腎虛質(zhì)是常見的中醫(yī)體質(zhì)類型之一，是以腎的臟腑功能低下為主要特征的一種體質(zhì)狀態(tài)，又可分為腎陰虛、腎陽虛、腎氣虛、腎精虛等[1]。早在秦漢時(shí)期，醫(yī)家就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腎與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系。《黃帝內(nèi)經(jīng)》總結(jié)道“腎藏精舍志，主骨、生髓、通腦?！泵鞔_指出腦與腎密切的相對應(yīng)關(guān)系；《靈樞調(diào)經(jīng)論》曰：“血并于上，氣并于下，亂而善忘”；陳士鐸曰：“補(bǔ)腦必須添精，而添精必須滋腎”《醫(yī)林改錯》曰：“年高腎虧，髓?？仗?，發(fā)為呆病”“小兒無記憶者，腦髓未滿；年高無記憶者，腦髓漸空”，腎虛髓空是學(xué)習(xí)記憶減退的重要病機(jī)[2]，故補(bǔ)腎填精髓是其基本治則。汪昂說：“人之精與志皆藏于腎，腎精不足則志氣不能上通于心，故迷惑善忘也”，提出了記憶與腎精的互化關(guān)系。李偉茜等[3]認(rèn)為靈機(jī)記憶皆出于腦，腦為髓海，精髓是腦生理活動的物質(zhì)基礎(chǔ)。任晨斌等[4]認(rèn)為補(bǔ)腎填精髓是治療記憶衰退的基本治則。王建偉等[5]認(rèn)為治療記憶衰退類疾病應(yīng)益腎化濁，除邪同時(shí)重點(diǎn)補(bǔ)腎生髓。歷代醫(yī)家無論從理論探討，還是臨床實(shí)踐方面，均認(rèn)為腎虛的一個(gè)重要表現(xiàn)是學(xué)習(xí)記憶能力的下降，且現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，海馬體(海馬回)具有對大腦學(xué)習(xí)記憶所要求的信息獲取有關(guān)的重要腦區(qū)功能，對記憶的形成及定向功能有明確作用[6]。馬書娟等[7]、康湘萍等[8]認(rèn)為補(bǔ)血方藥可以通過降低海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善海馬功能，提高學(xué)習(xí)記憶能力。探討補(bǔ)腎藥物對海馬區(qū)MEK表達(dá)的影響，對于認(rèn)識與預(yù)防因腎虛而至記憶衰退及老年癡呆具有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義[9]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級健康12周齡SD大鼠合籠隨即交配子代鼠，雌雄按1∶1比例共40只，體重260～280 g，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：SCXK(陜)2012-003。標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，不限其飲食飲水，在室溫22～26 ℃，相對濕度50%～70%環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 動物造模 將購回的大鼠雌、雄分別飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按雌、雄1∶1的比例隨機(jī)分組并合籠。其中，空白組4只，模型組12只。兩組大鼠雌、雄合籠5 d，各雌鼠成功受孕后，將兩組大鼠雌、雄分別飼養(yǎng)。自此對模型組孕鼠進(jìn)行恐嚇直至其產(chǎn)子。具體方法為：每日08：30～20：30，將模型組孕鼠放置在土貓活動范圍之內(nèi)，土貓可在鼠籠上自由活動，孕鼠可視及土貓形態(tài)，聞及土貓叫聲，嗅及土貓氣味，以此對孕鼠進(jìn)行恐嚇?？瞻捉M孕鼠不做任何處理，自由飲食飲水，至其自然生產(chǎn)。不對其恐嚇時(shí)，將兩組孕鼠置于同處，以確保非處理因素的一致性。

1.3 子代鼠分組 從空白對照組母鼠所產(chǎn)仔鼠中隨機(jī)選出10只，作為空白對照組，不做任何處理，自由飲食飲水。模型組孕鼠產(chǎn)子后，仔鼠隨母鼠飼養(yǎng)28 d，其間停止對其恐嚇，以防仔鼠夭折。28 d后，將模型組母鼠所產(chǎn)仔鼠放置一處，隨機(jī)選出30只分為3組，每組10只，分別為左歸丸組、右歸丸組、腎虛質(zhì)模型組。依照前法，每日08：30～20：30對左歸丸組、右歸丸組、腎虛質(zhì)模型組進(jìn)行恐嚇，連續(xù)1個(gè)月。其余時(shí)間將4組子代鼠置于同處，以確保其他非處理因素一致。

1.4 實(shí)驗(yàn)藥物

1.4.1 藥物組成 左歸丸組方：熟地、山萸肉、炒山藥、枸杞子、菟絲子、川牛膝、鹿角膠、龜板膠。右歸丸組方：熟地、炒山藥、枸杞子、肉桂、山萸肉、鹿角膠、當(dāng)歸、菟絲子、炒杜仲、制附子。生理鹽水自行配制。

1.4.2 藥物制備 兩方均按原方藥量配制，中藥飲片均購自陜西中醫(yī)藥大學(xué)校醫(yī)院中藥房，將藥材浸泡于6倍藥材量的冷水中15 min，先用武火煎至水沸，后改用文火煎煮40 min，濾出藥液后加入適量冷水，仍由武火煎至水沸，后改用文火煎30 min，濾出藥液，兩煎合并，右歸丸濃縮藥汁至150 mL，左歸丸濃縮藥汁至130 mL，待藥液冷卻后，裝瓶封存，-20℃凍存?zhèn)溆?。生理鹽水：用精密天平稱取0.9 g氯化鈉加入50 mL蒸餾水中混勻，定容至100 mL，制備成0.9%氯化鈉溶液，貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 給藥劑量 在對子代鼠進(jìn)行恐嚇的同時(shí)，空白對照組和腎虛質(zhì)模型組均給予生理鹽水灌胃。中藥組分別給予左歸丸、右歸丸濃縮液灌胃。根據(jù)人與大鼠劑量轉(zhuǎn)換公式計(jì)算大鼠的等效計(jì)量是人的6.3倍。即子代鼠灌胃右歸丸1.575 g/100 (g·d)，左歸丸1.323 g/100(g·d)。

1.5 實(shí)驗(yàn)試劑 MEK(Elisa)試劑盒由艾來薩生物科技有限公司生產(chǎn)；總蛋白提取試劑盒由西安赫德生物有限公司生產(chǎn)；BCA蛋白定量試劑盒由西安赫德生物有限公司生產(chǎn)。

1.6 儀器及耗材 移液器由德國艾本德公司生產(chǎn)；離心管由方科醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；錫箔紙由雷東日用品廠生產(chǎn)；液氮由西安赫德生物有限公司生產(chǎn)；制冰機(jī)(型號CL-300W)由上海芩隆奧利斯公司生產(chǎn)；高速組織勻漿機(jī)由艾卡儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；低溫離心機(jī)由恒諾儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；生化恒溫孵育箱由恩培儀器制造有限公司生產(chǎn)；全自動酶標(biāo)儀(型號DNM-9606)由普朗公司產(chǎn)生。

1.7 溶液配制 7%水合氯醛溶液：用精密天平稱取7 g水合氯醛加入50 mL蒸餾水中混勻，定容至100 mL。0.9%氯化鈉溶液：用精密天平稱取9 g氯化鈉加入500 mL蒸餾水中混勻，定容至1 000 mL。

1.8 實(shí)驗(yàn)動物組織取材 取材前對實(shí)驗(yàn)動物禁食12 h，以確保麻醉藥量的準(zhǔn)確性，避免取材過程中動物排泄物污染組織及操作臺。各組中隨機(jī)取出雌雄各10只，逐個(gè)稱重、標(biāo)記，根據(jù)其體重，按照每0.5 mL/100 g體重的藥量，腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后，快速斷頭取腦，將腦組織包入標(biāo)記好的錫箔紙中，迅速投入液氮盒內(nèi)。取材完畢后，用長鑷子將所有組織從液氮盒內(nèi)取出，貯存于-80 ℃冰箱中備用，取組織時(shí)應(yīng)做好防護(hù)措施，避免凍傷。

1.9 操作步驟

1.9.1 提蛋白 將腦組織從-80 ℃冰箱中取出，用精密天平稱取100 mg，用組織剪將稱取的組織剪成細(xì)小的碎片，放入4 mL 離心管中，以每20 mg組織加入200 μL 裂解液的比例，在4 mL離心管中加入裂解液，用手持式勻漿機(jī)勻漿，勻漿4～6次，每次10 s，勻漿時(shí)上下提插，但要保證勻漿機(jī)轉(zhuǎn)頭在液面以下，直至無肉眼可見殘?jiān)?；將無泡沫層的組織混懸液轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，冰上孵育30 min，其間每10 min震蕩混勻1次；離心機(jī)4 ℃預(yù)冷30 min后，將組織混懸液置于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)低溫離心機(jī)中，溫度4 ℃，14 000 r/min，離心10 min，收取上清液按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分裝完好，置于-80 ℃冰箱環(huán)境保存。為避免蛋白快速降解，以上所有操作均在冰上進(jìn)行。

1.9.2 BCA蛋白定量 所有試劑室溫放置20 min。準(zhǔn)備好BCA工作液，每孔中200 μL BCA工作液，根據(jù)樣本數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)孔數(shù)目計(jì)算所需要的BCA工作液的總體積；然后將50份A液加入1份B液混合后得到工作液(若看見渾濁，輕度晃動可消失)。取10 μL濃度為5 mg/mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水稀釋至100 μL，使其最終濃度為0.5 mg/mL。在96孔板中分別加入0 μL、1 μL、2 μL、4 μL、8 μL、16 μL、20 μL濃度為0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品，加蒸餾水將溶液補(bǔ)至20 μL。在96孔板中加入20 μL已被稀釋20倍的樣品；標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔各加入200 μL BCA工作液，放生化培養(yǎng)箱37 ℃孵育30 min。使用酶標(biāo)儀在562 nm處測其吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測出濃度。用超純水調(diào)定蛋白濃度，蛋白樣品最終濃度為0.85 μg/μL。

1.9.3 酶聯(lián)免疫吸附測定MEK濃度 所有試劑室溫放置20 min，從鋁箔袋中取出需要的酶標(biāo)板板條，根據(jù)需要量配置洗滌液；在紙上布板，確定好標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔的位置；依據(jù)布板順序，在酶標(biāo)板標(biāo)準(zhǔn)品孔中各加不同濃度(S0-S5)的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；樣品孔中加入10 μL樣品，再用樣品稀釋液定容至50 μL；空白孔不需要加；每孔各中加入100 μL用辣根過氧化酶標(biāo)記過的檢測抗體，用封板膜封住，防止污染，放置生化培養(yǎng)箱中37 ℃孵育60 min。倒掉板中液體，在吸水紙上拍干，每孔中加入400 μL的洗滌液，靜置1 min后倒掉洗滌液，再拍干，重復(fù)洗5次。每孔中加入A、B兩種底物各50 μL，用封板膜封住，再用鋁箔紙包好，避光，放置生化培養(yǎng)箱中37 ℃孵育15 min。最后，每孔中各加入50 μL的終止液，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔的吸光度值(從孵育結(jié)束到開始讀板要在15 min內(nèi)完成)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度。

2 結(jié) 果

2.1 各組仔鼠一般情況觀察 腎虛質(zhì)模型組較其他各組出現(xiàn)情緒低沉、懶散萎靡、食量降低、體重偏輕、生長發(fā)育遲緩、毛發(fā)稀疏松弛、大便質(zhì)軟或不成形、小便頻多等一系列符合中醫(yī)腎虛體質(zhì)臨床特點(diǎn)的現(xiàn)象。

2.2 各組海馬MEK蛋白表達(dá)比較 與空白對照組比較，腎虛質(zhì)模型組MEK蛋白含量降低(P<0.01)，與腎虛質(zhì)模型組比較，左歸丸組、右歸丸組MEK蛋白含量明顯升高(P<0.05)，左歸丸組和右歸丸組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

組別只數(shù)MEK空白對照組1064.112±7.7652)腎虛質(zhì)模型組1050.500±6.408 左歸丸組1056.517±7.7911)右歸丸組1055.427±4.5631)

與腎虛質(zhì)模型組比較，1)P<0.05，2)P<0.01

3 討 論

記憶力減退屬中醫(yī)學(xué)“善忘”“健忘”“喜忘”等范疇，其病位在腦[10]。腎精，是對腎收藏的精微物質(zhì)的總稱。從經(jīng)絡(luò)學(xué)說來看，足太陽膀胱經(jīng)“從巔入腦”，腎與腦通過經(jīng)絡(luò)相連，并在功能上相互協(xié)作，密不可分。腦為髓海，腎為精之府，精水充足則化髓，腦髓足，則神充；反之，腎水匱乏，腦失所養(yǎng)，則神衰健忘[11]。且腎中所藏之精在內(nèi)為人體生骨、化髓、充腦，在外表現(xiàn)為志、作強(qiáng)、主伎巧的功能[12]。而志的主要含義之一就是記憶[13]。

因?yàn)檠a(bǔ)腎中藥對腦有很好的保護(hù)作用[14]，并可以通過調(diào)控某些基因的表達(dá)來發(fā)揮改善腎虛質(zhì)的作用[15]。有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，用補(bǔ)腎藥治療腎虛并發(fā)腦缺血動物后，記憶力顯著提高[16]。劉書考[17]研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎方藥可通過下調(diào)環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白的含量，抑制長時(shí)程記憶的形成。本實(shí)驗(yàn)選取常用藥物左歸丸、右歸丸進(jìn)行治療觀察，左歸丸為壯水之劑，滋腎補(bǔ)陰，臨床用于治療真陰不足者，表現(xiàn)多為腰酸膝軟，盜汗，神?？谠?；右歸丸為益火之劑，溫補(bǔ)腎陽，填精止遺，臨床用于治療腎陽不足，命門火衰者，表現(xiàn)多為腰膝酸冷，怯寒畏冷，陽痿遺精，精神不振。腎虛體質(zhì)主要表現(xiàn)為腎精虧虛，腎精所產(chǎn)生的生理效應(yīng)有腎陰、腎陽兩方面，故本實(shí)驗(yàn)設(shè)有左歸丸、右歸丸兩個(gè)組別分別進(jìn)行研究。

本實(shí)驗(yàn)采用“貓嚇鼠”經(jīng)典方法造模[18]，觀察各組仔鼠一般情況發(fā)現(xiàn)，腎虛質(zhì)模型組較其他各組出現(xiàn)情緒低沉、懶散萎靡、食量降低[19]、體重偏輕、生長發(fā)育遲緩、毛發(fā)稀疏松弛、大便質(zhì)軟或不成形、小便頻多等一系列符合中醫(yī)腎虛體質(zhì)臨床特點(diǎn)的現(xiàn)象[20]，且通過斷頭取腦及酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法發(fā)現(xiàn)腎虛質(zhì)大鼠MEK表達(dá)明顯低于左歸丸組、右歸丸組與空白對照組，說明腎虛質(zhì)記憶學(xué)習(xí)能力與MEK表達(dá)有密切關(guān)系。腎虛模型大鼠經(jīng)過左歸丸、右歸丸治療后，MEK表達(dá)明顯上升，但左歸丸組與右歸丸組比較治療MEK蛋白差異不明顯，說明補(bǔ)腎方劑可以上調(diào)腎虛質(zhì)大鼠海馬MEK蛋白異常表達(dá)，也證明補(bǔ)腎藥物可以通過上調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的MEK表達(dá)，改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。