顧 雙 王向陽

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州 310018）

果蔬保鮮的關(guān)鍵是既要維持生命，又要抑制自身代謝和阻止腐敗菌侵染。適當?shù)拿{迫如低溫、高溫和紫外等處理有助于激發(fā)果蔬的抗逆生理，抑制自身旺盛代謝，提高抗病性[1-3]。低溫冷藏是有效采后控制果蔬品質(zhì)的常見手段[4]，然而外界脅迫條件超過果蔬所能承受的臨界值時，果蔬遭受冷害。找到果蔬合適的低溫承受臨界點，能有效延緩果蔬的衰老腐爛并減少冷害的發(fā)生。趙志磊等[5]報道0℃冷激處理芒果3，4 h和5 h，均顯著降低果實在2℃貯藏期間的冷害指數(shù)和冷害率，提高ATP酶、細胞色素氧化酶和過氧化物酶（POD）的活性。陳留勇等[6]將采后黃桃用0℃的冰水浸泡30 min，然后0℃下貯藏，抑制了其呼吸強度，降低聚半乳糖醛酸酶（PG）活性、丙二醛（MDA）含量和電解質(zhì)滲出率。龐凌云等[7]將圣女果用0℃的冰水處理0.5～2.0 h，并于8℃下貯藏，有效降低了其呼吸速率及可溶性固形物含量，減緩了POD活性的升高，延緩了果實的成熟衰老。對于冷害的研究，解靜[8]將番茄先在3℃下冷藏兩周，再置于20℃下貯藏16 d，定期檢測一系列指標，來明確1-甲基環(huán)丙烯（1-MCP）對番茄冷害的作用。張昭其等[9]對低溫貯藏中的芒果進行間歇升溫處理，延遲了2℃貯藏果冷害引起的乙烯釋放及呼吸強度，抑制細胞膜透性增加，提高了芒果的抗冷害能力。這些果蔬及香蕉、青椒等在稍低于冷害溫度貯藏時，需要15～45 d才能出現(xiàn)冷害癥狀。也有一些果蔬，如桃子、蘆筍等在0℃下長期貯藏，也常常發(fā)生冷害。一些蔬菜，如青菜等的冷藏低限溫度和是否有冷害至今不清楚，如果通過貯藏效果的試驗來確定冷激溫度和冷藏溫度，其實驗周期太長，也容易錯過季節(jié)，因此亟需一種快速評估果蔬承受臨界低溫的方法。

果蔬細胞中的各類細胞器功能正常，其生命才有保證，葉綠體是蔬菜產(chǎn)生自由基最多的細胞器，也是衰老過程中最早衰退的細胞器之一。各種色素在膜上規(guī)則排列，具有吸收光能和釋放熒光的特性，如果葉綠體的類囊體膜或光合中心受到損傷，熒光就會出現(xiàn)變化[10]。檢測其功能是否正常，基本可以代表細胞內(nèi)細胞器的活力狀態(tài)和膜是否正常，通過葉綠素?zé)晒鉁y定儀能夠?qū)@方面提供一種快速、無損的檢測方法。姚春娟等[11]研究發(fā)現(xiàn)不同決明屬植物草決明、望江南和傘房決明的葉綠素?zé)晒馓匦圆町愝^大，主要是F0、Fm、Fv/Fm、ETR指標的差異。Saeid等[12]報道光強和水分脅迫降低了蘆薈的Fm，F(xiàn)v/Fm，YII、葉綠素含量和qP，而增加了NPQ，F(xiàn)0和花色苷含量。作者設(shè)想應(yīng)用葉綠素?zé)晒鈪?shù)來確定蔬菜不同低溫處理的差異。

蔬菜衰老劣變過程中，促進了膜脂質(zhì)的過氧化，膜的完整性受到破壞，表現(xiàn)出膜的透性增大和離子滲漏[13]。目前采用測定電導(dǎo)率來表示離子滲漏和膜透性情況[14-16]，其依據(jù)是離子從細胞內(nèi)滲漏。作者前期試驗發(fā)現(xiàn)，離子選擇性電極比電導(dǎo)儀能更靈敏地測定離子滲漏情況，也有一些人報道過此方法。Harker等[17]采用鈣離子選擇電極測定了蘋果細胞內(nèi)、外的鈣離子含量。David等[18]利用鈣離子選擇電極測定了蘋果果實中的鈣含量，發(fā)現(xiàn)此方法可用來檢測果實中低鈣的臨界水平。戴自飲等[19]用氯離子選擇性電極測量了生菜、菠菜等27種果蔬中的氯離子含量，與化學(xué)測量氯離子含量方法相比，結(jié)果基本一致，避免了化學(xué)測定氯離子使用汞試劑，使實驗人員更加安全，并減少環(huán)境污染。使用離子選擇電極法測定蔬菜中的離子溶出濃度并不多見。作者前期試驗篩選出鉀、鈣、鈉3種離子選擇性電極對測定離子溶出有較高的敏感性。本試驗以青菜（Brassica rapa var chinensis）作為代表，使用這些離子的檢測電極配合葉綠素?zé)晒鉁y定，可快速確定青菜低溫貯藏的臨界點溫度，為未來蔬菜冷激處理或冷藏溫度的快速確定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青菜品種為“上海青”，當?shù)厍宄坎墒?，立即運回實驗室。青菜從外向內(nèi)數(shù)第1，2片葉子為外葉，試驗用外葉。

1.2 儀器與設(shè)備

基礎(chǔ)型葉綠素?zé)晒鈨x（Junior-Pam型），德國Walz公司；電子天平（AY-120），日本 Shimadzu 公司；自動滴定儀（ZDJ-5型）、鉀離子電極（PK-1-01型）、鈣離子電極（PCa-1-01型）、鈉離子電極（6801-01 型）、甘汞參比電極（217 型、232-01 型和6802-01型），上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；密封式恒溫可調(diào)電加熱器（FD-2型），嘉興市欣欣儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 冷卻處理的臨界溫度試驗 取10組青菜葉片，每組3張，用250 mL燒杯放入200 mL提前冰凍的鹽水，插入溫度計，當溫度達-6℃時將1組葉片放入鹽水（0℃以下為食鹽水，0℃以上為去離子水）中，低溫浸泡1 min后取出，用吸水紙吸干水分。 在溫度分別為-4，-2，-1，0，2，4，6，8 ℃和10℃ 時重復(fù)以上操作。根據(jù)試驗結(jié)果篩選，另取7 組葉片，選擇-6，-4，-2，0，1，2℃和4 ℃處理葉片10 min。另取4組葉片，選擇0，1，2和4℃處理葉片30 min。隨時觀察溫度，添加鹽冰維持溫度穩(wěn)定。每次樣品處理后分別測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)。

1.3.2 鉀、鈉、鈣離子的溶出測定 將青菜葉片去梗，剪成細長條狀，稱取1.0 g（1份樣品）放在玻璃培養(yǎng)皿中，測定經(jīng)0，1，2，3℃和4℃處理的青菜葉片30 min后 K+、Ca2+和Na+的濃度變化。測定K+、Ca2+和Na+前，均加入 0.05 mL離子調(diào)節(jié)劑。 測定Na+前用0.2 mol/L二異丙胺將溶液pH值調(diào)至10，以消除H+對電極的干擾。試驗測定重復(fù)3次，取平均值。

1.4 測定方法

1.4.1 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定和分析[20-22]以上不同溫度處理的青菜葉片均過30 min暗反應(yīng)后，每葉取左、中、右 3個部位，打開內(nèi)源光化光（1 150 μmol/m2/s），至穩(wěn)態(tài)后照射遠紅外光，測定各種參數(shù)并分析。

參數(shù)說明：F0——最小熒光（Minimuml fluorescence level）；Fm——最大熒光（Maximum fluorescence level）；Fv/Fm——可變熒光（Maximum photochemical quantum yield ofPS II）；Y（II）——實際量子產(chǎn)量（Effective photochemical quantum yield of PS II）；ETR——表觀電子傳遞速率（The rate of relative electron transport），μmol/m2·s；qP——光化學(xué)猝滅系數(shù)（Coefficient of photochemical fluorescence quenching）；qN（Coefficient of non-photochemicall fluorescence quenching）、NPQ——非光化學(xué)猝滅系數(shù)（Non-photochemical fluorescence quenching）；Y（NO）——非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量（Quantum yield of non-light induced）。

1.4.2 標準曲線的繪制 分別用 KCl、CaCl2、NaCl標準溶液配成 10-1，10-2，10-3，10-4，10-5mol/L濃度梯度，由稀到濃分別測試離子電極電位。根據(jù)電位值（mV）和離子濃度的負對數(shù)值（-lg（c（X）））繪制電極的標準曲線，結(jié)果見圖1。

1.4.3 鉀、鈉、鈣離子溶出的測定 在測量杯中放入50 mL去離子水，取0，1，2，4℃處理的青菜樣品各1.0 g放入杯中，轉(zhuǎn)子速度為60 r/min，測定樣品1 h內(nèi)K+、Ca2+和Na+溶出電位，每隔20 s讀數(shù)記錄，通過標準曲線換算得到離子溶出量，計算公式如下：

圖1 K+ （a）、Ca2+ （b）、Na+ （c）標準曲線Fig.1 Standard curves of K+ （a）、Ca2+ （b）and Na+ （c）

式中，X——電位對應(yīng)標準曲線上的濃度負對數(shù)值；M——摩爾質(zhì)量，g/mol；V——溶液體積，mL；m——樣品量，g。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0軟件對各組變量值進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷水處理對青菜葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

青菜葉片冷水處理1 min，當溫度低至-4℃時，ETR、qP、NPQ和qN 都顯著下降（P<0.05），Y（NO）顯著上升（P<0.05）；NPQ和qN 在-2℃時，均出現(xiàn)小幅度上升，有較弱的冷激反應(yīng)；當溫度低至-6 ℃時，F(xiàn)v/Fm、Y（II）、F0顯著下降（P<0.05）。 青菜低于冰點貯藏，會受到傷害。1 min冷水處理，在-4℃時檢出顯著差異，顯然處理時間1 min是不夠的。

青菜葉片冷水處理10 min，在0℃時，除F0外所有參數(shù)都出現(xiàn)顯著差異（P<0.05），其中ETR和qP下降極顯著（P<0.01），提示青菜在0℃下長期貯藏可能有冷害。1℃處理的NPQ和qN稍微高于2℃處理，顯示稍有冷激反應(yīng)，然而和其它指標一樣都沒有顯著差異。與4℃相比，所有參數(shù)在2℃時均無異常變化，說明2℃下貯藏是安全的。0℃冷水處理10 min已能檢出低溫傷害，其中ETR和qP是最靈敏的指標。

處理30 min時，多數(shù)熒光參數(shù)的變化規(guī)律與處理10 min類似。2℃處理的NPQ和qN顯著高于其它溫度（P<0.05），ETR、Y（II）顯著降低（P<0.05）。F0之間沒有顯著性差異。青菜低溫處理30 min才有顯著的冷激反應(yīng)，2℃能引起冷激反應(yīng)，見圖2。

圖2 冷（或鹽）水處理對青菜葉片熒光參數(shù)的影響Fig.2 Effect of cold（or salt）water treatment on chlorophyll fluorescence parameters of pak choy leaves

2.2 冷水處理對青菜鉀、鈉、鈣離子溶出的影響

Ca2+主要存在于細胞壁，多以結(jié)合態(tài)存在，細胞內(nèi)游離鈣的濃度很低[23]。0，1，2℃處理青菜30 min后Ca2+的溶出顯著高于3，4℃處理。比4℃處理分別高68%，76%和86%。一般溫度高，溶出速度快，然而低于2℃處理反而溶出更多，說明2℃以下低溫可能影響細胞壁其它物質(zhì)與Ca2+的結(jié)合狀態(tài)。

K+主要存在于細胞內(nèi)部，呈游離態(tài)，其溶出需要通過細胞膜，測定其溶出速度有利于分析細胞膜阻隔性。在0～4℃范圍，溫度越低青菜K+溶出越多。1℃處理青菜溶出顯著高于4℃處理（P<0.05），1～3℃處理之間沒有顯著差異。0℃處理青菜的K+溶出量極顯著高于其它低溫處理（P<0.01），比4℃處理高26.2%，說明此時細胞膜對K+的阻隔顯著下降。0℃下長期貯藏對青菜有明顯傷害，1℃處理對細胞有輕微的影響。

Na+細胞外濃度高于細胞內(nèi)，呈游離態(tài)。細胞內(nèi)體積空間大，Na+含量也較多。在0～4℃范圍，溫度越低青菜Na+溶出越少，這與大量Na+離子在細胞外，低溫抑制溶出有關(guān)。1℃和2℃處理青菜的Na+溶出顯著低于 3℃和4℃處理（P<0.05），0℃處理顯著低于 1℃和2℃處理（P<0.05）。 0，1，2℃處理青菜Na+溶出分別比4℃處理低79.8%、30.6%和22.2%，如圖3所示。

圖3 低溫處理對青菜 Ca2+ （a）、K+ （b）和Na+ （c）擴散和溶出量的影響Fig.3 The effect of low temperature treatment on osmosis and diffusion amounts of Ca2+ （a），K+ （b）and Na+ （c）from pak choys leaves

3 結(jié)論

冷鹽水處理1 min不足以影響葉綠素?zé)晒鈪?shù)來判斷青菜冷害、冷激溫度和時間、安全溫度。冷水處理10 min，可以判斷冷害溫度，其中ETR和qP最靈敏。青菜在0℃下長期貯藏可能有冷害，而10 min低溫處理還不足以激發(fā)顯著的冷激反應(yīng)。冷水處理30 min，同樣可以判斷0℃有冷害。ETR和YII作為檢測指標最靈敏，2℃處理30 min能誘發(fā)顯著的冷激反應(yīng)，有助于判斷冷激溫度和時間。ETR對低溫反應(yīng)很靈敏，可以作為低溫傷害的初期指標，F(xiàn)v/Fm可作為實際傷害指標。NPQ和qN的上升可作為逆境指標。

冷處理后K+溶出作為細胞膜透性評價指標比較科學(xué)，0℃處理30 min后K+溶出極顯著上升，說明青菜在0℃下貯藏可能有冷害。0～2℃處理Ca2+溶出顯著上升，說明已引起細胞壁的變化。

匯總低溫對青菜葉綠素?zé)晒夂碗x子溶出的參數(shù)，冷處理10 min以上可判斷冷害溫度。青菜在0℃下長期貯藏有冷害；2℃有冷激反應(yīng)，也可以安全貯藏。誘發(fā)冷激反應(yīng)的時間為30 min。