許亞平　周劍宇　黃珍　李瑾　陳琪　肖春瑩

[摘要] 目的 研究鼻咽癌（NPC）患者頸部淋巴結在放療前后的超聲變化規(guī)律，探討PD-1在NPC患者治療過程中的作用及單克隆抗體在放射治療NPC中的應用。 方法 通過免疫組織化學染色技術判斷PD-1的表達，分析NPC組織中PD-1表達與臨床病理參數的關系。分別對PD-1表達陰性和陽性的NPC患者應用彩色多普勒超聲檢查，同時對普通放療組（對照組）和加入單克隆抗體治療組（實驗組）在放療前后的頸部淋巴結轉移灶的長徑（L）、短徑（S）、長徑/短徑（L/S）、收縮期峰值流速（PSV）、阻力指數（RI）、血流強度進行對比觀察。 結果 PD-1陰性患者及陽性患者的實驗組和對照組的L、S、PSV和RI指標在放療4周后均呈現下降趨勢，而L/S則呈現升高趨勢;治療4周后PD-1陽性患者的實驗組各項超聲指標較對照組變化程度明顯增加;血流強度檢測中，PD-1陽性患者的實驗組在治療4周后實驗組0級較對照組比例高，而Ⅱ級較對照組比例小。 結論 PD-1在NPC治療過程中起著重要的作用，傳統放射治療方法加入單克隆抗體后可以有效提高療效。

[關鍵詞] 鼻咽癌;多普勒超聲檢查;程序性死亡受體-1;單克隆抗體

[中圖分類號] R739.63;R445.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）23-0039-05

[Abstract] Objective To investigate the ultrasound changes of cervical lymph nodes in patients with nasopharyngeal carcinoma（NPC） before and after radiotherapy， and to explore the role of PD-1 in the treatment of NPC patients and the application of monoclonal antibodies in radiotherapy of NPC. Methods The expression of PD-1 was determined by immunohistochemical staining technique， and the relationship between PD-1 expression and clinicopathological parameters in NPC tissues was analyzed. Color Doppler ultrasonography was performed on NPC patients with negative and positive PD-1 expression， and the long diameter （L）， short diameter （S）， long diameter/short diameter （L/S）， peak systolic velocity （PSV）， resistance index （RI）， and blood flow intensity of the cervical lymph node metastases before and after radiotherapy were compared between the general radiotherapy group （control group） and the monoclonal antibody-treated group （experimental group）. Results The L， S， PSV and RI indexes of PD-1 negative patients and PD-1 positive patients in the experimental group and the control group all showed a downward trend after 4 weeks of radiotherapy， while L/S showed an increasing trend. After 4 weeks of treatment， the ultrasound indexes of the PD-1 positive patients in the experimental group were significantly increased compared with those of the control group. In the blood flow intensity test， the proportion of grade 0 in the experimental group of PD-1 positive patients was higher than that in the control group after 4 weeks of treatment， and the proportion of grade Ⅱ was lower than that of the control group. Conclusion PD-1 plays an important role in the treatment of NPC. The efficacy of traditional radiotherapy can be effectively improved after adding monoclonal antibodies.

[Key words] Nasopharyngeal carcinoma; Doppler ultrasonography; Programmed death receptor-1; Monoclonal antibody

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國最常見的惡性腫瘤之一[1]，其中多數患者發(fā)生頸部淋巴結轉移，在NPC的診治過程中，NPC的頸部淋巴結轉移在NPC臨床分期的判斷、治療方案的制定以及預后評價中起著非常重要的作用[2]。

程序性死亡受體-1（programmed death receptor-1，PD-1）及其配體（PD-L1）是目前腫瘤免疫治療的方向之一[3]。PD-1主要在活化T淋巴細胞的細胞膜上表達，在腫瘤細胞表面亦有表達，PD-L1主要在腫瘤細胞的細胞膜上表達，在樹突狀細胞和巨噬細胞表面亦有表達，PD-1和PD-L1結合可抑制T細胞的活化與增殖，導致腫瘤免疫抑制和免疫逃逸[4]。

目前，包括 BMS-936559等多種針對 PD-L1/PD-1通路阻斷的單克隆抗體用于進展期惡性腫瘤的臨床試驗都在進行當中[5，6]。BMS-936559 是一種高親和力抗人PD-L1單克隆抗體，能夠抑制PD-L1與PD-1、CD80 結合。近期臨床試驗結果顯示，抗PD-1和PD-L1單克隆抗體用于治療進展期惡性腫瘤療效可觀，且耐受性良好[6]。

本研究采用免疫組化方法檢測NPC組織中PD-1的表達，分析探討其與NPC患者臨床病理特征。通過藥物阻斷PD-1檢查點，利用彩色多普勒超聲檢查技術對放療前、后NPC頸部淋巴結轉移灶進行監(jiān)測，探討PD-1在NPC治療中的意義及單克隆抗體在放射治療NPC中起到的作用。現報道如下。

1材料與方法

1.1材料來源

共收集 178例從2013年7月～2018年7月在我院經鼻咽鏡活檢和福爾馬林固定石蠟包埋組織病理確診為NPC并且超聲檢查發(fā)現頸部淋巴結的NPC患者。其中男104例，女74例，年齡25～73歲，平均（44.7±16.5）歲，淋巴結共計 293 枚。所有病例均是伴有頸部淋巴結轉移灶且經病理證實的NPC患者[7]，首選治療方案為放射治療且治療前沒有接受其他任何治療。本研究整理的患者基本資料包括性別、年齡、吸煙史、病理類型、分期、淋巴結轉移。分期參照美國癌癥聯合委員會NPC TNM 分期系統（2010 年第7版），NPC組織標本病理類型均為有分化型或未分化型的非角化性癌[8]。

1.2 方法

1.2.1臨床實驗分組? 分別將PD-1陽性和PD-1陰性患者均衡分為實驗組和對照組。普通放療組（對照組）采用60Co 射線體外照射，靶區(qū)體外照射適用于原發(fā)灶及頸部淋巴結轉移灶，劑量為每次DT1.8～2.0 Gy;頻率為每日照射1次，每周照射5次;總劑量限定在70 Gy[7]。實驗組在對照組基礎上每周靜脈注射抗PD-1單克隆抗體（BMS-936559，1 mg/kg），分別于治療前及治療4周后接受頸部淋巴結彩色多普勒超聲檢查。本研究經過我院臨床實驗倫理委員會批準。

1.2.2 免疫組織化學染色? （1）組織處理方法：用福爾馬林和石蠟固定包埋后切片、脫蠟、水化、阻斷和修復處理后，加PD-1一抗，室溫下孵育60 min，再加即用型MaxVision試劑，DAB顯色后蘇木素復染[9]。（2）免疫組織化學評分標準：在光鏡下（×400）100個視野計數，每個視野計數 100 個細胞。根據陽性細胞百分比和陽性細胞染色強弱兩個方面進行半定量分析，染色強度分為無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色，當陽性細胞百分比不為0，且染色強度在淡黃色或更深時視為PD-1表達陽性。

1.2.3 超聲檢測方法? （1）超聲觀察：將淺表器官定為預設條件，探頭頻率為7.5～10 MHz，患者充分暴露檢查部位，按順序檢查雙側頸部，檢查淋巴結轉移灶的各個超聲參數（包括具體位置、數目、形狀等），同側頸部測量最大淋巴結轉移灶，測量淋巴結最大切面的參數通過脈沖多普勒測量長徑（L）、短徑（S）和長徑/短徑（L/S）。血流參數包括收縮期峰值流速（PSV）和阻力指數（RI）。（2）彩色多普勒血流顯像（CDFI）觀察血流分級情況：將血流強度設定為0～Ⅲ級。信號由弱到強的設定標準為：無血流信號（0級），淋巴結內探及星點狀或短棒狀閃爍之血流信號（Ⅰ級），淋巴結內探及1～2條棒狀或條狀血流信號（Ⅱ級），淋巴結探及多條條狀或環(huán)狀、網狀血流信號（Ⅲ級）。

1.3 統計學方法

使用SPSS 19.0統計學軟件對結果進行分析。計數資料采用χ2檢驗，計量資料經檢驗均屬于正態(tài)分布資料，計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PD-1免疫染色結果

178例NPC患者的組織中PD-1的表達陽性率為30.3%（54/178），PD-1陰性未見棕黃色或棕褐色顆粒（封三圖1a），PD-1陽性顆粒主要在腫瘤組織間質中T淋巴細胞細胞漿中（封三圖1b）。結果顯示，患者年齡、性別、病理類型、分期及淋巴結轉移與NPC組織中PD-1的表達無關，吸煙可能與PD-1的表達有關（P<0.05），見表1。

2.2 放療前、后實驗組和對照組NPC患者頸部淋巴結轉移灶超聲檢查情況

經病理及手術證實，178例NPC患者有293個頸部淋巴結轉移灶，其中PD-1陽性患者92個頸部淋巴結轉移灶，PD-1陰性患者201個頸部淋巴結轉移灶。淋巴結轉移灶形狀呈圓形、類圓形或不規(guī)則形。

PD-1陰性患者的實驗組和對照組在放射治療前后L、S、L/S、PSV和RI等超聲指標變化明顯，其中兩組患者的L、S、PSV和RI指標在放療后均呈現下降趨勢，而L/S則呈現升高趨勢。但是，無論是治療前還是治療后，兩組的各項超聲指標之間差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

PD-1陽性患者的實驗組和對照組在放射治療前后L、S、L/S、PSV和RI等超聲指標變化明顯，其中兩組患者的L、S、PSV和RI指標在放療后均呈現下降趨勢，而L/S則呈現升高趨勢。其中治療前兩組的各項超聲指標之間均無顯著性差異;治療4周后實驗組患者的L、S、PSV和RI指標明顯低于對照組，而L/S則明顯高于對照組。PD-1陽性患者的實驗組各項超聲指標在治療4周后較對照組變化程度明顯增加。見表3。

2.3 NPC頸部淋巴結轉移灶放療前、后彩色多普勒血流顯像檢查情況

PD-1陽性對照組患者放療前后淋巴結轉移灶數目是45 個，治療前血流分級0級占4.4%（2/45），Ⅰ級占20.0%（9/45），Ⅱ級占42.2%（19/45），Ⅲ級占33.3%（15/45）。放療4周后，血流分級0級占68.9%（31/45），Ⅰ級占22.2%（10/45），Ⅱ級占8.9%（4/45），Ⅲ級占0%（0/45）。隨著放療程度的加深，淋巴結轉移灶的血流強度是有顯著變化的，放療前的血流強度分布是趨于Ⅰ～Ⅲ級，放療4周后的血流強度分布是趨于0、Ⅰ級。說明隨著放療程度的逐步加深，血流強度是趨于減弱的，見表4。

PD-1陽性實驗組患者放療前后淋巴結轉移灶數目是47個，治療前血流分級0級占4.3%（2/47），Ⅰ級占21.3%（10/47），Ⅱ級占36.2%（17/47），Ⅲ級占38.3%（18/47）。放療4周后，血流分級0級占74.5%（35/45），Ⅰ級占21.3%（10/47），Ⅱ級占4.3%（2/47），Ⅲ級占0（0/47）。放療前的血流強度分布是趨于Ⅰ～Ⅲ級，放療4周后的血流強度分布是趨于0、Ⅰ級。說明隨著放療程度的逐步加深，血流強度是趨于減弱的，見表5。PD-1陽性的實驗組在治療之前淋巴結轉移灶各血流分級數目基本均衡，在治療后實驗組0級較對照組比例高，而Ⅱ級較對照組比例小。

3 討論

NPC是我國高發(fā)的惡性腫瘤之一。由于鼻咽腔的淋巴管非常豐富，所以發(fā)生頸部淋巴結轉移是較為普遍的[10]。

PD-1是主要表達在 T 細胞上的一種跨膜受體，是在凋亡的 T 細胞雜交瘤中利用消減法得到的[11]。研究表明PD-1的組織表達狀態(tài)是預測PD-1和PD-L1免疫治療的重要標志物[12]，在腫瘤組織中主要表達在腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）上。有研究表明，NPC患者中提高CD8+ T淋巴細胞上PD-1表達預后不良[13]。PD-1的配體已被證明有兩個，分別為PD-L1和PD-L2，其中PD-L1是其主要配體[14]。目前已有的研究證實，在多種實體瘤患者病灶局部及外周血免疫細胞中檢測到PD-L1高表達，且高表達PD-L1的患者預后差，生存率低[15]。

有研究顯示，NPC腫瘤組織中PD-1的表達陽性率為25%～35%[16]。本研究中PD-1的陽性率為30.3%，與相關研究結果相近。本研究顯示PD-1的表達與年齡、性別、病理類型及分期無相關性，而是與是否吸煙相關。吸煙患者的PD-1陽性比例明顯升高，有研究推測是與吸煙導致鼻咽微環(huán)境改變有關，但目前文獻報道吸煙導致NPC的證據很少，仍有待進一步研究。

彩色多普勒超聲檢查技術是臨床上檢查淋巴結病變的一種常規(guī)手段。正常淋巴結的大小、形態(tài)可以作為區(qū)分良惡性的因素之一[17，18]。研究顯示，超聲檢查中的L/S值在淋巴結良惡性鑒別中有重要意義。L/S較小時（<2.0）說明淋巴結轉移灶趨于橢圓形，惡性程度高[18]。本研究結果顯示，放療4周后PD-1陰性患者的對照組和實驗組的淋巴結轉移灶L、S是趨于減小，L/S是趨于增大。說明經過放療后實驗組和對照組的淋巴結轉移灶范圍均有減小，且惡性程度減低。PD-1陽性患者的對照組和實驗組的淋巴結轉移灶變化趨勢與PD-1陰性患者相類似，但是，PD-1陽性患者的實驗組相對于對照組L、S減小和L/S增大的趨勢更明顯，說明抑制了PD-L1與PD-1結合可以控制NPC在淋巴結的擴散，在采用BMS-936559單克隆抗體阻斷PD-1的放射治療方案可以更有效的減小淋巴結轉移灶范圍，且治療后惡性程度更低。

收縮期峰值流速（PSV）及阻力指數（RI）等相關血流參數是判斷腫瘤良惡性的重要依據[19，20]。本研究結果顯示，實驗組和對照組的PSV和RI兩項血流參數均明顯降低，且PD-1陽性患者的實驗組較對照組降低程度增加。說明在PD-1被阻斷后，放射治療對NPC患者淋巴結轉移灶的血流參數產生了影響，同樣佐證了阻斷PD-1可以降低NPC惡性程度的結論。

CDFI在淋巴結良惡性的鑒別中具有十分重要的臨床意義[21，22]，CDFI血流分級是對于淋巴結性質進行鑒別的重要參考依據。超聲診斷特征分析顯示轉移性淋巴結髓質和皮質邊界模糊，回聲逐漸減小[23]。本研究中彩色多普勒血流顯像（CDFI）觀察血流分級情況發(fā)現，PD-1陽性患者在放療基礎上應用BMS-936559單克隆抗體，血流分級中0級比例升高，而Ⅱ級比例減小。說明在阻斷PD-1檢查點起到了降低淋巴結血流強度的作用，提高了放射治療的效果。

綜上，PD-1的表達對NPC的惡性程度有較大影響，同時阻斷PD-1檢查點對NPC的放射治療起到重要的作用。

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（收稿日期：2018-11-30）