任嬌艷 李宇娟 史傳超 張 婷 李溢佳 袁爾東* 梁 明*

（1 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 廣州 510640

2 無(wú)限極（中國(guó)）有限公司 廣州 510665）

土茯苓，是百合科光葉菝葜（Smilax glabra Roxb.）的干燥根莖，其黃酮類成分具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛和抗疲勞效果。研究表明，土茯苓提取物對(duì)XOD具有明顯的抑制作用，可降低尿酸的生成，是臨床上用于替代別嘌呤醇治療高尿酸血癥和痛風(fēng)的潛在藥物[1]。土茯苓抑制XOD活性的物質(zhì)基礎(chǔ)是表兒茶素、落新婦苷、槲皮素及柚皮素等。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)天然產(chǎn)物抗痛風(fēng)藥的研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類可通過(guò)促進(jìn)尿酸排泄，抑制XOD活性等多途徑多靶點(diǎn)防治高尿酸血癥[2]。

鰹魚(yú)，屬鱸形總目，鰹屬，是一種海洋洄游魚(yú)類，研究發(fā)現(xiàn)鰹魚(yú)的胃蛋白水解物抗氧化活性高[3]。從鰹魚(yú)中鑒定合成的多肽DLDLRKDLYAN具很強(qiáng)的ABTS自由基和單線態(tài)氧清除能力[4]。日本著名海洋生物科技公司YSK從鰹魚(yú)肌肉中提取鵝肌肽和肌肽兩種天然深海魚(yú)低聚肽，發(fā)現(xiàn)其具有顯著的降尿酸功效。鰹魚(yú)小分子低聚肽與蛋白相比更容易被人體吸收利用[5]。報(bào)道發(fā)現(xiàn)，小分子肽與天然產(chǎn)物交互作用后，可提高其生物活性，如血清白蛋白可與某些藥物分子通過(guò)相互作用將藥物分子更有效地運(yùn)輸?shù)桨衅鞴賉6-8]。因此，研究小分子多肽與中草藥活性成分的交互作用具有重要的科學(xué)和實(shí)際應(yīng)用意義。

本試驗(yàn)以土茯苓和鰹魚(yú)為原料，制備土茯苓黃酮和鰹魚(yú)蛋白肽，比較水提土茯苓和醇提土茯苓中活性成分的含量、DPPH·清除活性及XOD抑制活性，并以蛋白質(zhì)回收率、DPPH·清除活性和XOD抑制活性為指標(biāo)篩選鰹魚(yú)酶解的水解酶。在此基礎(chǔ)上，探討土茯苓黃酮與鰹魚(yú)蛋白肽交互作用產(chǎn)物的XOD抑制活性、DPPH·清除活性及其穩(wěn)定性。最后，利用熒光光譜法研究土茯苓黃酮與鰹魚(yú)蛋白肽交互作用的猝滅機(jī)理。研究對(duì)中草藥活性成分與小分子活性肽的相互作用機(jī)理及降尿酸復(fù)合產(chǎn)品的研發(fā)，具有理論和實(shí)踐指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土茯苓，廣州南北行中藥飲片有限公司；鰹魚(yú)，山東。

2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶、辣根過(guò)氧化物酶，美國(guó)Sigma公司；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶，南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 主要儀器及設(shè)備

UV754N紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)，INESA上海儀電分析儀器有限公司；HYP-1020消化爐，上海書(shū)培實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KDN-1型自動(dòng)凱氏定氮儀，上?？茣钥茖W(xué)儀器有限公司；日立熒光光譜儀，天美（中國(guó)）科學(xué)儀器有限公司廣州分公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土茯苓提取物的提取 將土茯苓干燥根莖用高速粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩后備用。采用兩種溶劑制備土茯苓提取液。

（1）土茯苓水提：稱取一定量土茯苓粉末，按料液比1∶20加入蒸餾水，浸泡6 h，80℃下超聲30 min，4℃，8 000 r/min離心 20 min，提取 3次，合并濾液后蒸發(fā)濃縮至一定體積，冷凍干燥，保存。

（2）土茯苓醇提：稱取一定量土茯苓粉末，按料液比1∶20加入60%乙醇溶液，浸泡6 h，80℃下超聲提取 30 min，4℃，8 000 r/min離心 20 min，提取3次，合并濾液后蒸發(fā)濃縮至一定體積，冷凍干燥，保存。

1.3.2 土茯苓提取物活性成分測(cè)定 參照文獻(xiàn)[9-10]亞硝酸鈉-氯化鋁比色法和苯酚-硫酸法，稍作修改。分別測(cè)定提取物中總黃酮和總多糖含量。將提取物溶液與3倍體積的無(wú)水乙醇混合均勻，于4℃冰箱過(guò)夜醇沉，再經(jīng)4℃，8 000 r/min離心20 min，收集濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，冷凍干燥得到土茯苓黃酮。

1.3.3 鰹魚(yú)蛋白肽水解酶篩選 將完整的鰹魚(yú)攪碎成魚(yú)糜，稱取一定質(zhì)量的鰹魚(yú)魚(yú)糜，按照料液比1∶3加入蒸餾水，沸水浴5 min預(yù)處理滅酶，按加酶量（E/S）1%分別加入4種水解酶（中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰酶），酶解溫度為55℃，酶解pH 7.0，酶解4 h后，沸水浴10 min滅酶，在4℃，8 000 r/min離心20 min后過(guò)濾，蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，得到鰹魚(yú)蛋白肽。

1.3.4 蛋白質(zhì)回收率的測(cè)定 采用凱氏定氮法（GB/T 5009.5-2003）測(cè)定總氮含量，按照公式（1）計(jì)算其蛋白質(zhì)回收率（Nitrogen recovery，NR）。

1.3.5 XOD抑制活性測(cè)定 抑制XOD活性是降低尿酸生成的有效途徑，常用于評(píng)價(jià)藥物的體外降尿酸活性[11-13]。黃嘌呤氧化酶（XOD）將黃嘌呤催化氧化成尿酸和H2O2，H2O2再經(jīng)過(guò)辣根氧化物酶（HRP）作用分解，可使4-氨基安替比林與苯酚形成亞醌類紅色化合物，其反應(yīng)原理式（2）、（3）。

參照雙酶偶聯(lián)法[14]，并稍作修改。分別取100 μL pH 8.0 Tris-HCl緩沖液和待測(cè)樣品于10 mL離心管，加入 50 μL 0.52 U/mL的XOD，37℃保溫10 min，加入 2.9 mL顯色液和400 μL 2 mmol/L黃嘌呤溶液，37℃保溫20 min。反應(yīng)結(jié)束后，加入50 μL 1 mol/L NaOH溶液滅酶，同時(shí)做3個(gè)平行試驗(yàn)，508 nm波長(zhǎng)處測(cè)定相應(yīng)的吸光值（As）。以不加X(jué)OD反應(yīng)體系作為參比，Tris-HCl緩沖液為空白對(duì)照（A0）。 按照公式（4）計(jì)算XOD抑制率。

1.3.6 DPPH·清除活性測(cè)定 參照文獻(xiàn) [15-16]，用DPPH·清除率的IC50值來(lái)表征提取物的抗氧化活性。取2 mL樣品與2 mL DPPH·溶液混合均勻，室溫下避光反應(yīng)30 min后，于517 nm波長(zhǎng)下測(cè)相應(yīng)的吸光值，記為A樣。以2 mL蒸餾水與2 mL DPPH·溶液做空白對(duì)照，記為A0，2 mL蒸餾水與95%乙醇混合溶液做參比。按照公式（5）計(jì)算DPPH·清除率。

1.3.7 交互作用體系建立及活性評(píng)價(jià) 根據(jù)土茯苓黃酮和鰹魚(yú)蛋白肽的XOD抑制活性，將17 μg/mL土茯苓黃酮和11 mg/mL鰹魚(yú)蛋白肽進(jìn)行復(fù)配，比較交互作用后與兩者分別測(cè)得XOD抑制活性之間的差異。

同時(shí)依據(jù)土茯苓黃酮和鰹魚(yú)蛋白肽的DPPH·清除活性，將2 mg/mL鰹魚(yú)蛋白肽與不同質(zhì)量濃度土茯苓黃酮（5，7，9，11 μg/mL）進(jìn)行復(fù)配，并測(cè)定相應(yīng)的DPPH·清除活性。篩選DPPH·清除活性最好的復(fù)合物，進(jìn)一步研究其抗氧化活性的穩(wěn)定性：

（1）溫度的影響：根據(jù)工藝生產(chǎn)殺菌技術(shù)，研究了3個(gè)溫度條件（常溫：25℃，1 h；巴士殺菌：62～65℃，30 min；高溫長(zhǎng)時(shí)滅菌：121℃，20 min）下DPPH·清除活性的變化。

（2）pH值的影響：根據(jù)多肽和中草藥液體產(chǎn)品的酸度值，研究了 3 個(gè) pH 值（5.5，6.0，6.5）條件下產(chǎn)物的DPPH·清除活性。

1.3.8 熒光光譜分析法 參照文獻(xiàn)[17-19]方法檢測(cè)樣品的熒光吸收光譜，并稍作修改。用pH 7.40 Tris-HCl緩沖溶液將樣品配制成不同質(zhì)量濃度的溶液，在25℃反應(yīng)1 h后，在280 nm波長(zhǎng)處激發(fā)，測(cè)定溶液在295～500 nm波長(zhǎng)處的熒光吸收光譜。

（1）質(zhì)量濃度對(duì)鰹魚(yú)蛋白肽熒光吸收光譜的影響：用Tris-HCl緩沖溶液將鰹魚(yú)蛋白肽配制成蛋白質(zhì)量濃度分別為10，15，20，25，30 μg/mL的溶液，并測(cè)定相應(yīng)的熒光吸收強(qiáng)度。

（2）土茯苓黃酮對(duì)鰹魚(yú)蛋白肽熒光吸收光譜的影響：用Tris-HCl緩沖溶液將土茯苓黃酮配制成質(zhì)量濃度為10，20，40，80，160 μg/mL的溶液，分別與25 μg/mL鰹魚(yú)蛋白肽復(fù)配，測(cè)定相應(yīng)的熒光吸收強(qiáng)度。

（3）溫度對(duì)交互作用產(chǎn)物熒光吸收強(qiáng)度的影響將復(fù)合物置于不同溫度（25，37℃）下反應(yīng)1 h后，測(cè)定其熒光吸收強(qiáng)度。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件分析，以P<0.05為顯著性評(píng)定指標(biāo)，數(shù)據(jù)用±SD表示，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graph prism和Origin 2017制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土茯苓黃酮提取物的篩選及活性評(píng)價(jià)

由圖1a可知，提取物的多糖提取率間無(wú)顯著性差異，而醇提物的黃酮提取率顯著高于水提物（P<0.01）。由圖1b和1c可知，醇提物的DPPH·清除率IC50值顯著低于水提物，且隨質(zhì)量濃度增加其XOD抑制活性升高，而水提物幾乎無(wú)XOD抑制活性。其原因可能是水提與醇提所得黃酮類物質(zhì)種類組成不同，且醇提物中含有部分醇溶性黃酮，表現(xiàn)出更好的DPPH·清除活性和XOD抑制活性。因此，用醇提土茯苓黃酮做進(jìn)一步交互作用研究。

圖1 不同提取物的多糖和黃酮提取率（a）、DPPH·清除率IC50值（b）和XOD抑制活性（c）Fig.1 The extract rate of polysaccharide and flavonoids from different extracts（a），DPPH· scanvenging rate IC50values（b）and XOD inhibition activities（c）

2.2 鰹魚(yú)蛋白肽的篩選及活性評(píng)價(jià)

由圖2a可知，木瓜蛋白酶酶解液的蛋白回收率顯著高于其它水解酶酶解液（P<0.05），且其XOD抑制活性最高為33.54%。由圖2b可知，木瓜蛋白酶的DPPH·清除率IC50值最小，活性顯著高于其它各水解酶（P<0.01）。木瓜蛋白酶屬巰基蛋白酶，其酶切位點(diǎn)為精氨酸和賴氨酸的羧基端，N-端具有2個(gè)羧基的氨基酸和芳香L-氨基酸的肽鍵。

由圖2c木瓜蛋白酶酶解液的氨基酸含量分布可知，其中具有2個(gè)羧基的天冬氨酸、谷氨酸的百分含量最高，精氨酸和賴氨酸的含量也相對(duì)較高，且木瓜蛋白酶蛋白質(zhì)回收率最高，說(shuō)明其酶解液中多肽的種類和數(shù)量較其它酶解液多。同時(shí)，酶解液中含有9.33%的脯氨酸，不僅疏水性強(qiáng)，可形成疏水相互作用，其吡咯烷結(jié)構(gòu)可通過(guò)氫鍵與酚羥基結(jié)合[19]，因此木瓜蛋白酶酶解所得鰹魚(yú)蛋白肽活性最高。

圖2 不同水解酶酶解液的蛋白回收率與蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為30 mg/mL時(shí)XOD抑制活性（a）、DPPH·清除率IC50值（b）和木瓜蛋白酶酶解液總氨基酸圖譜（c）Fig.2 Protein recovery rates and XOD inhibition activities at 30 mg/mL（a），DPPH· scavenging rate IC50 values（b）and amino acid analysis of papain protease solution（c）

2.3 交互作用產(chǎn)物活性評(píng)價(jià)

2.3.1 交互作用產(chǎn)物XOD抑制活性 從圖3可知，17 μg/mL土茯苓黃酮和11 mg/mL鰹魚(yú)蛋白肽XOD抑制率相當(dāng)，說(shuō)明土茯苓黃酮的XOD抑制活性高于鰹魚(yú)蛋白肽，交互作用后XOD抑制率（47.35%）比黃酮和多肽分別測(cè)得XOD活性顯著升高（P<0.05），說(shuō)明交互作用有助于提升XOD抑制活性。由于低質(zhì)量濃度下，土茯苓黃酮和鰹魚(yú)蛋白肽具有很高的DPPH·清除活性，且雙酶偶聯(lián)法所用XOD質(zhì)量濃度高。因此，以DPPH·清除活性做進(jìn)一步交互作用的研究。

2.3.2 交互作用產(chǎn)物DPPH·清除活性 由圖4可知，5 μg/mL土茯苓黃酮與2 mg/mL鰹魚(yú)蛋白肽的活性相當(dāng)，說(shuō)明黃酮的DPPH·清除活性明顯優(yōu)于多肽；在土茯苓黃酮質(zhì)量濃度小于9 μg/mL時(shí)，質(zhì)量濃度增加其與鰹魚(yú)蛋白肽交互作用后所得產(chǎn)物的活性顯著高于兩者所測(cè)得活性的數(shù)值總和（P<0.05），說(shuō)明交互作用有助于提高DPPH·清除活性。當(dāng)土茯苓黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到11 μg/mL時(shí)，交互作用后產(chǎn)物的活性與兩者所測(cè)得活性的數(shù)值總和之間無(wú)顯著性差異，原因是酚羥基在高質(zhì)量濃度下與肽鏈間的結(jié)合方式發(fā)生改變[20]，從而引起活性的變化。

圖3 交互作用后XOD抑制活性Fig.3 XOD inhibition activities of flavonoids-peptide complexes

2.3.3 交互作用產(chǎn)物抗氧化穩(wěn)定性 由圖5a可知，兩者交互作用后活性顯著升高（P<0.01），多肽、黃酮及交互作用產(chǎn)物在巴氏殺菌條件下相對(duì)穩(wěn)定，然而對(duì)高溫敏感，121℃加熱有助于提高多肽活性，而黃酮和交互作用產(chǎn)物高溫處理后活性顯著降低（P<0.05），這是因?yàn)楦邷厥苟嚯逆準(zhǔn)軣嵫诱?，?nèi)部疏水基團(tuán)暴露，活性增強(qiáng)，而黃酮中酚羥基可能被氧化，導(dǎo)致活性降低。

因此，普通巴氏殺菌不會(huì)影響產(chǎn)品的抗氧化活性，高溫長(zhǎng)時(shí)滅菌雖會(huì)影響產(chǎn)品抗氧化活性，但其活性仍處于較高水平。工業(yè)生產(chǎn)時(shí)，建議采用巴氏殺菌保持產(chǎn)品活性最高，為延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期也可采用高溫長(zhǎng)時(shí)滅菌。

圖4 交互作用后DPPH·清除活性Fig.4 DPPH·scanvenging activities of flavonoids-peptide complexes

由圖5b可知，交互作用后活性顯著升高（P<0.01），多肽對(duì)pH敏感，pH升高活性降低，在pH 6.5時(shí)活性顯著下降（P<0.05）；與此不同的是，黃酮和交互作用產(chǎn)物隨溫度變化活性先升后降，pH 6.0時(shí)活性最高，因此通過(guò)控制產(chǎn)品pH值為6.0使其抗氧化活性達(dá)到最高。

2.4 土茯苓黃酮提取物與鰹魚(yú)蛋白肽交互作用

按照1.3.8節(jié)方法分別測(cè)定了298 K和310 K條件下，土茯苓黃酮提取物（Flavonoids）對(duì)鰹魚(yú)蛋白肽（BPH）的熒光猝滅光譜如圖6所示。

由圖6b可知，鰹魚(yú)蛋白肽在350 nm波長(zhǎng)處熒光吸收光譜，且作為熒光供能體使圖6a中Tris-HCl吸收峰值增大，然而未改變其出峰位置和峰形。

圖5 溫度（a）和pH（b）對(duì)DPPH·清除活性的影響Fig.5 The influence of temperature（a）and pH（b）on DPPH· scavenging activity

由圖6c和6d可知，土茯苓黃酮在350 nm波長(zhǎng)處具有熒光吸收，說(shuō)明黃酮中含有少量蛋白，且在460 nm波長(zhǎng)處本身具有吸收峰；質(zhì)量濃度低于160 μg/mL時(shí)，熒光吸收強(qiáng)度與質(zhì)量濃度之間成劑量依賴關(guān)系，而質(zhì)量濃度為160 μg/mL時(shí)，350 nm波長(zhǎng)處的熒光吸收峰紅移且強(qiáng)度增大，原因可能是濃度升高，蛋白質(zhì)聚集或與黃酮類物質(zhì)形成聚合物，苯環(huán)上取代基發(fā)生變化導(dǎo)致吸收峰紅移。

由圖6e可知，在質(zhì)量濃度低于20 μg/mL時(shí)，黃酮對(duì)多肽的光猝滅效果不明顯；與此不同的是，質(zhì)量濃度高于40 μg/mL時(shí)猝滅效果顯著，且吸收峰紅移。蛋白質(zhì)和多肽在350 nm波長(zhǎng)處的熒光發(fā)射基團(tuán)主要是色氨酸[21]，低質(zhì)量濃度的黃酮能與多肽結(jié)合的分子數(shù)目少，當(dāng)其猝滅強(qiáng)度與提取物中蛋白質(zhì)熒光吸收強(qiáng)度相當(dāng)時(shí)，導(dǎo)致無(wú)熒光猝滅；高質(zhì)量濃度黃酮分子數(shù)目多，使其猝滅強(qiáng)度超過(guò)自身蛋白熒光吸收強(qiáng)度，且與多肽鏈的結(jié)合方式也有所不同，色氨酸中苯環(huán)的取代基基團(tuán)和位置變化，吸收峰紅移。

圖6 Tris-HCl熒光吸收光譜（a）；不同濃度鰹魚(yú)蛋白肽熒光吸收光譜（b）；土茯苓黃酮熒光吸收光譜（c）和（d）；交互作用產(chǎn)物熒光吸收光譜（e）和（f）Fig.6 The fluorescence absorption spectrum of Tris-HCl（a）；The fluorescence absorption spectrum of different concentrations of bonito protein peptide（b）；The fluorescence absorption spectrum of flavonoids（c）and flavonoids-peptide（e）and（f）

由圖6f可知，溫度變化并未引起交互作用產(chǎn)物吸收峰值和峰形的變化，因此黃酮對(duì)多肽的猝滅為靜態(tài)猝滅，說(shuō)明交互作用可能形成了新的復(fù)合物。結(jié)合氨基酸分析，多肽的脯氨酸可能與黃酮中的酚羥基通過(guò)氫鍵結(jié)合或與疏水性的芳香基團(tuán)產(chǎn)生疏水相互作用聚集，且交互作用在高溫下活性顯著降低，說(shuō)明土茯苓黃酮與鰹魚(yú)蛋白肽可能通過(guò)氫鍵結(jié)合成新產(chǎn)物。

3 結(jié)論

醇提土茯苓黃酮提取率及化學(xué)活性顯著高于水提土茯苓黃酮，木瓜蛋白酶酶解液蛋白質(zhì)回收率高且活性強(qiáng)。兩者交互作用后XOD抑制活性顯著升高（P<0.05），DPPH·清除活性出現(xiàn)協(xié)同增效效果。高溫121℃加熱20 min使交互作用產(chǎn)物DPPH·清除活性顯著降低（P<0.05），且 pH 6.0時(shí)其活性最佳。土茯苓黃酮對(duì)鰹魚(yú)蛋白肽具有顯著的靜態(tài)猝滅。熒光光譜法和氨基酸分析表明，土茯苓黃酮與鰹魚(yú)蛋白肽之間可能通過(guò)氫鍵形成了新的復(fù)合物，使其XOD抑制活性和DPPH·清除活性升高，這為中草藥與多肽復(fù)合產(chǎn)品的生產(chǎn)和研究提供了科學(xué)依據(jù)。