用最廣的前處理方法，利用固體吸附介質(zhì)對目標物的吸附，分離和富集目標物，適用于多種生物樣品中NTs的分離富集[20]。與傳統(tǒng)LLE相比，SPE具有操作簡便、溶劑用量少、回收率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，但常需經(jīng)過溶劑轉(zhuǎn)換、長時間洗脫及氮吹濃縮等繁瑣操作步驟，分析檢測效率較低。微透析技術(shù)是目前常見的原位活體采樣方法，兼“采樣”和“前處理”于一體，所采樣品可直接用于分析，最早用于大腦內(nèi)部NTs釋放與代謝的研究[21]。但是，MD探針成本高，采樣量極少， 回收率校準困難，很難重復(fù)使用，這些都限制了MD技術(shù)的實際應(yīng)用。電子版文后支持信息表S1列舉了近年來生物樣品中NTs分析常見的前處理及檢測方法[22～42]。

微萃取技術(shù)是使用微量富集介質(zhì)為核心的無溶劑或少溶劑萃取技術(shù)，與傳統(tǒng)的提取方法相比，具有成本低、使用方便、環(huán)境友好等優(yōu)點，是新興的高效分離富集技術(shù)。按照形式的不同，微萃取技術(shù)主要分為固相微萃?。⊿PME）、微固相萃?。é?SPE）和液相微萃取（LPME）。微萃取涂層或萃取相體積微小、富集效率高，非常適合小體積生化樣品中痕量目標物的分離富集，容易實現(xiàn)活體生物樣品的原位、微損傷分析，因此，微萃取技術(shù)已被認為是生物樣品內(nèi)源性物質(zhì)（如NTs及其代謝物等）的優(yōu)勢前處理技術(shù)，引起了研究人員的廣泛關(guān)注[43]。本文系統(tǒng)評述了SPME、μ?SPE和LPME等微萃取技術(shù)在生物樣品中痕量NTs的高效富集及分析檢測的應(yīng)用研究進展，并對該領(lǐng)域的研究進行了總結(jié)與展望。

2?固相微萃取

固相微萃?。⊿PME）是基于待測組分與萃取涂層之間分配平衡的新型前處理方法，集采樣、萃取、富集和進樣于一體，具有操作簡便、耗時短、不（少）使用有機溶劑、萃取效率高且易與其它儀器聯(lián)用等優(yōu)點。目前，SPME技術(shù)已廣泛用于各種復(fù)雜生物樣品中痕量NTs的分離與分析研究。SPME技術(shù)根據(jù)萃取涂層形式的不同，主要可分為纖維頭式固相微萃?。‵iber?SPME）、管內(nèi)固相微萃?。↖n?Tube?SPME， IT?SPME）和攪拌棒式固相微萃取等，目前用于NTs分離分析的SPME技術(shù)主要是Fiber?SPME和IT?SPME。

2.1?纖維頭式固相微萃取

Fiber?SPME是目前發(fā)展最為成熟的SPME技術(shù)，具有操作簡單、攜帶方便、可重復(fù)使用、環(huán)境友好等特點，其裝置組成包括纖維頭、可移動手柄和注射器。Fiber?SPME纖維頭是表面涂覆了不同類型吸附劑的熔融石英纖維涂層，是Fiber?SPME技術(shù)的核心，決定了SPME的選擇性和富集容量。Fiber?SPME涂層一般需要滿足以下條件：（1）對目標物具有一定萃取富集能力; （2）萃取后目標物能從涂層上較快解吸下來; （3）有良好的熱穩(wěn)定性及耐酸堿、耐溶劑性能。目前，商品化的SPME涂層主要包括聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane， PDMS）、聚二甲基硅氧烷?二乙烯基苯（Polydimethylsiloxane?divinylbenzene， PDMS?DVB）、聚丙烯酸酯（Polyacrylate， PA）、聚乙二醇?模板樹脂（Carbowax?templated resin， CW?TPR）、碳分子篩?聚二甲基硅氧烷（Carboxen?polydimethylsiloxane， CAR?PDMS）和聚乙二醇?二乙烯基苯（Carbowax?divinylbenzene， CW?DVB）。商品化SPME涂層簡單易得，已有研究者將其應(yīng)用于生物樣品中痕量NTs的分析研究。Auger等[44]對比了4種商品化SPME涂層（PDMS?DVB、PA、PDMS、CW?TPR）對MNTs的萃取效果，其中CW?TPR涂層萃取性能最好，結(jié)合HPLC?ED檢測，建立了大鼠紋狀體中痕量MNTs的定量分析方法，檢出限可達0.1 μg/L。衍生化是常用的前處理手段，可將待測物轉(zhuǎn)化為適合分析檢測的形式。由于MNTs常具有強極性基團，如氨基和酚羥基，因此極性較大， 揮發(fā)性較弱，常規(guī)的氣相色譜無法滿足檢測需求。通過選用合適的衍生化試劑，則可將這些基團轉(zhuǎn)化為弱極性基團，以提高其揮發(fā)性。Naccarato等[41]采用氯甲酸丙酯快速衍生化MNTs，使目標物極性降低，揮發(fā)性提高，然后采用PA Fiber?SPME結(jié)合GC?MS檢測，建立了尿液中DA、5?HT、NE的分析方法，檢出限分別為0.59、0.38和13.5 μg/L。

商品化SPME涂層的萃取機理主要是基于“相似相溶”原理，由于選擇性較差，限制了其更廣泛的研究與應(yīng)用，因而研發(fā)高選擇性NTs的SPME涂層成為目前的研究熱點。Cudjoe等[24]將硅基和聚合物載體基混合制備了多種陰陽離子混合型SPME涂層，結(jié)合LC?MS/MS技術(shù)，建立了生物樣品中NTs的定量分析方法?；旌闲蚐PME涂層具有疏水和親水機制下多重相互作用的特點，對4種不同極性的NTs（DA、5?HT、谷氨酸和γ?氨基丁酸）均可實現(xiàn)高效萃取富集，將該方法應(yīng)用于腦脊液和大鼠腦組織中NTs的分析，檢出限為6～10 ng/L。分子印跡聚合物（Molecularly?imprinted polymer，MIP）也被稱為人工抗體，具有模板分子的特異性識別位點，能有效提高目標分子的選擇性識別，同時MIP具有化學(xué)穩(wěn)定性高、制備簡便、使用壽命長等特點[45]。因此，將MIP固載成SPME涂層，可有效提高SPME的選擇性，并可顯著提高復(fù)雜生物樣品基質(zhì)中SPME的抗干擾性能。Prasad等[46]通過溶膠?凝膠法在聚甲基丙烯酸甲酯纖維表面制備了可特異性識別DA的MIP涂層，并通過懸浮汞滴電極表面修飾DA?MIP進行二次預(yù)濃縮，結(jié)合差分脈沖和陰極剝離伏安法對DA進行檢測，成功實現(xiàn)了人體血清、腦脊液及藥物樣品中DA含量的準確測定。在雙重MIP涂層材料的預(yù)富集作用下，實際樣品中DA的分析靈敏度及選擇性都得到較大提高，檢出限為1.82～1.89 μg/L，相對標準偏差（Relative standard deviation， RSD）為1.1%～2.1%。Zhang等[37]以E作為模板，在25 cm柔性毛細管模具內(nèi)通過熱誘導(dǎo)甲基丙烯酸（Methacrylic acid， MAA）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（Ethylene glycol dimethacrylate， EGDMA）自由基共聚合，制備了高選擇性的MIP SPME涂層，并結(jié)合CE用于人體尿液和血清樣品中CAs的定量分析。所制備的涂層具有良好的整體性和足夠的柔韌性，使用壽命長，同時涂層厚度均勻，萃取分析重現(xiàn)性好。在最優(yōu)分析條件下，DA、E、NE的檢出限可分別達到7.4、4.8和7.1 nmol/L，回收率為85%～103%。

離子液體（Ionic liquids， ILs）主要是熔點小于100℃的有機陰陽離子熔融鹽，可通過調(diào)整有機配體的結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)ILs極性的有效調(diào)控，從而可根據(jù)不同極性NTs的結(jié)構(gòu)特點實現(xiàn)選擇性萃取。此外，ILs可循環(huán)使用、不揮發(fā)，避免了傳統(tǒng)有機溶劑造成的環(huán)境污染，是理想的綠色溶劑。同時，ILs電導(dǎo)率高、電化學(xué)窗口大，有利于與電化學(xué)分析技術(shù)聯(lián)用分析生物樣品中的NTs[47]。因此，將ILs作為SPME涂層可減少試劑消耗量，提高方法自動化程度，ILs?SPME在NTs的分析研究上有著良好的應(yīng)用前景。目前，ILs?SPME用于NTs分析的報道主要是ILs作為SPME脫附劑的應(yīng)用。 Baczek研究組[48]首次將ILs?SPME技術(shù)用于生物樣品中NTs的含量測定，使用聚苯乙烯?二乙烯基苯SPME涂層富集NTs，并采用離子液體1?乙基?3甲基咪唑四氟硼酸鹽作為脫附劑，結(jié)合膠束電動色譜?二極管陣列檢測技術(shù)進行分離分析，使人體尿液樣本中NTs的分析靈敏度提高了9～21倍。他們成功地將該方法用于不同腫瘤患兒尿液中多種NTs的定量分析[40]。此外，該課題組[49]還對比了SPE、分散液液微萃取（Dispersive liquid?liquid microextraction， DLLME）、ILs?SPME 方法對生物樣品中NTs的分離富集效果，結(jié)合膠束電動色譜?二極管陣列檢測技術(shù)，對大鼠腦樣品中9種特定的NTs進行分離分析。與DLLME技術(shù)相比，ILs?SPME對DA、NE的萃取率分別提高了2和3.5倍，且基質(zhì)去除的效果更好。而與SPE技術(shù)相比，ILs?SPME的萃取率也有顯著提高，并且無需衍生化，充分說明ILs?SPME技術(shù)在大鼠腦樣品中NTs含量測定中具有優(yōu)勢，為神經(jīng)學(xué)臨床研究提供了重要工具。

Fiber SPME由于涂層體積小，非常適合進行生物組織的活體無（微）損采樣，同時由于SPME涂層高效的富集能力，相比于常用的MD活體分析技術(shù)，?？稍徊东@更多的生物活性物質(zhì)，提供大量實時的生物信息[50]。大腦是生物的信息處理中樞，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，能產(chǎn)生多種NTs且含量水平實時變化，為了不改變或丟失有價值信息，最有效的辦法便是發(fā)展原位活體采樣技術(shù)，從而獲得準確的生物信息。此類研究中生物兼容性SPME涂層的研發(fā)是發(fā)展生物體中NTs原位活體采樣分析技術(shù)的關(guān)鍵。目前，已有一些生物兼容性優(yōu)良的SPME涂層應(yīng)用于生物活體NTs采樣分析的研究報道。Pawliszyn課題組[51]報道了Fiber SPME可有效應(yīng)用于生物活體中NTs的原位實時采樣分析，并能獲得比常規(guī)MD技術(shù)更多的生物信息。之后，該課題組[52]選用表面修飾強陽離子交換基團的親水?親脂平衡材料作為SPME涂層，并通過優(yōu)化Fiber SPME涂層的形狀和采樣條件，結(jié)合LC?MS/MS定量分析，建立了獼猴大腦活體內(nèi)多種NTs的實時原位分析方法（圖1）。研究結(jié)果表明，SPME?HPLC?MS/MS聯(lián)用活體采樣分析方法具有較高的準確度，適合于生物活體中痕量NTs的原位實時檢測。這些研究表明SPME技術(shù)是一種優(yōu)秀的生物活體NTs采樣技術(shù)，是MD技術(shù)的有益補充和拓展。未來，隨著生物兼容性涂層的進一步研發(fā)和原位檢測技術(shù)的發(fā)展，相信SPME技術(shù)在生物活體NTs的原位實時分析方向上將迎來更大的發(fā)展。

2.2?管內(nèi)固相微萃取

IT?SPME技術(shù)采用石英柱或毛細管作為萃取介質(zhì)的載體，將萃取固定相與毛細管的內(nèi)表面交聯(lián)鍵合，克服了Fiber?SPME技術(shù)涂層纖維容易折斷、吸附量低、固定相涂層容易流失以及萃取平衡時間長等問題，同時它還具有萃取涂層薄、萃取固定相選擇范圍廣、樣品擴散迅速、易與其它分析儀器在線聯(lián)用及自動化程度高等特點，但在萃取效率、選擇性和機械穩(wěn)定性等方面仍有很大提升空間。

柱內(nèi)萃取涂層是IT?SPME技術(shù)的核心，決定了萃取柱對目標物的萃取效率和選擇性。IT?SPME通常使用商業(yè)毛細管柱進行萃取，其成本較低，適用范圍也較廣，但由于其吸附劑負載能力不高、穩(wěn)定性低、選擇性差，在用于基質(zhì)復(fù)雜的痕量物質(zhì)如生物樣品中NTs分析時有很大的局限性。因此，開發(fā)具有更高萃取效率和選擇性的新型萃取涂層已成為當前IT?SPME技術(shù)的主要研究方向。溶膠?凝膠技術(shù)是最常見的IT?SPME涂層制備技術(shù)，將反應(yīng)前驅(qū)體及固定相在石英管壁上直接反應(yīng)，不同的涂層常具有不同的極性和多孔結(jié)構(gòu)，引入特定官能團則可進一步提高萃取介質(zhì)的選擇性。溶膠?凝膠技術(shù)過程簡單，制備的SPME涂層穩(wěn)定性較好，目前已有一些報道采用溶膠?凝膠技術(shù)制備新型IT?SPME涂層并用于NTs的分析研究。如圖2所示，Tran等[53]選用乙醇鉭（V）作為溶膠?凝膠前驅(qū)體，端羥基聚丙烯乙二醇甲基丙烯酸酯作為溶膠?凝膠活性聚合物，通過溶膠?凝膠反應(yīng)在熔融石英毛細管內(nèi)合成新型有機?無機雜化涂層。該IT?SPME涂層與毛細管內(nèi)表面通過直接化學(xué)鍵合方式連接，相比傳統(tǒng)的硅基涂層具有更高的溶劑穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性（pH 0～14）。該IT?SPME涂層對水樣中的多種NTs具有優(yōu)異的萃取效率，檢出限在4.41～28.19 pmol/L之間，適用于極端pH下環(huán)境或生物樣品的NTs分析。Alhendal等[54]采用非水解溶膠?凝膠法合成了新型氧化鋯?聚丙烯（ZrO2?PPO）IT?SPME涂層，用于CAs及其脫胺代謝物的微萃取分析。結(jié)果表明，ZrO2?PPO IT?SPME涂層具有良好pH穩(wěn)定性，對CAs及其代謝物具有優(yōu)異的分離富集性能，檢出限為5.6～9.6 pmol/L。

整體柱是20世紀80年代后期提出的一種由單體原位聚合得到整體棒狀材料的分離介質(zhì)制備技術(shù)，已在液相色譜固定相等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[62]。通過在毛細管、PEEK管等微管內(nèi)制備整體柱進行萃取即為整體柱微固相萃取技術(shù)，現(xiàn)已成為樣品前處理技術(shù)的重要形式之一。MMSPE技術(shù)通常采用雙連續(xù)結(jié)構(gòu)和雙孔分布，從而具有優(yōu)異的分離富集性能，非常適合于高通量分離分析。此外，由于整體柱型萃取介質(zhì)的總量相比涂層介質(zhì)有了很大提高，其萃取容量也得到了顯著提高。目前已有采用聚丙烯酰胺類整體柱、聚丙烯酸酯類整體柱和聚合物離子液體整體柱對生物樣品中NTs進行分離分析的報道。

聚丙烯酰胺類整體柱是典型的水相聚合體系，單體可溶于水，具有較好的生物相容性，但其機械強度較差。如圖3所示，本課題組[29]在不銹鋼毛細管柱上原位聚合硼酸鹽親和材料VPBA和N，N'?亞甲基雙丙烯酰胺（N，N'?methylenebisacrylamide， MBAA），制備了聚丙烯酰胺類整體柱poly（VBPA?co?MBAA），并以六通閥為接口，實現(xiàn)與HPLC的在線聯(lián)用，并成功應(yīng)用于人體尿液中MNTs的檢測。由于硼酸鹽材料的高效萃取能力，該整體柱有良好的滲透性、較高的萃取能力和選擇性，所建立的在線分析方法檢出限為0.06～0.80 μg/L，日內(nèi)與日間的RSDs分別為2.1%～8.2%和3.7%～10.6%。

聚丙烯酸酯類整體柱具有優(yōu)異的溶脹性能和理想的機械強度，以及良好的酸堿穩(wěn)定性，并能通過改性或改變單體調(diào)整整體柱的萃取選擇性。Espina?Benitez等[38]以甲基丙烯酸縮水甘油酯為單體，EGDMA為交聯(lián)劑制備了聚丙烯酸酯類整體柱，使用3?氨基苯基硼酸對整體柱作表面功能化處理，然后在毛細管等電聚焦的模式下成功分離測定了人體尿液中CAs的含量。該方法基于等電聚焦過程的特殊聚焦特性，實現(xiàn)了100 mm內(nèi)徑整體柱與50 mm內(nèi)徑羥丙基涂層毛細管的耦合，顯著提高了毛細管電泳紫外檢測的靈敏度，檢出限可達10～21 μg/L。Wu等[30]通過芐胺和1，2?二苯基乙二胺對目標物進行兩步柱前衍生化，采用poly（MAA?co?EGDMA）整體柱進行萃取，并結(jié)合HPLC?FLD法建立了尿液中CAs及其代謝物5?羥基吲哚胺的同時分析方法， 檢出限為0.11～21 nmol/L。 另外，該課題組[63]通過所開發(fā)的熒光衍生化試劑對樣品進行原位衍生化預(yù)處理，再采用聚（3?丙烯酰胺基苯基硼酸?二甲基丙烯酸酯）整體柱進行萃取，結(jié)合HPLC?FLD檢測，建立了小鼠血漿樣品中CAs的分析方法。與常用的SPE衍生化方法相比，該方法檢出限低至0.06～0.20 nmol/L，且操作步驟更少、靈敏度更高。

聚合物離子液體（Polymeric ionic liquids， PILs）不僅結(jié)合了ILs的優(yōu)點，還具有優(yōu)異的熱穩(wěn)定性、高萃取效率和較長使用壽命的特點。將離子液體與交聯(lián)化合物協(xié)同聚合制備得到交聯(lián)聚合物離子液體，可有效克服有機溶劑溶脹的問題，進一步提高萃取性能。Zhou等[64]選用二乙烯基苯為單體，二甲基亞砜為致孔劑，與1?乙烯基?3?丙基苯基咪唑氯發(fā)生共聚反應(yīng)制備得到PILs，再將PILs與二苯基硼酸交聯(lián)得到PILs?二苯基硼酸整體柱，結(jié)合HPLC?ECD對大鼠血液微透析液中3種CAs進行了萃取分離和定量分析。PILs與二苯基硼酸的交聯(lián)克服了萃取劑在有機溶劑使用后發(fā)生溶脹的問題，獲得了良好的萃取性能，分析時間僅需8 min，檢出限為0.02～0.04 μg/L，RSD為6.5%～7.7%。

3.3?分散微固相萃取

萃取效率很大程度上取決于吸附劑的粒徑和表面積，而吸附劑顆粒的高聚集趨勢是制約微固相萃取效率的主要因素之一。通過制備均勻分散的小顆粒吸附介質(zhì)可有效增加吸附劑的表面積，提高萃取效率。DMSPE是一種快速、簡單的微型化前處理技術(shù)，它將吸附劑分散于樣品溶液中，通過漩渦離心等外力輔助萃取過程并完成相分離[65]。與傳統(tǒng)SPE相比，DMSPE可避免通道堵塞的問題，增大萃取劑與分析物之間的接觸面積，提升萃取容量，節(jié)省萃取時間，從而有效提高萃取效率。DMSPE技術(shù)的關(guān)鍵在于用極少量的萃取劑提供很高的萃取效率，從而保證目標物的充分富集，因此，開發(fā)具有高比表面積、高穩(wěn)定性和高選擇性的新型萃取材料一直是DMSPE技術(shù)的研究熱點。目前，已有新型DMSPE技術(shù)用于生物樣品中NTs高效分離分析的研究報道。Abdolmohammad?Zadeh等[66]選用鎳?鋁層狀雙氫氧化物（Layered double hydroxide， LDH）為萃取劑，從人血清中提取多巴胺。采用LDH溶膠溶液作為分散固相微萃取器，并在285 nm激發(fā)波長和315 nm發(fā)射波長下采用熒光光譜法直接測定。結(jié)果表明，采用LDH DMSPE技術(shù)可使DA熒光強度提高近5倍，方法檢出限為0.015 μg/L。

磁性納米顆粒作為一種新型DMSPE萃取劑，采用磁分離技術(shù)實現(xiàn)基體與萃取劑的快速分離，分離富集速度快，操作簡單，近年來受到廣泛關(guān)注[67]。Jiang等[68]采用多步共價修飾法制備了3?氨基苯基硼酸功能化磁性納米顆粒，結(jié)合HPLC?ECD技術(shù)對人尿中3種CAs進行測定，檢出限為2.0～7.9 μg/L。由于3?氨基苯基硼酸僅通過酸堿相互作用吸附在磁性納米顆粒上，其萃取效率有限，檢出限無法滿足實際血樣中CAs的定量要求。Saraji等[31]采用溶膠凝膠法制備了含有硅氧層磁性納米粒子，然后用3?氨基丙基三乙氧基硅烷和戊二醛將3?氨基苯基硼酸通過共價鍵與納米粒子交聯(lián)，制得新型選擇性吸附劑，并結(jié)合HPLC?FLD檢測，成功實現(xiàn)了血漿和尿液中CAs的定量分析，定量限可達0.04～0.06 μg/L。He等[69]制備了亞氨基二乙酸銅功能化Fe3O4@SiO2磁性納米顆粒作為新型吸附劑，結(jié)合HPLC?FLD檢測，建立了家兔血漿中6種MNTs的定量分析方法。在pH=5.0的條件下，MNTs的氨基與固定化銅之間的特異性配位相互作用可有效提高萃取選擇性，同時，弱酸性的萃取條件可有效避免MNTs的氧化，提高萃取效率。在最優(yōu)條件下，該方法檢出限為0.16～0.43 mg/L。Avan等[70]采用共沉淀法合成了磁性Fe3O4@Diaion HP?2MG復(fù)合材料作為萃取劑，通過一次性石墨烯絲網(wǎng)印刷碳電極方波伏安法成功測定了尿樣中DA的含量，檢出限為5.0 nmol/L。此外，還有報道將MIP材料用于新型磁性DMSPE萃取劑的研究。磁性MIP（Magnetic molecularly imprinted polymer， MMIP）與MIP相比，其納米級的結(jié)構(gòu)使其具有更好的溶劑分散性，并且由于其能在磁性分離器中被快速分離，大大縮短了繁瑣的離心時間，有效提高分離分析效率。Bouri等[71]以DA為模板分子，甲基丙烯酸為交聯(lián)劑，F(xiàn)e3O4為磁性組分，制備了MMIP材料，采用毛細管電泳?二極管陣列檢測技術(shù)測定脫附的分析物，成功建立了人尿液樣本中CAs的快速、高選擇性分離分析方法。 萃取完成后，MMIP和捕獲的分析物很容易被外加磁場從樣品基體中分離出來。在最佳條件下，方法檢出限為0.04～0.06 μmol/L，RSD為2.9%～5.5%。Claude等[72]采用MIP?DMSPE去除尿樣中鹽和基質(zhì)分子，并預(yù)濃縮分析物，再通過現(xiàn)場放大樣品注射，結(jié)合CE?UV檢測，建立了人尿樣本中CAs、甲腎上腺素和吲哚胺的高靈敏分析方法，檢出限為6～10 nmol/L。

4?液相微萃取

液相微萃取技術(shù)（LPME）自1996年首次提出后得到了快速發(fā)展[73]。與傳統(tǒng)的LLE技術(shù)相比，LPME技術(shù)操作簡便，所需溶劑極少，富集倍數(shù)大，集萃取、凈化、濃縮和預(yù)分離于一體，并易與GC、HPLC、CE等現(xiàn)代分離檢測技術(shù)聯(lián)用，已逐漸應(yīng)用于生物樣品前處理中[74]。目前，將LPME技術(shù)應(yīng)用于生物樣品中NTs， 可分為直接液液微萃?。↙iquid?liquid microextraction， LLME）及衍生化LLME。

4.1?直接液液微萃取

DLLME是由Rezaee等于2006年提出的一種常用的LLME技術(shù)[75]。該技術(shù)通過加入與水溶液和萃取劑均互溶的分散劑形成乳濁液，再通過離心分離實現(xiàn)水相中待測物的快速萃取。分散劑的加入使萃取相與水相之間的表面接觸大大增加，從而加速了分析物從樣品基體到萃取劑相的傳質(zhì)。由于DLLME具有簡單快速、高效、成本低、有機溶劑用量少的優(yōu)點，成為目前生物樣品中NTs分析中最常用的LLME技術(shù)[76，77]。由于NTs多為親水性化合物，一般有機溶劑難以萃取，為了實現(xiàn)NTs的高效富集分離，常在直接LLME過程中結(jié)合其它技術(shù)，以強化萃取過程，提高LLME的效率[78]。

離子液體（ILs）作為綠色萃取溶劑，近年來在LLME中得到了廣泛應(yīng)用。Jha等[25]通過離子液體超聲輔助DLLME方法，結(jié)合LC?MS/MS快速、同時測定了大鼠腦、血漿和細胞樣品中的15種NTs。他們選用離子液體1?丁基?3?甲基咪唑六氟磷酸鹽作為萃取劑，乙腈作為分散劑。該方法無需衍生化，耗時短，從樣品制備到定量測定，整個分析過程不超過15 min，NTs的檢出限為0.021～0.978 μg/L。Xie等[79]構(gòu)建了石墨烯片/離子液體納米復(fù)合修飾電極， 用于DA的原位電化學(xué)LLME。該研究將石墨烯片浸漬在與水溶液接觸的離子液體1?辛基?3?甲基咪唑六氟磷酸中，形成三相體系，采用控制電位電解法從水樣中原位提取預(yù)富集DA到離子液體中，然后通過方波伏安溶出分析法測定DA含量。該方法抗基體干擾能力強，在高濃度的抗壞血酸和尿酸等基底存在下，DA的檢出限仍可達8.0 nmol/L。

超聲輔助乳化微萃?。║ltrasound?assisted emulsification microextraction， USAEME）利用超聲乳化作用，將萃取溶劑均勻穩(wěn)定地分散到液體樣本，避免DLLME中使用分散劑，具有環(huán)保、萃取效率高、有機溶劑少、操作簡單等優(yōu)點。然而，乳化微萃取中使用的萃取相多局限于比水重的有機溶劑，與CE分析過程不匹配。為了適應(yīng)CE分析的需求，Huang等[39]采用兩個串聯(lián)USAEMEs預(yù)處理尿液樣品，并結(jié)合CE建立了一種簡便、靈敏的同時測定尿液中5?HT的分析方法。此串聯(lián)USAEMEs程序包括從樣品溶液（含K2CO3添加劑的尿液）中萃取分析物到有機溶液中，然后從有機相反萃取到少量HCl溶液中。樣品預(yù)處理15 min后，采用毛細管區(qū)帶電泳模式直接分析酸性受體溶液。HCl不僅提供了有效的反萃取介質(zhì)，而且在CE分析中促進了pH介導(dǎo)的柱上堆積。該方法使得5?HT檢測的靈敏度提高了360倍，檢出限可達到7.9 nmol/L。Jiang等[34]開發(fā)了一種固化剝離相的新型載體介導(dǎo)LLME技術(shù)，并結(jié)合HPLC?ECD測定了人體尿液中的MNTs含量（圖4）。

由于親水性的MNTs難以直接被有機相萃取，他們首先采用二乙基己基磷酸和三辛基氧膦混合載體介導(dǎo)有機相萃取樣品溶液中的MNTs，再利用微量HCl溶液作為剝離溶液對有機相進行反萃取。反萃取結(jié)束后，將HCl冷凍凝固以便于與有機相分離，在室溫下融化的剝離相可直接用于HPLC?ECD分析。采用水相代替有機相注入HPLC，不僅避免了有機相注入對色譜柱的污染，而且提高了LPME注射液與HPLC流動相的相容性， 方法檢出限為5.5～10.8 μg/L，日內(nèi)和日間相對標準偏差均低于13%。

4.2?衍生化液相微萃取

衍生法技術(shù)通常借助化學(xué)反應(yīng)將衍生化試劑所含有的色譜或質(zhì)譜增敏功能基團引入到檢測物中，從而顯著提高分析物的靈敏度、選擇性和準確度。近年來，原位衍生化DLLME技術(shù)因其在簡化實驗過程，減少樣品損失，提高方法靈敏度，降低基體干擾等方面的優(yōu)勢，已應(yīng)用于生物樣品NTs的分離與分析。

為了改善色譜分離，提高LC?MS檢測的靈敏度，He等[80]設(shè)計了幾種具有質(zhì)譜增敏特性的衍生化試劑。他們首先采用具有潛在MS增敏特性的商業(yè)試劑賴氨酸羅丹明B磺酰氯（Lissamine rhodamine B sulfonylchloride， LRSC）作為衍生化試劑，對NTs中氨基和羥基進行同時標記，結(jié)果表明，該衍生化方法不僅提高了NTs衍生物離子的質(zhì)荷比，而且提高了NTs在ESI?MS/MS分析中的電離效率，從而提高了UHPLC?MS/MS檢測的靈敏度。然后，選用低毒性的溴苯作為萃取劑，乙腈作為分散劑，對衍生化后的溶液進行超聲輔助DLLME，結(jié)合UHPLC?MS/MS同時測定了帕金森病大鼠腦透析液中的多種CAs及其前體和代謝物，方法檢出限可達2×103～4×103nmol/L。與其它傳統(tǒng)的LC?MS/MS衍生化方法相比，檢出限降低了1～3個數(shù)量級，且耗時顯著縮短。該方法被成功應(yīng)用于正常大鼠和左旋多巴（DA前體）誘導(dǎo)運動障礙大鼠的大腦微透析液中的多種NTs及其前體和代謝物的分析[81]。此后，基于羅丹明分子中正電荷帶來的MS增敏特性，他們設(shè)計合成了一種新型MS增敏衍生化試劑4'?羰基氯羅丹明（4'?Carbonyl chloride rosamine， CCR）[82]。選用低毒性的4?溴茴香醚作為萃取劑，乙腈作為分散劑，進行UADLLME前處理，結(jié)合UHPLC?MS/MS同時測定了帕金森大鼠腦微透析液中MNTs和AANTs含量。該方法的前處理過程僅需3 min，顯著縮短了樣品前處理時間，檢出限降低至1×10-4～3×10-3nmol/L。隨后，他們又采用該方法同時測定了阿茲海默癥大鼠尿液中AANTs和MNTs的濃度，僅用16 min便可在10-10mol/L濃度水平下分離檢測22種分析物，表明該方法具有靈敏度高、選擇性好、基體效應(yīng)低的優(yōu)點[83]。與商業(yè)試劑LRSC相比，CCR衍生化的檢出限比LRSC低1個數(shù)量級。這一方面可能是由于ESI源中CCR衍生物的電離效率更高，另一方面，LRSC及其衍生物的結(jié)構(gòu)容易受溶劑環(huán)境的酸堿度影響而失去分子正電荷，從而使得CCR衍生物的MS檢測靈敏度更高。

除了CCR衍生化試劑外，他們還設(shè)計合成了d0/d3?10?甲基?吖啶酮?2?磺酰氯（d0/d3?10?Methyl?acridone?2?sulfonyl chloride，d0/d3?MASC）作為穩(wěn)定同位素編碼衍生化試劑，結(jié)合超聲輔助LLME技術(shù)，建立了UHPLC?MS/MS快速測定MNTs及其生物合成前體和代謝物的新方法，并成功應(yīng)用于帕金森病大鼠和正常大鼠腦微透析液的測定[84]。該方法使用d0?MASC、d3?MASC試劑分別對大鼠腦微透析液樣品和混合標準對照品進行衍生化處理，以d3?MASC衍生物作為d0?MASC衍生物的內(nèi)標進行定量分析，克服了傳統(tǒng)同位素稀釋法的內(nèi)標缺少或商品化試劑價格昂貴的缺點，并可顯著降低基體效應(yīng)，該方法檢出限為2×10-3～1×10-2nmol/L，RSDs為4.2%～8.8%。

5?總結(jié)與展望

微萃取技術(shù)由于其耗時短、溶劑用量少、易于實現(xiàn)自動化等優(yōu)點，已成為生物樣品NTs的高效分離富集方法。近年來，高效微萃取介質(zhì)的研制極大地提高了微萃取技術(shù)對生物樣品NTs的分離富集容量及選擇性，提高了分析的靈敏度及準確度。目前，常用于生物樣品NTs前處理的功能性材料包括MIP、ILs、硼酸鹽親和材料等。這些材料在微萃取介質(zhì)中的應(yīng)用克服了商品化微萃取介質(zhì)穩(wěn)定性差，對極性NTs選擇性差、回收率低的缺點，但仍存在許多尚待解決的問題：如MIP可對目標分子進行高選擇性識別，但移除模板較難，影響分析準確性，并且適用于水相的功能單體和交聯(lián)劑種類有限; 離子液體既可作為優(yōu)良萃取溶劑，又可作為選擇性固定相材料，可滿足多種微萃取形式的需要，但其在復(fù)雜樣品基質(zhì)中存在適應(yīng)能力較差的問題; 硼酸鹽親和材料可控吸附/解吸順式二醇的特性，在萃取介質(zhì)研制中得到廣泛應(yīng)用，但其適用范圍偏窄，在對種類豐富的NTs進行高通量分析時有所限制。因此，研發(fā)選擇性高、抗基質(zhì)干擾能力強、適用范圍廣的微萃取介質(zhì)仍是今后的研究熱點。

另一方面，微萃取技術(shù)形式的研發(fā)更新，進一步拓寬了微萃取技術(shù)在生物樣品NTs分析研究的應(yīng)用范圍。在未來的研究中，微萃取技術(shù)應(yīng)朝著更便攜化、微型化方向發(fā)展，構(gòu)建生物活體NTs的實時動態(tài)含量檢測方法?；铙w生物樣品NTs含量的實時分析常能提供離線分析無法獲得的體內(nèi)時空動態(tài)化學(xué)信息，對醫(yī)學(xué)、病理學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域的研究有重要的意義。目前，大部分生物活體NTs的分析方法僅用于動物實驗，未來應(yīng)著重開發(fā)真正適用于人體NTs的分析方法。尤其在腦神經(jīng)化學(xué)研究中，有效的神經(jīng)通訊依賴于神經(jīng)突觸內(nèi)外多種NTs的瞬時平衡，且NTs僅在有限的動態(tài)范圍內(nèi)發(fā)揮作用，因此，開發(fā)可實時檢測多個大腦區(qū)域NTs含量變化的原位活體分析技術(shù)，將成為未來生物NTs研究的熱點。新型高效微萃取技術(shù)在生物樣品NTs的分析研究進展將極大促進人類疾病診斷、藥物科學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展，為人類健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到重要的推動作用。

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Application of Microextraction in Neurotransmitter Analysis

YU Zhong?Ning， ZHANG Zhuo?Min*， LI Gong?Ke*

（School of Chemistry， Sun Yat?sen University， Guangzhou 510275， China）

Abstract?Neurotransmitters play an important regulatory role in organisms as endogenous compounds. Accurate determination of neurotransmitters in biological samples is of great significance in early diagnosis of diseases， drug development， basic medical research and other fields. However， it is difficult to achieve accurate analysis because of their complex matrix composition and extremely low concentrations. Therefore， the key to improve the sensitivity and accuracy for the analysis of trace neurotransmitters in complex biological samples is to develop efficient sample pretreatment technology. Microextraction technology is a green extraction technology based on microscale enrichment media which is considered as an excellent pretreatment technology for the analysis of endogenous substances in biological samples due to its low cost， convenient use， adaptability to nondestructive analysis and environmental friendliness. In this paper， we systematically reviewed the application of solid?phase microextraction， micro?solid?phase extraction， and liquid phase microextraction technologies in the high?efficiency enrichment and analysis of trace neurotransmitters in biological samples.

Keywords?Microextraction technology; ?Neurotransmitters; ?Biological samples; ?Review