李寶華，劉 平，王 新

0引言

年齡相關(guān)性黃斑變性(ARMD)是嚴重威脅老年人身體健康的一種重要疾病。隨著年齡的增加，視網(wǎng)膜色素上皮細胞和神經(jīng)視網(wǎng)膜發(fā)生退行性病變，造成不可逆性視力下降或喪失。ARMD在西方國家已成為第一位致盲性眼病，在亞洲其發(fā)病率亦逐漸增多[1]。因其病因不明，目前仍未找到阻止其病程進展的有效方法，因此臨床中加強該病的診斷與治療對于降低其發(fā)病率，提高預(yù)后效果具有重要的研究意義。

端粒是位于真核生物染色體末端的核蛋白復(fù)合體，其主要作用是保證染色體完整和基因組穩(wěn)定性。端粒長度進行性縮短最終可導(dǎo)致細胞分裂停止，迫使細胞衰老及死亡[2]。已有研究發(fā)現(xiàn)端粒長度與ARMD發(fā)病之間存在一定關(guān)聯(lián)[3]。端粒酶的活化是端粒長度維持或延長的主要機制，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)是端粒酶催化亞基，可通過合成染色體末端DNA而延長端粒，致使細胞異常增殖甚至永生化[4]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是基因組中重要的遺傳變異之一，已有研究發(fā)現(xiàn)TERT基因遺傳變異與冠心病、肺癌、腎癌等多種重大疾病發(fā)生密切相關(guān)[5-7]，而目前TERT基因SNP與ARMD發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)仍未見報道?；诖耍疚耐ㄟ^高通量遺傳變異基因分型技術(shù)，探討TERT基因SNP與ARMD患者發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性，評估其作為ARMD患者早期診斷新型分子標(biāo)志物的可行性。

1對象和方法

1.1對象選取2017-03/2019-01于我院眼科就診并確診為ARMD的患者191例為病例組，其中男101例，女90例；年齡68.0±4.6歲。納入標(biāo)準：(1)經(jīng)眼底血管熒光造影及OCT檢查確診為ARMD；(2)年齡不小于45歲；(3)均為漢族。排除患有除ARMD以外的其它眼部疾病，既往有眼外傷史、眼部手術(shù)史，合并高血壓、心血管疾病、糖尿病、腫瘤等全身性疾病患者。選取同期來我院體檢的健康體檢者197例為對照組，其中男109例，女88例；年齡67.1±6.0歲。兩組受檢者性別構(gòu)成、年齡相匹配，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.235，P=0.628；t=1.618，P=0.107)。本研究經(jīng)過本院倫理委員會審查通過，所有受檢者均同意參加本研究并簽署知情同意書。

表1 TERT基因SNP等位基因基因型與ARMD發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)

SNP編號基因區(qū)域等位基因型MAF病例組對照組PaOR(95%CI)Pbrs2075786內(nèi)含子A/G0.1650.1600.9991.03(0.85～1.25)0.767rs10069690內(nèi)含子C/T0.1990.1400.7891.24(1.02～1.50)0.029rs2242652內(nèi)含子G/A0.2040.1750.1491.10(0.92～1.31)0.319rs2853677內(nèi)含子A/G0.3720.3650.9781.01(0.87～1.17)0.873rs2853676內(nèi)含子C/T0.1780.1550.9261.08(0.90～1.31)0.415rs2736098外顯子C/T0.3870.3810.7431.01(0.87～1.17)0.892rs2736122內(nèi)含子G/A0.0810.0760.6861.04(0.80～1.35)0.774

注：a：Hardy-Weinberg平衡分析P值；b：非條件性Logistic回歸計算P值，并通過年齡和性別校正。

1.2方法

1.2.1血樣DNA提取采集受檢者空腹靜脈血4mL，分離血漿后，進行血細胞DNA提取(全血基因組小量抽提試劑盒，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)，操作步驟按照試劑盒說明書進行，定量后標(biāo)記并置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SNP位點選擇和基因分型通過PubMed數(shù)據(jù)庫篩選目前已報道的TERT基因中與端粒長度相關(guān)的SNP位點作為候選SNP位點[6，8-9]，并且在中國漢族人群中次等位基因型頻率>0.05，候選位點中連鎖不平衡相關(guān)程度>0.8的位點只保留1個，最終選擇7個位點(rs2075786、rs10069690、rs2242652、rs2853677、rs2853676、rs2736098、rs2736122)進行基因分型?；蚍中蛯嶒灢捎肧equenom Mass Array高通量技術(shù)平臺(Sequenom Inc.，San Diego，CA，USA)完成。

2結(jié)果

2.1 TERT基因SNP不同等位基因型與ARMD發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)對照組受檢者7個SNP位點基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05，表1)。分析每個位點不同等位基因型人群的ARMD發(fā)病風(fēng)險發(fā)現(xiàn)，rs10069690等位基因型為T型的人群與C型相比發(fā)病風(fēng)險顯著提高[OR(95%CI)=1.24(1.02～1.50)，P=0.029]，其它位點不同等位基因型與ARMD發(fā)病風(fēng)險無顯著相關(guān)性。

表2 TERT基因SNP不同基因型的人群分布 例

2.2 TERT基因SNP不同基因型的人群分布進一步分析每個SNP位點3種基因型在兩組受檢者中的分布發(fā)現(xiàn)，SNP位點rs10069690突變基因型(CT、TT)在病例組的比例顯著高于對照組(P=0.03，表2)，其它位點3種基因型的人群分布在兩組間無顯著差異。

2.3 TERT基因SNP位點rs10069690基因型與ARMD發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)利用最常用的3種遺傳模型進一步對SNP位點rs10069690不同基因型與ARMD發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)進行分析發(fā)現(xiàn)，顯性模型得到結(jié)果最為顯著，即與rs10069690野生型(CC)人群相比，包含突變型(CT+TT)的人群ARMD發(fā)病風(fēng)險提高了63%[OR(95%CI)=1.63(1.05～2.53)，P=0.03]，通過隱性模型分析，純合突變型人群(TT)與野生型及雜合型人群相比，ARMD發(fā)病風(fēng)險無顯著差異，見表3。

3討論

本研究通過已發(fā)表文獻篩選出TERT基因中7個與端粒長度存在關(guān)聯(lián)的SNP位點，利用基因分型技術(shù)和統(tǒng)計學(xué)分析首次發(fā)現(xiàn)SNP位點rs10069690不同基因型與ARMD發(fā)病風(fēng)險存在顯著關(guān)聯(lián)，包含突變基因型的人群發(fā)病風(fēng)險顯著提高，其它位點在本研究中未觀察到與ARMD發(fā)病風(fēng)險相關(guān)的證據(jù)。

表3 TERT基因SNP位點rs10069690基因型與ARMD發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián) 例

注：a：非條件性Logistic回歸計算P值，并通過年齡和性別校正。

TERT基因位于人類染色體5p15.33，作為端粒酶的核心組成部分，是調(diào)節(jié)端粒酶活性的關(guān)鍵[10]。已有大量研究發(fā)現(xiàn)TERT基因SNP與多種疾病發(fā)生及進展密切相關(guān)，尤其在腫瘤研究領(lǐng)域，多項研究發(fā)現(xiàn)TERT基因SNP與腫瘤密切關(guān)系，然而與ARMD的相關(guān)性仍未見報道。Duan等[11]通過病例對照研究發(fā)現(xiàn)TERT基因SNP位點rs2853676與胃癌發(fā)病風(fēng)險升高有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，SNP位點rs2853677與非小細胞肺癌及肺腺癌易感性密切相關(guān)[6，12]。而在本研究中，rs2853676和rs2853677與ARMD發(fā)病風(fēng)險無顯著相關(guān)性。SNP位點rs2736098位于TERT基因第二外顯子上，國內(nèi)外多項研究表明rs2736098多態(tài)性與膀胱癌易感性相關(guān)。Rafnar等[13]通過全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)rs2736098與歐洲人群膀胱癌易感性密切相關(guān)。另一項研究發(fā)現(xiàn)，TERT基因rs2736098位點多態(tài)性與美國洛杉磯人群膀胱癌易感性無關(guān)，而與中國上海人群膀胱癌易感性相關(guān)[14]。本研究中rs2736098多態(tài)性與ARMD發(fā)病無顯著關(guān)聯(lián)。也有研究發(fā)現(xiàn)rs2242652與黑色素瘤發(fā)病風(fēng)險密切相關(guān)[15]。

SNP位點rs10069690位于TERT基因第四內(nèi)含子，目前已發(fā)現(xiàn)rs10069690基因型與乳腺癌、膠質(zhì)瘤、卵巢癌等多種腫瘤發(fā)病或預(yù)后密切相關(guān)[16-19]，提示該位點在疾病發(fā)生及進展中可能發(fā)揮一定作用。本研究首次證實了rs10069690與ARMD發(fā)病風(fēng)險密切相關(guān)，但其具體機制仍需進一步研究。我們推測SNP位點rs10069690不同基因型可能通過影響TERT基因表達活性，從而改變端粒長度促進ARMD發(fā)生。雖然rs10069690位點位于基因內(nèi)含子區(qū)，但極有可能通過強連鎖的SNP位點發(fā)揮基因表達調(diào)控作用，因此rs10069690不同基因型影響ARMD發(fā)生的功能機制有待進一步開展。

ARMD是一種衰老相關(guān)疾病，目前對ARMD的治療主要是阻止早期ARMD向晚期ARMD的發(fā)展，而對于晚期ARMD的治療手段有限，因此識別ARMD的危險因素對于ARMD的早期預(yù)防及延緩進展具有重要意義，找到可以用于ARMD臨床診斷的遺傳變異標(biāo)志物仍需篩選新的位點以及大樣本量研究驗證。