腦出血是目前常見的腦血管疾病，具有起病急、發(fā)展迅速、致死率高的特點，是嚴(yán)重危害中老年人健康的疾病之一。在腦出血的發(fā)病過程中，顱內(nèi)血腫、腦水腫是病人神經(jīng)功能障礙的主要原因；而出血后繼發(fā)性局部炎癥反應(yīng)、血腦屏障通透性的增加，可能是腦組織水腫加重的主要原因。本課題分析炎癥指標(biāo)及血腦屏障通透性的變化，探討Toll樣受體4(TLR4)在腦出血后繼發(fā)炎癥損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 檸檬酸組織抗原修復(fù)液(福州邁新生物技術(shù)有限公司)，DAB顯色試劑盒(中杉金橋公司)，羊抗兔多克隆抗體(福州邁新生物技術(shù)有限公司)，兔抗-TLR4多克隆抗體(博士德公司)，膠原酶Ⅶ(購自Sigma公司)。動物頭顱立體定位儀(SN-2，NARISHIGE，日本)，微量進(jìn)樣器(中國醫(yī)藥集團(tuán)沈陽中沈化玻有限公司)，電子分析天平(BP2llD，塞多利斯，德國)，紫外分光光度儀(UV300，Spechonic Unicam，美國)，組織勻漿機(jī)(UP200s，DR Hielscher，德國)，高溫干燥箱(FD53，Binder，德國)，恒溫水浴箱(1070，F(xiàn)EL，德國)。

1.2 動物分組 由山東大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)2014-0007。SPF級SD雄性大鼠30只(體重250～300 g)，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組，每組15只。

1.3 模型制備 以10%水合氯醛腹腔麻醉。將大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，將頭皮丁字型切開，取前囟為中心點，向右3 mm、向后5.5 mm、深度5.5 mm為注射點(尾殼核)，骨鉆鉆一1 mm小孔，進(jìn)針后緩慢注射膠原酶、肝素、生理鹽水混合液2.0 μL(每1 μL溶液含Ⅳ型膠原酶0.2 U及肝素2 U)，留針5 min后，將針緩慢退出。骨蠟封閉鉆孔，縫合頭皮。假手術(shù)組以等量生理鹽水代替膠原酶混合液。

1.4 神經(jīng)功能缺損評分標(biāo)準(zhǔn) 腦出血模型復(fù)制后12 h、1 d、3 d、7 d參照Zea Longa評定[1]進(jìn)行神經(jīng)功能評分。0分：無神經(jīng)功能缺失癥狀，活動正常；1分：不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：爬行時出現(xiàn)向右轉(zhuǎn)圈；3分：行走時，身體向偏癱側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失；5分：死亡。選取評分0～4分大鼠。

1.5 TLR4免疫組化、腦組織病理檢測 在各時間點將每組4只大鼠麻醉后斷頭取腦，放入4%多聚甲醛溶液中外固定2周，隨后脫水、石蠟包埋，制成4 μm厚度的冠狀面石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化處理后，分別進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE) 染色和免疫組化染色。TLR4的免疫組化：采用免疫組化二步法，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，選取每張切片血腫周圍5個不重疊高倍視野，顯微鏡下觀察血腫周圍腦組織TLR4蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)情況。采用累積光密度(IOD)總和值來反映切片陽性染色細(xì)胞數(shù)目。腦組織病理：石蠟切片，HE染色，常規(guī)脫蠟水化后蘇木素染色10 min，自來水沖洗2 min，鹽酸乙醇分化10 s，自來水返藍(lán)10 min，伊紅染色5 min，自來水沖洗30 s，蒸餾水沖洗30 s，90%乙醇30 s，95%乙醇2 min×2次，100%乙醇2 min×2次，二甲苯5 min×2次，中性樹膠封片。光鏡下觀察血腫周圍腦組織變化。

1.6 血腦屏障通透性測定 按Belayev法[2]在各時間點將各組4只大鼠麻醉后斷頭取腦前的2 h，從股靜脈注入2%的伊文思蘭(evens blue，EB)溶液(20 mg/kg)；選取大鼠出血側(cè)腦組織稱重后，放入試管中，加甲酰胺3 mL，放入54 ℃水浴箱中避光提取24 h，然后在紫外分光光度計下測量提取液的光密度值(OD值)，波長632 nm，腦組織EB含量以O(shè)D濕腦組織量(g)表示。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較(見表1)

表1 各組大鼠不同時點神經(jīng)功能缺損評分比較(±s) 分

與假手術(shù)組比較，1)P<0.05

2.2 各組大鼠血腦屏障通透性比較(見表2)

表2 各組大鼠不同時點EB含量比較(±s) mg/g

與假手術(shù)組比較，1)P<0.05

2.3 各組大鼠TLR4免疫組化比較(見表3)

表3 各組大鼠不同時點腦組織TLR4表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s) 個

與假手術(shù)組同期比較，1)P<0.05；與本組3 d時比較，2)P<0.05

2.4 各組大鼠腦組織病理切片分析 假手術(shù)組大鼠腦組織內(nèi)無出血灶，尾狀核區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)致密，整齊排列，無水腫及炎細(xì)胞浸潤。模型組大鼠腦組織尾狀核區(qū)有出血灶，血腫周圍水腫、大量紅細(xì)胞、炎細(xì)胞浸潤，神經(jīng)元壞死。詳見圖1。

3 討 論

近年來，隨著對腦出血損傷機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)腦組織并非完全是免疫豁免區(qū)，腦出血后腦組織同樣會產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[3]。非感染性炎癥、氧自由基的產(chǎn)生及炎癥介質(zhì)的釋放是腦出血損傷的重要機(jī)制，其中TLR4在非感染性炎癥損傷中發(fā)揮著重要作用[4]，炎性因子TLR4是最早發(fā)現(xiàn)的人類Toll樣受體，在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中起重要作用，屬于跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體和天然免疫系統(tǒng)主要的病原模式識別受體，主要表達(dá)于樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面[5]。現(xiàn)有資料表明：TLR4與中樞非感染性炎癥的關(guān)系最為密切[6-8]。而血腦屏障是存在于腦組織和血液之間的一個復(fù)雜的細(xì)胞系統(tǒng)，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整和細(xì)胞間的緊密連接是血腦屏障結(jié)構(gòu)與功能得以維持的基礎(chǔ)。研究表明，腦出血發(fā)病早期，有活化的小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤，大量中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集在血腫周圍，釋放各種炎性因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)，在腦水腫形成過程中發(fā)揮重要作用[6]；同時炎癥反應(yīng)也導(dǎo)致血腦屏障通透性增加，大量水溶性物質(zhì)進(jìn)入腦組織，可導(dǎo)致腦水腫、顱內(nèi)壓增高甚至腦疝形成等一系列嚴(yán)重結(jié)果。

本實驗結(jié)果顯示：模型組腦組織病理示尾狀核區(qū)有出血灶，血腫周圍存在水腫、大量紅細(xì)胞、炎細(xì)胞浸潤，神經(jīng)元壞死等，說明模型組腦組織受損嚴(yán)重，病理形態(tài)發(fā)生改變。神經(jīng)功能缺損評分隨著時間的延續(xù)，模型組各時間點評分均高于假手術(shù)組，并且各時間點TLR4蛋白陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，模型組3 d時TLR4蛋白表達(dá)量明顯高于其他時間點，差異有統(tǒng)計意義(P<0.05)，顯示隨著時間的推移，模型組TLR4表達(dá)升高，在3 d時達(dá)到了最高峰。腦組織內(nèi)EB含量在出血后12 h即迅速上升，3 d之后緩慢下降，表明腦出血后血腦屏障的完整性受到破壞，通透性增加，其演變過程與TLR4表達(dá)過程基本一致。

綜上所述，大鼠腦出血后炎性因子TLR4蛋白表達(dá)上調(diào)可能加重了血腫周圍腦組織損傷，使血腦屏障通透性增加，加重腦水腫，升高神經(jīng)功能缺損評分，因此在治療腦出血過程中，加用抑制TLR4表達(dá)的藥物，有助于腦出血的治療。