汪陽忠，李 鋼，陶立奇，吳 達(dá)，劉百戰(zhàn)

上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，上海市楊浦區(qū)長陽路717 號 200082

煙堿及可替寧是常用的重要卷煙煙氣暴露標(biāo)志物［1-3］。準(zhǔn)確分析吸煙者體液或組織中的煙堿及可替寧含量對完善卷煙風(fēng)險評估技術(shù)非常重要［4-5］。吸煙者尿液中的煙堿及可替寧相較于血液來說取樣更為方便，因此，尿液是卷煙暴露標(biāo)志物研究中主要關(guān)注的生物基質(zhì)。目前檢測煙堿及可替寧的分析方法主要有LC-MS/MS［6-8］及GC/MS［9-11］。在檢測尿液時，一般利用市售固相富集（SPE）小柱進(jìn)行樣品前處理，但上樣及洗脫步驟操作較繁瑣，過程耗時較長，不利于樣品的批量分析。SBA-15 介孔材料具有比表面積高、主孔道尺寸均一、孔壁厚、水熱穩(wěn)定性較好等特點，自首次合成以來一直受到廣泛關(guān)注，在催化、吸附和分離、生物及納米材料等領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用前景［12-16］。

本研究中選擇孔徑在6～50 nm 范圍內(nèi)可以調(diào)變的SBA-15 介孔材料，在不同溫度下對其進(jìn)行100%水蒸氣焙燒改性，并將其作為煙堿及可替寧的固相富集材料；通過考察改性材料吸附性能及結(jié)構(gòu)剖析，明確改性SBA-15 介孔材料對煙堿及可替寧的吸附規(guī)律；在此基礎(chǔ)上，研究建立集吸附、熱脫附、進(jìn)樣、分析為一體的樣品在線分析聯(lián)用裝置，并建立相應(yīng)的在線熱脫附-GC/MS 方法，旨在為快速、在線檢測大批量吸煙者尿液樣品中的煙堿及可替寧提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

SBA-15 介孔材料（由上海市綠色化學(xué)與化工過程綠色化重點實驗室提供）。

煙堿、可替寧均為標(biāo)準(zhǔn)品（美國Cerilliant 公司）；二苯胺［17］（美國Sigma-Aldrich 公司）、甲醇（色譜純，德國Merck 公司）；實驗用水為二次去離子水；新鮮的吸煙和非吸煙志愿者尿液，收集后于4 ℃冰箱密封保存，24 h 內(nèi)進(jìn)行實驗。

7890-5977 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；煙堿及可替寧的在線富集及進(jìn)樣系統(tǒng)為自主搭建，其中六通閥最高使用溫度350 ℃（美國Valco 公司），另外包括卡頭、球閥不銹鋼管線等材料（美國Swagelok 公司）；XP404S 電子天平（感量：0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo 公司）；Ultima Ⅳ型X射線粉末衍射儀（配D-tex 檢測器，日本Rigaku 公司）；Auto 3B 型N2吸附比表面積測定儀（美國Quantachrome 公司）；SEM-4800 型高分辨掃描電鏡（日本Hitachi 公司）；DSX 300 型核磁共振波譜儀（美國Varian 公司）。

1.2 方法

1.2.1 改性SBA-15 介孔材料的合成與表征

按照文獻(xiàn)［18］的方法合成SBA-15 介孔材料，于550 ℃焙燒6 h 以去除模板劑；將新制備的SBA-15 樣品置于50 mL 蜂窩陶瓷杯中，在四段加熱管式爐中進(jìn)行100%水蒸氣焙燒（以下簡稱水焙）6 h，水流速為4 mL/min，選用400、500、600、700、800 ℃5 個水焙溫度，水焙處理后的SBA-15即為改性SBA-15。

使用X 射線粉末衍射儀對材料進(jìn)行XRD 表征：光源CuKα，2θ角0.5～5°，掃描步長0.01°，掃描速度1°/min，電壓35 kV，電流25 mA；使用N2吸附比表面積測定儀對材料進(jìn)行比表面積及孔隙度測試；使用高分辨掃描電鏡獲得材料的電子掃描照片；使用核磁共振波譜儀獲得材料的Si29固體核磁圖譜。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

準(zhǔn)確稱取煙堿及可替寧各10 mg，于10 mL 容量瓶中用甲醇定容；準(zhǔn)確移取上述溶液1 mL 于100 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。內(nèi)標(biāo)二苯胺配制在甲醇溶液中，質(zhì)量濃度為500 ng/mL，所有標(biāo)準(zhǔn)溶液均于4 ℃冷藏保存。分別準(zhǔn)確移取10 μg/mL 的儲備液0.01、0.02、0.05、0.10、0.50、1.00、20.00 mL 于100 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，充分搖勻，配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度為5 ng/mL。

1.2.3 樣品處理與分析

取尿液0.99 mL，加入10 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，振蕩離心后取上清液10 μL 直接進(jìn)樣分析。GC/MS 分析條件為：

色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣量：10 μL；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣：高純氦氣；流速：1 mL/min；升溫程序：初始溫度為140 ℃，保持1 min 后以5 ℃/min 升到160 ℃，保持1 min 后再以30 ℃/min 升到230 ℃，保持1 min；接口溫度：250 ℃；分析時間為30 min；分流比：3∶1；離子源：EI 源；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；檢測方式：選擇離子掃描，選用的煙堿及可替寧的定量離子（m/z）分別為84 和98。

標(biāo)樣及尿液中煙堿及可替寧的在線富集及檢測在圖1 所示的裝置中進(jìn)行。將100.0 mg SBA-15介孔材料裝填于外徑6 mm、內(nèi)徑4 mm 的不銹鋼管A 中，在兩端裝填適量去活化玻璃纖維，按示意圖連接裝置。設(shè)置輔助氣流速50 mL/min，恒溫杯D 溫度120 ℃，三通球閥C 為Vent 狀態(tài)；從進(jìn)料口B 注射標(biāo)液或待檢樣品10 μL，輔助氣吹掃2 min后，同時切換三通球閥C 和六通閥E 至色譜進(jìn)樣狀態(tài)；將恒溫杯升至250 ℃，啟動GC/MS 程序進(jìn)行樣品分析。

圖1 自動化在線熱脫附-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)原理圖Fig.1 Principle diagram of automatic thermal desorption-GC/MS system

2 結(jié)果與討論

2.1 煙堿及可替寧在改性前后SBA-15 上的吸脫附情況

按照1.2.3 節(jié)的氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用條件對煙堿及可替寧進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2 所示?？梢钥闯?，煙堿與可替寧的保留時間分別是4.59 和8.56 min。

圖2 煙堿及可替寧的TIC 圖Fig.2 TIC chromatogram of nicotine and cotinine

選用煙堿質(zhì)量濃度為2 000 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在自主搭建的在線裝置上，考察400、500、600、700、800 ℃下水焙前后的SBA-15 介孔材料對煙堿的吸附-熱脫附情況，結(jié)果如表1 所示。由表1 可知，在未改性SBA-15 介孔材料上，煙堿的檢出率（即絕對回收率，定義為實際檢出量與理論檢出量的百分比值，為與相對回收率區(qū)分，在此處以檢出率表示）僅為0.50%，說明未改性SBA-15 幾乎無法吸附煙堿。當(dāng)SBA-15 用100%水蒸氣焙燒處理后，煙堿的檢出率隨水焙溫度的升高而顯著增加。當(dāng)水焙溫度為700 ℃時，煙堿的檢出率最高，為78.62%，表明該改性材料對煙堿有較好的富集效果。當(dāng)水焙溫度高于700 ℃時，煙堿的檢出率降至44.62%，表明該改性材料對煙堿的富集效率較差。分析可知，煙堿檢出率的變化可能與SBA-15 在水焙過程中微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變有關(guān)。

表1 煙堿在改性SBA-15 上的脫附情況①Tab.1 Desorption result of nicotine on modified SBA-15

在相同條件下，可替寧的檢測結(jié)果如表2 所示。可以看出，未改性SBA-15 介孔材料無法吸附可替寧（可替寧未檢出）。當(dāng)SBA-15 用100%水蒸氣焙燒處理后，可替寧檢出率隨水焙溫度的升高顯著增大。當(dāng)水焙溫度為700 ℃時，可替寧檢出率最高，為62.62%，表明該改性材料對可替寧的富集效果最佳。當(dāng)水焙溫度高于700 ℃時，可替寧的檢出率降至36.62%。

表2 可替寧在改性SBA-15 上的脫附情況Tab.2 Desorption result of cotinine on modified SBA-15

綜上可知，水焙改性后的SBA-15 介孔材料可有效吸附煙堿與可替寧，且以700 ℃時100%水焙改性SBA-15 介孔材料的富集效率最高。

2.2 改性前后SBA-15 的結(jié)構(gòu)剖析

2.2.1 晶體衍射分析

圖3 不同改性溫度下的SBA-15 的XRD 譜Fig.3 XRD spectra of SBA-15 modified at different temperatures

剖析SBA-15 介孔材料尤其是700 ℃水焙改性SBA-15 介孔材料的結(jié)構(gòu)特征是揭示材料高效吸脫附煙堿及可替寧的關(guān)鍵。圖3 是水焙改性前后SBA-15 的XRD 譜。可以看出：未改性SBA-15 具有典型的六方介孔結(jié)構(gòu)特征；400 ℃水焙后的SBA-15 的衍射峰強度顯著增強，2θ角略向大角發(fā)生移動，表明400 ℃水焙改性增強了SBA-15 的介孔結(jié)構(gòu)；隨著水焙溫度從400 ℃升至700 ℃，SBA-15 的衍射峰強度略呈下降趨勢但其仍具有典型的六方介孔結(jié)構(gòu)特征；當(dāng)水焙溫度為800 ℃時，SBA-15 的衍射峰強度進(jìn)一步減弱，尤其110 和200 兩個晶面衍射峰彌散，表明800 ℃水焙改性后的SBA-15 的介孔結(jié)構(gòu)發(fā)生了部分塌陷。結(jié)合煙堿及可替寧的吸脫附情況可知，在700 ℃及以下溫度下進(jìn)行SBA-15 的水焙改性可以增強其介孔結(jié)構(gòu)，從而有利于煙堿及可替寧在SBA-15 上的吸脫附。

2.2.2 脫附性能分析

高溫水焙改性SBA-15 除具備常溫下吸附煙堿及可替寧的能力外，還具備高溫下能迅速脫附煙堿及可替寧的性質(zhì)。圖4 是水焙前后SBA-15 的N2物理吸附特性。圖4a 為吸附等溫線，未改性SBA-15 具有明顯的介孔特征滯后環(huán)，隨著水焙溫度的升高其滯后環(huán)逐漸向左移動，表明水焙改性導(dǎo)致SBA-15 晶胞收縮。從SBA-15 的孔徑分布圖（圖4c）可知，未改性SBA-15 和400 ℃水焙改性SBA-15 的最大孔徑為5.5 nm，隨著水焙溫度的升高，其最大孔徑降至4.8 nm，而800 ℃水焙樣品的最大孔徑降至3.5 nm，其強度也明顯減弱，表明其結(jié)構(gòu)被明顯破壞，這與XRD 的表征結(jié)果一致。t-plot 曲線（圖4b）顯示，未改性SBA-15 的微孔體積為0.082 2 cm3/g，隨著水焙溫度的增加，SBA-15的微孔體積呈明顯下降趨勢，700 ℃水焙SBA-15的微孔體積僅為0.0317 cm3/g，為改性前SBA-15 的38.6%，800 ℃水焙SBA-15 的微孔體積進(jìn)一步降至0.025 8 cm3/g。

圖4 水蒸氣焙燒前后SBA-15 的N2物理吸附情況Fig.4 Physical adsorption of SBA-15 to N2 before and after steam roasting

通常有機(jī)物在分子篩上的吸附行為主要發(fā)生在微孔和介孔孔道表面，微孔的孔道主要在1 nm以下，與有機(jī)分子的尺寸相差不大。有機(jī)分子吸附在這些微孔中難以脫附。介孔的孔道在2～50 nm，這些孔道遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了一般有機(jī)分子的尺寸，因此吸附在介孔孔道內(nèi)的分子較容易脫附。盡管SBA-15為介孔分子篩，但在未改性SBA-15 中仍存在少量微孔結(jié)構(gòu)，這些微孔主要存在于介孔的孔口處，導(dǎo)致吸附的有機(jī)分子不能自由地進(jìn)出介孔孔道。煙堿、可替寧分子被SBA-15 介孔孔道吸附后，即使在較高溫度下也不能及時脫附，這是煙堿、可替寧在未改性SBA-15 上的檢出率較低的根本原因。

高溫下水蒸氣改性SBA-15 可使其微孔數(shù)量明顯減少，由于改性處理解決了SBA-15 介孔孔口的瓶頸問題，使有機(jī)分子在低溫下可以順利地進(jìn)入介孔孔道，而在高溫下又能從介孔孔道中脫附，因此明顯提高了煙堿及可替寧的檢出率。但是，800 ℃水焙SBA-15 的介孔結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，其吸脫附煙堿及可替寧的能力明顯下降。綜上可知，700 ℃是SBA-15 改性的最佳水焙溫度。

2.2.3 掃描電鏡及固體核磁分析

SEM 圖（圖5）顯示，在未改性SBA-15 樣品表面上存在大量10～300 nm 不規(guī)則無孔硅納米粒子，改性后（如700 ℃下水焙后）絕大多數(shù)無孔硅納米粒子消失，表面變得較規(guī)整。這些表面硅納米粒子可能參與了SBA-15 內(nèi)壁去除微孔的過程，從而提高了SBA-15 吸附脫附煙堿及可替寧的能力。29Si 的固體核磁表征結(jié)果也證實了水焙改性后SBA-15 微孔數(shù)量的減少。如圖6 所示，700 ℃水焙后，Q4的含量從74.2%增至84.7%。

圖5 水蒸氣焙燒前后SBA-15 的SEM 照片F(xiàn)ig.5 SEM pictures of SBA-15 before and after steam roasting

圖6 水蒸氣焙燒前后SBA-15 的29Si 固體NMR 譜Fig.6 29Si solid state NMR spectra of SBA-15 before and after steam roasting

2.3 方法學(xué)考察及樣品分析

采用700 ℃水焙6 h 后改性SBA-15 介孔材料為吸脫附劑，在線分析煙堿及可替寧。將配制的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液從低到高依次進(jìn)樣，建立回歸方程，其R2分別為0.999 8 到0.999 7，表明工作曲線的線性關(guān)系良好。以3 倍信噪比（3 S/N）時的進(jìn)樣濃度為檢測限（LOD），結(jié)果表明，煙堿及可替寧的檢測限分別為0.5 和0.4 ng/mL。在經(jīng)過處理的空白尿液樣本中加入低、中、高3 個水平的煙堿及可替寧。加入量分別為10、100、200 ng，每個水平重復(fù)6 次。分別計算回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果表明，方法平均回收率為97.28%～104.55%，RSD 為0.25%～3.18%（表3）?？梢?，本方法結(jié)果準(zhǔn)確，可以滿足定量分析要求。

采用本方法對吸煙及非吸煙志愿者尿液中的煙堿及可替寧進(jìn)行了測定，結(jié)果表明，非吸煙者尿液中煙堿與可替寧含量均小于5 ng/mL，而吸煙者尿液中煙堿與可替寧含量分別為259～1 315 和119～532 ng/mL，與文獻(xiàn)［6，19］報道的檢測結(jié)果相當(dāng)。

3 結(jié)論

以水蒸氣焙燒改性后的SBA-15 為固相富集材料，通過結(jié)構(gòu)剖析闡明了改性SBA-15 介孔材料對煙堿及可替寧的吸脫附性能。自主設(shè)計了一種集吸附、熱脫附、進(jìn)樣、分析為一體的實驗裝置，并基于該裝置建立了一種分析吸煙者尿液中煙堿及可替寧含量的在線熱脫附-GC/MS 方法。700 ℃下水蒸氣焙燒6 h 的SBA-15 的煙堿及可替寧熱脫附能力較強。煙堿及可替寧在1～2 000 ng/mL 范圍內(nèi)工作曲線的線性較好（R2≥0.999 5），方法回收率為97.28%～104.55%，RSD 為0.25%～3.18%，檢測限分別為0.5 和0.4 ng/mL。該方法無須使用溶劑洗脫，便捷、高效、快速，適用于吸煙者尿液中煙堿及可替寧的在線分析。