劉 玲 唐仕成 柯皓天 呂 銀

(1. 四川省絲綢工程技術(shù)研究中心， 成都 610031；2. 四川省絲綢科學(xué)研究院， 成都 610031)

PCR的退火溫度與引物長度、堿基組成和引物濃度有關(guān)，ISSR引物的退火溫度差異很大是ISSR-PCR反應(yīng)的突出特點。對于長度低于20bp的引物，Tm值可以按Tm=4(G+C)+2(A+T)計算，ISSR引物一般少于20bp，適用于該公式[1]。但是在實驗過程中，往往根據(jù)Tm值得不到清晰穩(wěn)定的擴增條帶，因此在正式實驗之前，有必要確定每個ISSR引物的最適退火溫度。

本試驗在已篩選出桑樹ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，對適合桑樹體系的5條ISSR引物的最佳退火溫度進行篩選，以優(yōu)化ISSR標(biāo)記技術(shù)在桑樹遺傳多樣性方面的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料采自四川省絲綢科學(xué)研究院桑樹種質(zhì)資源圃。

擴增引物參考加拿大英屬哥倫比亞大學(xué)UBC公司2006年公布的ISSR引物序列和已有的ISSR分子標(biāo)記在桑樹方面的應(yīng)用研究結(jié)果[2]，從42條引物中篩選出5條引物(表1)，由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應(yīng)所用的Mg2+、dNTPs、rTaq酶、DNA marker和10×Buffer均購自TaKaRa。

1.2 基因組DNA提取及質(zhì)量檢測

基因組DNA提取參照CTAB法，從約0.15g硅膠干燥的嫩桑葉中提取。DNA質(zhì)量用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，濃度用微量紫外分光光度計檢測確認(rèn)。

1.3 ISSR-PCR擴增

PCR反應(yīng)在Thermal Cycler(上海山富科學(xué)儀器有限公司)上進行。反應(yīng)體系(總體積10 μL)：25ng模板1μL、10×Buffer 1μL、20μmol/L引物0.2μL、2.5mM Mg2+0.8μL、2.5mM dNTPs 1μL、5U/μL rTaq 0.1μL，加ddH2O 至10μL。

反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性40s，合適的退火溫度退火45s，72℃延伸90s，40個循環(huán)，72℃延伸10min，16℃保存。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳檢測，電壓250V，電流150mA，電泳20～25min，在紫外透射反射儀下觀察拍照保存。

1.4 引物退火溫度梯度設(shè)置

以確定的最佳反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，根據(jù)引物Tm值設(shè)置退火溫度梯度范圍為Tm±5℃，PCR儀自動生成12個溫度。PCR擴增后產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)擴增結(jié)果確定引物的最適退火溫度。每個退火溫度擴增設(shè)兩個重復(fù)。

表1 引物信息

Y=(C, T) R=(A, G) V=(A, C, G) H=(A, C, T)

2 結(jié)果與分析

2.1 引物退火溫度的確定

根據(jù)擴增條帶是否清晰和檢測到的位點數(shù)的多少兩個方面來確定引物的最佳退火溫度。引物ID8擴增效果如圖1所示，退火溫度為51.1℃時，兩個重復(fù)的擴增條帶一致、清晰、穩(wěn)定；退火溫度低于51.1℃時，雜帶增多，且出現(xiàn)兩個重復(fù)的擴增條帶不一致的情況；退火溫度高于51.1℃時，擴增條帶減少，同樣存在兩個重復(fù)的擴增條帶不一致的現(xiàn)象。因此，引物ID8的最佳退火溫度應(yīng)選擇51.1℃。本研究中5條引物的最適退火溫度見表2。

圖1 引物ID8退火溫度篩選

引物名稱溫度梯度/℃Tm值/℃最適退火溫度/℃ID541.2,41.5,42.4,43.7,45.2,46.7,48.2,49.7,51.2,53.344.643.7ID846.1,47.2,48.5,49.8,51.1,52.4,53.8,54.9,55.750.251.1ID1047.7,48.8,50.0,51.4,52.8,54.3,55.7,57.1,58.3,59.252.859.2ID1246.1,47.2,48.5,49.8,51.1,52.4,53.8,54.9,55.750.849.8ID4248.8,50.0,51.4,52.8,54.3,55.7,57.1,58.3,59.2,59.554.358.3

2.2 引物Tm值與最適退火溫度擴增效果差異分析

如圖2所示，引物ID10的Tm值為52.8℃，在此溫度條件下，擴增條帶數(shù)量少且不清晰，并不是最優(yōu)結(jié)果，而且與試驗得到的最佳退火溫度59.2℃相差6.4℃，由此可見，引物的Tm值和最佳退火溫度之間，不存在明顯相關(guān)性。

M： Marker

3 討論

退火溫度不同，產(chǎn)生錯配的程度不同。較低的退火溫度，能提高引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定性，但會產(chǎn)生一些非特異擴增。較高的退火溫度能保證特異性擴增，但過高的溫度會抑制引物與模板的結(jié)合。當(dāng)在幾個退火溫度下擴增效果差異不大時，應(yīng)選擇較高的溫度作為引物的退火溫度。本實驗過程中，也出現(xiàn)了部分引物(如ID10)，退火溫度越高條帶越多的情況，這需要重新調(diào)整溫度梯度范圍來尋找最佳退火溫度。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)引物的Tm值與其最適退火溫度之間，沒有明顯相關(guān)性。因此在具體研究中，每條引物的最適退火溫度需要通過實驗獲得，而不能僅靠理論推算獲得。

目前，在優(yōu)化ISSR體系的研究中，多采用設(shè)置溫度梯度確定最佳退火溫度。這種方法受到PCR儀自動生成溫度的限制，對一些特異性較差的引物效率較低。例如，本實驗用到的Thermal Cycler，設(shè)置溫度梯度時，第1與第2溫度點只差0.2℃，第11和第12溫度點只差0.3℃，中間第3到第10溫度點，每兩個溫度點之間相差約1.0℃，得到的擴增結(jié)果只能代表10個退火溫度的情況。

劉麗麗等[3]采用梯度溫度PCR和降落PCR相結(jié)合，優(yōu)化東南石櫟的ISSR-PCR反應(yīng)體系，經(jīng)比較在最適退火溫度下，ISSR擴增結(jié)果與降落PCR的擴增效果差異不大，由于降落PCR不需要額外進行退火溫度的確定，具有明顯的便利性，最終采用了降落PCR進行東南石櫟的ISSR分析。這種方法給桑樹的ISSR分析提供了借鑒。