王婷婷　胡春宏　常蘋　季翔

摘 要：于晴朗的早春上午采取蘋果矮化砧木品種‘Bud9當年生頂芽作為外植體，通過消毒、萌芽、增殖、生根過程建立組織培養(yǎng)體系。試驗結果顯示最適宜‘Bud9組培苗增殖的培養(yǎng)基為改良MS（NH4NO3和KNO3減半）+6-BA（0.5mg/L）+KT（0.5mg/L）+GA3（1.0mg/L）+蔗糖（30g/L）+瓊脂（7g/L），增殖倍率可以達到3.23。增殖后的組培苗轉入生根培養(yǎng)基WPM+IBA（1.2mg/L）+蔗糖（20g/L）+瓊脂（7g/L）中進行生根培養(yǎng)，生根率可以達到95.14%。

關鍵詞：蘋果矮化砧木;Bud9;組織培養(yǎng)

中圖分類號：S661.1

文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20191015012

蘋果矮化砧木品種‘Bud9（Budagovsky 9或者B.9）是前蘇聯(lián)從M.8 x Red Standard（Krasnij Standart）雜交而來的一種新的矮化砧木，因其耐寒性而在俄羅斯中部平原的米徹林斯克學院發(fā)展起來。該品種葉子呈現(xiàn)出獨特的紅色，我國石家莊于1993年引進試種，‘Bud9砧木樹種體型相當于喬砧的45%，花期和果期較早，嫁接紅富士著色好[1]。

矮化密植是世界蘋果發(fā)展的趨勢和方向，現(xiàn)代農業(yè)果園通過種植矮化砧木，有利于果樹提早結果，增加產量，以及改善果實的品質[2-3]。通過將高產的接穗嫁接于矮化砧木來控制蘋果樹形的方法用于蘋果生產已經有2000多年的歷史，矮砧栽培在我國引入較早，但發(fā)展緩慢，目前我國矮砧栽培面積占總栽培面積的不足10%，矮化砧木具有廣泛的應用前景。

利用組織培養(yǎng)方式對蘋果砧木‘Bud9進行工廠化繁殖，可以不受季節(jié)限制在短時間內得到性狀一致長勢整齊的植株[4-5]。目前國內對于蘋果砧木品種‘Bud9組培體系建立的研究還處在空白階段。本試驗建立了系統(tǒng)高效的‘Bud9組培快繁體系，同時為之后進行的蘋果矮化砧木組培苗脫病毒試驗奠定基礎，在不遠的將來為國內市場提供大量的優(yōu)質脫病毒組培苗。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蘋果矮化砧木品種‘Bud9外植體采自于溫室盆中兩年生的扦插苗，在取材前需要對母本噴灑一定質量濃度的殺蟲殺菌劑以減輕消毒難度，同時需要對母本進行適當?shù)男藜羰┓室源龠M植株長勢[6]。試驗于2017年4月開始，試驗地點為江蘇省無錫市高科技農業(yè)示范園內的組培研發(fā)室。

于晴朗的早春上午，選取生長旺盛無病蟲害的母株作為母本，剪取枝條頂端2～3cm的帶頂芽莖段，去掉葉片后放入密封袋中保存。剪取外植體當天早上應停止?jié)菜?，防止因濕度太大造成的外植體污染。

1.2 外植體消毒

剪取的外植體首先在超凈工作臺上用75%酒精浸潤過的脫脂棉擦除表面灰塵，然后用20%的消毒試劑（市售漂白水，有效成分為次氯酸鈉）浸泡40min，使用無菌去離子水洗滌4～5次，直至水較為清澈為止，最后使用添加有300mg/L的抗壞血酸溶液浸泡3min左右，以最大程度的減輕外植體褐化現(xiàn)象。

1.3 組培體系的建立

1.3.1 不定芽萌發(fā)

消毒后的外植體在超凈工作臺上切去末端被消毒試劑腐蝕的部分，保留頂芽及其下部1節(jié)的外植體，接種到裝有MS+6-BA（0.7mg/L）+IBA（0.1mg/L）+ GA3（1.0mg/L）萌芽培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，每瓶一個頂芽。接種成功的培養(yǎng)瓶首先置于9 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)1d，之后的3d內將溫度逐漸提高至15 ℃，待植物適應培養(yǎng)基環(huán)境后轉入培養(yǎng)室中進行后續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2 不定芽增殖

采用2因素3水平的完全隨機試驗方法，研究不同植物生長調節(jié)劑配比對組培苗不定芽增殖的影響。所用的基礎培養(yǎng)基為改良MS（NH4NO3和KNO3減半）+ GA3（1.0mg/L）+蔗糖（30g/L）+瓊脂（7g/L），附加不同質量濃度的植物生長調節(jié)劑。所選用的植物生長調節(jié)劑為6-BA和KT，其中6-BA設置0.3mg/L、0.5mg/L、0.8mg/L3個水平，KT設置0、0.3mg/L、0.5mg/L3個水平。共設置9種試驗組合，每個試驗組為6個培養(yǎng)瓶，每個培養(yǎng)瓶放置16株苗，試驗設置3個重復。培養(yǎng)30d后統(tǒng)計增殖倍數(shù)以及增殖后苗叢的玻璃化程度。增殖倍數(shù)=有效苗（株高1cm以上，至少有2片葉子展開）個數(shù)/接種的組培苗個數(shù)。增殖后苗叢的玻璃化程度分為3個等級：1級，組培苗生長健壯，葉片開展，玻璃化苗控制在5%以下;2級，大部分組培苗生長正常，玻璃化苗比例在5%～20%之間;3級，組培苗嚴重玻璃化，玻璃化苗比例大于20%，葉片卷曲呈水漬狀，無法繼續(xù)生長。

1.3.3 生根誘導及移栽

繼代培養(yǎng)1個月左右，挑選株高2～3cm左右，生長健壯的組培苗進行生根誘導試驗，研究生長素濃度和基礎培養(yǎng)基對生根的影響。根誘導所用的生長素為IBA，其濃度設置為0.5、0.8、1.0、1.2、1.5mg/L共5個水平?；A培養(yǎng)基的選擇有MS，1/2MS（大量元素減半）以及WPM培養(yǎng)基3個水平。每個試驗組設置6個培養(yǎng)瓶，每個培養(yǎng)瓶內放置16株苗，試驗設置3個重復。培養(yǎng)30d后統(tǒng)計植株的生根率以及生根情況。生根率=（生根的組培苗數(shù)/接種的組培苗總數(shù)）×100%。

將生根后的組培苗進行煉苗移栽，煉苗的季節(jié)最好選擇在4—6月份。瓶苗首先在大棚條件下放置15d左右，逐漸擰開瓶蓋使瓶苗適應大棚內壞境。之后將組培苗從組培瓶中夾出，洗凈根部殘留的培養(yǎng)基，種植于泥炭土：蛭石=1：2的基質中。每天噴水3次，保持空氣濕潤。

1.4 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室內環(huán)境條件如下：光照強度為4000～6000Lx，光周期為16h/d，溫度保持在25±2℃左右。

1.5 試驗數(shù)據分析

利用SPSS軟件進行單因素方差分析，并采用Duncan法進行顯著性檢驗。

2 結論與分析

2.1 不定芽增殖

將萌發(fā)后的頂芽及側芽切去底部多余的外植體接種于增殖培養(yǎng)基中進行增殖，一般7～10d左右底部長出綠色圓形致密的愈傷組織，15d左右基部的腋芽開始萌發(fā)，30d左右萌發(fā)的腋芽長至2cm左右，可以轉入增殖培養(yǎng)基中進行重復增殖。

不同植物生長調節(jié)劑配比對組培苗不定芽增殖的影響結果見表1所示。

增殖結果顯示，隨著培養(yǎng)基中6-BA濃度的增加，不定芽的增殖倍數(shù)逐漸上升，最高可達3.58。同時增殖后組培苗的玻璃化程度也在逐漸增加，當6-BA的濃度增加到0.8mg/L的時候，無論KT濃度是多少，組培苗玻璃化程度都是3級。當6-BA濃度為0.3mg/L的時候，組培苗增殖倍數(shù)在2倍左右，且隨著培養(yǎng)基中KT濃度的增加，增殖倍數(shù)逐漸升高，組培苗生長健壯，玻璃化程度最低。當6-BA濃度為0.5mg/L的時候，同時在培養(yǎng)基中添加一定質量濃度的KT ，均可增加組培苗的玻璃化程度，同時增殖倍數(shù)也可以從2.01增加至3.23。綜合增殖倍數(shù)和組培苗玻璃化程度考慮，最適宜蘋果‘Bud9組培苗不定芽增殖的培養(yǎng)基為6號組別：MS（NH4NO3和KNO3減半）+ 6-BA（0.5mg/L）+ KT（0.5mg/L）+ GA3（1.0mg/L）+ 蔗糖（30g/L）+瓊脂（7g/L），在此培養(yǎng)基中培養(yǎng)的組培苗，其增殖倍數(shù)可以達到3.23，組培苗生長較為健壯，玻璃化程度為2級。

2.2 生根誘導

2.2.1 不同IBA質量濃度對蘋果‘Bud9組培苗生根的影響

不同IBA質量濃度對蘋果‘Bud9組培苗生根誘導的試驗結果表明，當培養(yǎng)基中IBA濃度小于等于1.2mg/L的時候，隨著培養(yǎng)基中IBA濃度的增加，組培苗的生根率也在逐漸增加。但是當培養(yǎng)基中IBA濃度上升到1.5mg/L的時候，組培苗的生根率不增反降（見表2）。因此，最適宜蘋果‘Bud9組培苗生根的IBA濃度為1.2mg/L。

2.2.2 不同基礎培養(yǎng)基對蘋果‘Bud9組培苗生根的影響

在培養(yǎng)基中IBA質量濃度為1.2mg/L的條件下，

3種基礎培養(yǎng)基中，WPM培養(yǎng)基最適宜‘Bud9組培苗生根，其生根率可以達到95.14，同時生根情況也最好，苗末端愈傷組織少，根數(shù)多，移栽成活率可以達到95%以上（見表2）。

綜上所述，蘋果組培苗‘Bud9最適宜的生根培養(yǎng)基為WPM+IBA（1.2mg/L）+蔗糖（20g/L）+瓊脂（7g/L）。

3 結論與討論

由于大部分蘋果苗都極其容易褐化，因此防止外植體在消毒過程中褐化是提高外植體消毒成功率的關鍵之處[7-9]。在外植體消毒的最后階段使用添加300mg/L的抗壞血酸溶液浸泡3min左右，并在外植體消毒后迅速低溫9℃貯藏3d可以最大程度的減輕外植體褐化現(xiàn)象。

在組培苗增殖試驗中發(fā)現(xiàn)，蘋果‘Bud9組培苗在增殖過程中非常容易發(fā)生玻璃化的現(xiàn)象，使用改良MS（NH4NO3和KNO3減半）培養(yǎng)基可以有效地減緩組培苗的玻璃化程度。不同質量濃度激素配比對于蘋果‘Bud9組培苗增殖影響的試驗結果表明，隨著培養(yǎng)基中6-BA濃度的增加，不定芽的增殖倍數(shù)也隨之升高，但是同時組培苗的玻璃化程度也在逐漸增加，叢生芽的玻璃化程度和培養(yǎng)基中細胞分裂素濃度呈正相關[10-11]。因此在選擇最佳增殖培養(yǎng)基的時候要綜合考慮增殖倍率和組培苗玻璃化程度2個因素。

生根培養(yǎng)結果表明，培養(yǎng)基中IBA濃度以及基礎培養(yǎng)基類型對組培苗生根影響很大。隨著IBA濃度的升高，組培苗的生根率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，同時組培苗底部的愈傷組織量也逐漸增加。這可能是因為高濃度的IBA會抑制組培苗根的發(fā)生，同時過多的愈傷組織會導致根松散易斷，后續(xù)的馴化移栽成活率降低。使用不同的基礎培養(yǎng)基進行生根誘導，結果顯示最適宜的生根培養(yǎng)基為WPM，這可能是由于WPM培養(yǎng)基中含有較低的無機鹽濃度，有利于根的形成[12]。

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作者簡介：

王婷婷（1989-），女，碩士。研究方向：木本植物組織培養(yǎng)。