邱小燕，姚元枝，潘潤(rùn)澤，李雅思，伍賢進(jìn)，向?qū)O軍，邵 濤，田玉橋

（1. 懷化學(xué)院生物與食品工程學(xué)院民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 懷化 418008；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410123；3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)飼草調(diào)制加工與貯藏研究所，江蘇 南京 210095；4. 湖南省博世康中醫(yī)藥股份有限公司，湖南 懷化 418008）

隨著畜牧業(yè)的不斷發(fā)展，飼料資源短缺成為了急需解決的問題。我國(guó)是農(nóng)作物種植大國(guó)，每年可產(chǎn)生大量的水稻(Oryza sativa)和玉米(Zea mays)秸稈，如能將秸稈調(diào)配成飼料，既可有效地利用秸稈，又可擴(kuò)大飼料來源。但秸稈富含粗纖維[1]，未經(jīng)過加工處理的農(nóng)作物秸稈是一種劣質(zhì)的飼料，其適口性差、采食率低，難以被反芻動(dòng)物消化利用且營(yíng)養(yǎng)不均衡。發(fā)酵全混合日糧(total mixed ration，TMR)，又稱TMR青貯飼料，是TMR在厭氧條件下發(fā)酵而成的飼料，營(yíng)養(yǎng)均衡，可維護(hù)瘤胃健康，提高生產(chǎn)性能[2]。通過發(fā)酵，可以降解和轉(zhuǎn)化TMR中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高其安全性和利用率，同時(shí)可以延長(zhǎng)保存時(shí)間[3]。但是TMR青貯飼料在運(yùn)輸過程中容易引起包膜破損，開窖飼喂過程中空氣浸入，易導(dǎo)致TMR青貯飼料發(fā)生有氧腐敗，降低TMR青貯飼料的品質(zhì)，因此提高TMR青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性極為重要。

糖蜜是一種高水分含量的食品副產(chǎn)物，其主要成分為糖、蛋白質(zhì)、維生素等，是常用的青貯發(fā)酵促進(jìn)劑，可以為乳酸菌的增殖提供底物[4]。陳鑫珠等[5]評(píng)價(jià)，使用糖蜜作為添加劑，苧麻(Boehmeria nivea)和雜交狼尾草 (Pennisetum americanum ×P.purpureum)混合比例為7∶3青貯料發(fā)酵品質(zhì)較好。李志春等[6]等在香蕉(Musa nana)莖葉中添加復(fù)合乳酸菌、糖蜜和米糠改善了青貯飼料品質(zhì)，顯著提高青貯飼料的消化利用率和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。雙乙酸鈉是一種用于食品、飼料等領(lǐng)域的防霉保鮮劑，擁有較強(qiáng)的抑菌殺菌能力[7]，使用比較安全，其最終代謝產(chǎn)物為二氧化碳和水，不會(huì)殘留在動(dòng)物體內(nèi)，對(duì)環(huán)境無不良影響，分解產(chǎn)生乙酸改善飼料的適口性，且價(jià)格低廉，近年來，被廣泛應(yīng)用與反芻動(dòng)物飼料中。劉振陽(yáng)等[8]分別添加了0.1%、0.3%、0.5%雙乙酸鈉到苜蓿(Medicago sativa)與小麥(Triticum aestivum)的混合青貯中，發(fā)現(xiàn)隨著雙乙酸鈉添加量提高，青貯飼料有氧變質(zhì)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，且較高的雙乙酸鈉添加量會(huì)抑制青貯飼料乳酸菌的活性。張新慧等[9]探討雙乙酸鈉對(duì)玉米青貯品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性的影響，表明向青貯原料中添加發(fā)酵抑制劑對(duì)提高青貯的質(zhì)量沒有作用，但可以提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。

本研究以水稻秸稈、玉米秸稈、全株四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus)為原料調(diào)配成TMR青貯飼料，探究雙乙酸鈉和糖蜜對(duì)秸稈TMR青貯發(fā)酵品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性的影響，篩選出適宜的添加劑，為促進(jìn)奶牛業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

TMR青貯飼料由水稻秸稈、玉米秸稈、全株四棱豆和精料調(diào)配而成，水分含量約55%(表1)。水稻、玉米、四棱豆種植于湖南省懷化市當(dāng)?shù)剞r(nóng)田，水稻秸稈和玉米秸稈分別為水稻和玉米去除籽實(shí)后的秸稈，全株四棱豆處于結(jié)莢期，精料由玉米粉、豆粕、棉粕、麥麩、預(yù)混料、DDGS和食鹽組成，購(gòu)于懷化市市場(chǎng)。TMR青貯飼料配方中原料的化學(xué)成分如表2所列。

表1 發(fā)酵全混合日糧的原料構(gòu)成及化學(xué)、微生物成分Table 1 Ingredients and chemical and microbial composition of total mixed ration silages

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)對(duì)照組(C，無添加)、雙乙酸鈉添加組(S，0.5%鮮重)、糖蜜添加組(M，3%鮮重)、雙乙酸鈉 + 糖蜜組合添加組(SM，0.5% + 3%鮮重)4組，每個(gè)聚乙烯青貯袋里填充8 kg TMR青貯飼料，每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù)，抽真空后密封，在25 ℃條件下青貯35 d，開袋測(cè)定其發(fā)酵品質(zhì)，并在有氧暴露0、3、6、9、12和15 d，分別取樣分析有氧穩(wěn)定性。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 前處理

將水稻秸稈、玉米秸稈和全株四棱豆用鍘刀切割成1～2 cm長(zhǎng)。按照試驗(yàn)配方把市購(gòu)的玉米粉、豆粕、棉粕、麥麩、預(yù)混料、DDGS和食鹽等按照比例充分混合配制精料，TMR的調(diào)配均以干物質(zhì)為基礎(chǔ)將原料進(jìn)行混合，配方參照當(dāng)?shù)啬膛?chǎng)采用的配方，奶牛處于泌乳中期，蛋白需要量維持在14%左右，分別稱取雙乙酸鈉、糖蜜，加入去離子水溶解，以便后期與材料充分混合。

1.3.2 化學(xué)成分及微生物成分測(cè)定

干物質(zhì)(dry matter, DM)含量的測(cè)定：將樣品放入65 ℃烘箱恒溫烘48 h以上至恒重；pH采用PHS-3C雷諾pH計(jì)測(cè)定；乳酸及揮發(fā)性脂肪酸含量采用氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，氣相色譜儀為GC-2014型[10]；水溶性碳水化合物含量采用硫酸－蒽酮比色法[10]測(cè)定；氨態(tài)氮含量采用苯酚－次氯酸鈉比色法[11]測(cè)定；粗蛋白采用KjeltecTM2300型全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定；粗脂肪采用殘余法測(cè)定；粗灰分采用高溫灼燒法測(cè)定，取2 g樣品于550 ℃烘干恒重的坩堝內(nèi)，先炭化至無煙，然后移入高溫爐中于550 ℃下灼燒4 h后冷卻稱重，恒重；采用Van-soest法[12]應(yīng)用濾袋技術(shù)測(cè)定中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維。緩沖能的測(cè)定：首先將樣品提取溶液用0.1 mol·L-1的HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液酸化至pH為3，再用 0.1 mol·L-1的 NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)制 pH為 4，然后繼續(xù)滴定至pH為6，記錄pH從4到6的NaOH消耗體積，然后計(jì)算：U = (V1- V0) × C × 1 000/(M × W)。式中：U為緩沖能(mE·kg-1)；V1為消耗NaOH體積 (mL)；V0為空白消耗 NaOH體積 (mL)；C為NaOH濃度(mol·L-1)；M為新鮮樣品質(zhì)量(g)；W為新鮮樣品干物質(zhì)含量(%)；。微生物測(cè)定：取10 g材料加入 90 mL 滅菌的0.85%的生理鹽水中浸提12 h，后用0.85%的生理鹽水依次稀釋至1 × 10-1～1 × 10-7，用于微生物平板計(jì)數(shù)。乳酸菌采用 MRS(de-Man Rogosa Sharpe)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，好氧性微生物采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)(nutrient ager)，酵母菌采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)(potato-dextrose agar)。乳酸菌 37 ℃厭氧條件下培養(yǎng) 2～3 d；好氧性細(xì)菌和酵母菌于生化培養(yǎng)箱 37 ℃中分別培養(yǎng)1～3 d，計(jì)數(shù)。

表2 發(fā)酵全混合日糧配方中全株四棱豆、玉米秸稈、水稻秸稈、精料的化學(xué)成分Table 2 Chemical composition of whole bead, corn stalk, rice straw, and concentrate used in total mixed ration silages

1.3.3 有氧穩(wěn)定性測(cè)定

有氧穩(wěn)定性為青貯飼料在空氣中暴露后其核心溫度比外界溫度高出2 ℃時(shí)，需要的小時(shí)數(shù)[9]。青貯35 d后，進(jìn)行有氧穩(wěn)定性的測(cè)定，青貯開包后，放置于25 ℃恒溫室內(nèi)，將熱電偶放置于青貯料中心處，用記錄儀記錄青貯飼料的溫度[13]，同時(shí)測(cè)定 pH、乳酸、碳水化合物、乙酸、丙酸、丁酸含量及微生物數(shù)量的變化，這些指標(biāo)可以反映有氧腐敗的程度。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示測(cè)定結(jié)果，用鄧肯法(Duncan)對(duì)各處理進(jìn)行多重比較，顯著水平為P ＜ 0.05；采用Excel 2010制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)TMR發(fā)酵品質(zhì)的影響

S組pH顯著(P ＜ 0.05)高于M和SM組，C組pH略高于M和SM組，但無顯著差異(P ＞ 0.05) (表3)。S和SM組緩沖能顯著(P ＜ 0.05)高于C組，其中SM組緩沖能最高。M和SM組乳酸含量顯著高于S和C組，C組乳酸含量最低。C組水溶性碳水化合物含量顯著高于S和SM組，C和M組水溶性碳水化合物含量無顯著差異。S組氨態(tài)氮/總氮低于C組但無顯著差異，M和SM組氨態(tài)氮/總氮顯著低于C組，SM組氨態(tài)氮/總氮最低。SM組乙酸含量顯著高于其他3組，C、S和M組乙酸含量無顯著變化。4組丙酸、丁酸含量、乳酸菌、酵母菌及好氧性微生物數(shù)量都無顯著差異。

2.2 不同處理對(duì)TMR有氧穩(wěn)定性的影響

不同處理TMR有氧穩(wěn)定性如圖1所示，S組的有氧穩(wěn)定性達(dá)到312 h，顯著(P ＜ 0.05)高于M和C組，與SM組無顯著性差異(P ＞ 0.05)。

隨著有氧暴露(0～15 d)，C組和M組pH基本呈上升的變化趨勢(shì)，在有氧暴露15 d后分別上升至6.30和5.18，顯著高于S和SM組(P ＜ 0.05)，S和SM組pH在整個(gè)有氧暴露階段無明顯(P ＞ 0.05)變化(表4)。C組乳酸含量在有氧暴露第9天顯著下降，M和SM組乳酸含量呈下降的趨勢(shì)，S組乳酸含量在整個(gè)有氧暴露過程中無顯著性變化，其中M和SM組乳酸含量在有氧暴露第0天顯著高于C和S組。在整個(gè)有氧暴露過程中，S組和SM組乳酸含量一直較高，各組水溶性碳水化合物含量均表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，各添加劑組水溶性碳水化合物含量在有氧暴露第15天顯著高于C組。

圖1 青貯35 d后各添加劑對(duì)發(fā)酵全混合日糧有氧穩(wěn)定性的影響Figure 1 Effect of each additive on the aerobic stability of TMR silages after 35 d of ensiling

在TMR發(fā)酵過程中，C組及M組乙酸含量均呈先上升后下降的趨勢(shì)(表5)，S組乙酸含量先降后升再降，SM組乙酸含量則呈先下降后上升的趨勢(shì)。其中C組和M組乙酸含量在有氧暴露第12天后顯著低于S和SM組(P ＜ 0.05)。在整個(gè)有氧暴露過程中，各組丙酸含量均呈下降趨勢(shì)，且各組間無顯著(P ＞ 0.05)差異。C組丁酸含量在整個(gè)有氧暴露過程中無明顯變化，S和M組丁酸含量呈下降的變化趨勢(shì)，SM組丁酸含量基本呈先下降后上升的趨勢(shì)，并在第15天顯著上升至1.01 g·kg-1。

表4 有氧暴露階段發(fā)酵全混合日糧的pH、乳酸和碳水化合物含量的變化Table 4 Changes in pH, lactic acid, and water-soluble carbohydrates content of total mixed ration silages during exposure to air

表5 有氧暴露階段發(fā)酵全混合日糧的乙酸、丙酸和丁酸含量的變化Table 5 Changes in acetic acid, propionic acid, and butyric acid content of total mixed ration silages during exposure to air

各組的好氧性微生物數(shù)量隨著有氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)均呈上升的變化趨勢(shì)，但各組間無顯著差異(P ＞ 0.05) (表6)。在剛拆青貯袋(0 d)打破厭氧環(huán)境時(shí)，各組乳酸菌數(shù)量均處于較高水平(＞ 6 lg cfu·g-1)，各組乳酸菌數(shù)量均呈下降的趨勢(shì)，并在有氧暴露第15天降到最低，在有氧暴露第3天M組乳酸菌數(shù)量顯著(P ＜ 0.05)低于其他3組。C組和M組酵母菌數(shù)量分別在有氧暴露第12天和第6天顯著上升至6.28和6.13 lg cfu·g-1，S和SM組酵母菌在整個(gè)有氧暴露過程無明顯變化，呈上升的趨勢(shì)。

表6 有氧暴露階段發(fā)酵全混合日糧微生物數(shù)量變化Table 6 Number changes in microorganism of total mixed ration silages during exposure to air

3 討論

青貯原料是青貯發(fā)酵成功的關(guān)鍵，一般認(rèn)為，原料乳酸菌超過5 lg cfu·g-1FW，可溶性碳水化合物含量超過25～35 g·kg-1DM，干物質(zhì)含量超過200 g·kg-1FW，才能獲得優(yōu)質(zhì)青貯料[14]，本研究所用TMR乳酸菌接近5 lg cfu·g-1FW，水溶性碳水化合物含量為58.45 g·kg-1DM，滿足了青貯發(fā)酵成功的條件，青貯35 d后，各組且僅檢測(cè)到少量的丙酸 (1.06～1.54 g·kg-1DM)和丁酸 (1.66～4.64 g·kg-1DM)，氨態(tài)氮/總氮也低于100，各組TMR均獲得了較好的發(fā)酵品質(zhì)。各組的pH都要高于4.2，這可能與青貯材料的干物質(zhì)含量較高有關(guān)，原現(xiàn)軍等[15]的研究表明青貯飼料干物質(zhì)含量較高時(shí)，pH在4.5左右，也能使飼料良好保存。添加糖蜜顯著降低了pH，提高了乳酸含量，這是因?yàn)榭扇苄蕴妓衔锸翘敲鄣闹饕煞郑梢詾槿樗峋l(fā)酵增加底物[16]，乳酸菌利用碳水化合物迅速產(chǎn)生大量的乳酸，降低pH，抑制蛋白質(zhì)和氨基酸的分解[17]，與趙慶杰等[18]的結(jié)果一致。添加雙乙酸鈉(包括單獨(dú)添加和組合添加)降低了乳酸含量，這可能是由于同型乳酸菌對(duì)雙乙酸鈉的耐受性較低，抑制了青貯過程中乳酸的生成，劉振陽(yáng)等[8]的研究亦表明，較高的雙乙酸鈉添加量會(huì)抑制青貯飼料乳酸菌的活性。氨態(tài)氮/總氮主要反映蛋白質(zhì)和氨基酸的降解程度，含量越低青貯飼料品質(zhì)越好[19]，組合添加雙乙酸鈉和糖蜜組的氨態(tài)氮/總氮最低，且明顯低于無添加組，可能是由于雙乙酸鈉抑制了丁酸菌等有害微生物的生長(zhǎng)，從而降低了蛋白質(zhì)和氨基酸的分解。這與國(guó)衛(wèi)杰等[20]在包裹TMR中添加0.3%和0.5%的雙乙酸鈉能夠抑制有害菌的生長(zhǎng)、延長(zhǎng)貯存時(shí)間的結(jié)果一致。

青貯飼料暴露于空氣中時(shí)，好氧性微生物開始活動(dòng)，分解利用青貯發(fā)酵階段產(chǎn)生的乳酸、氨基酸、蛋白質(zhì)和可溶性碳水化合物，產(chǎn)生氨氣、二氧化碳和水等產(chǎn)物并釋放熱量[14]。通常用青貯飼料在空氣中暴露后其核心溫度比外界溫度高出2 ℃所需要的小時(shí)數(shù)來表示有氧穩(wěn)定性[13]，其腐敗變化情況亦可由pH的變化來反映。本研究中雙乙酸鈉添加組和組合添加組pH在有氧暴露第12天后依舊保持在4.50左右，維持在較低水平，添加雙乙酸鈉提高了發(fā)酵TMR的有氧穩(wěn)定性，雙乙酸鈉有兩個(gè)乙酸根，會(huì)緩慢分解并釋放出單分子物質(zhì)乙酸。乙酸與類脂化合物相似相溶，能滲透到霉菌、酵母等的細(xì)胞壁內(nèi)，干擾細(xì)胞間酶的識(shí)別、傳遞、轉(zhuǎn)化，促使蛋白質(zhì)變性，改變細(xì)胞的滲透性，從而起到殺菌作用，并且乙酸也能通過降低物質(zhì)的pH，來抑菌殺菌[21]。因此，乙酸含量已成為預(yù)測(cè)青貯有氧穩(wěn)定性優(yōu)劣的主要指標(biāo)之一，乙酸濃度越高，有氧腐敗的時(shí)間相應(yīng)的延長(zhǎng)。酵母菌是有氧腐敗的啟動(dòng)者，一般認(rèn)為發(fā)酵TMR酵母菌數(shù)量超過5 lg cfu·g-1FW容易發(fā)生有氧腐敗[3]，但是，Nishino等[22]研究表明，乙酸含量較高的發(fā)酵TMR即使酵母菌數(shù)量超過6 lg cfu·g-1FW也能保持較高的有氧穩(wěn)定性，乙酸對(duì)酵母菌有雙重抑制作用，即厭氧階段抑制酵母的存活，有氧階段抑制酵母的活性[23]，本研究與Plegge等[24]的結(jié)果一致，添加雙乙酸鈉提高了乙酸含量，可能抑制了酵母菌的活性。各組乳酸和水溶性碳水化合物含量均呈下降的變化趨勢(shì)，這是由于有氧暴露后，厭氧環(huán)境被打破，好養(yǎng)性微生物和酵母菌大量繁殖，水溶性碳水化合物和乳酸被分解成有機(jī)酸，且釋放熱量導(dǎo)致飼料內(nèi)部溫度上升，從而加快了腐敗的速度[25]。Johnson等[26]的研究表明，乳酸和水溶性碳水化合物可以為好氧性微生物、酵母和霉菌的生長(zhǎng)繁殖提供底物，造成青貯飼料營(yíng)養(yǎng)成分的損失，因此，青貯飼料有氧穩(wěn)定性與其乳酸和水溶性碳水化合物含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。本研究對(duì)照組和糖蜜添加組經(jīng)過35 d的發(fā)酵后，水溶性碳水化合物含量較高，有氧穩(wěn)定性低于單獨(dú)添加雙乙酸鈉組，這與Chen等[27]的研究結(jié)果一致，添加糖蜜可提高全株玉米TMR青貯飼料的乳酸含量，但不會(huì)提高有氧穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

綜上所述，經(jīng)過35 d青貯后，各組發(fā)酵TMR均具有良好的發(fā)酵品質(zhì)，對(duì)照組和糖蜜添加組在有氧暴露第9天后有氧腐敗開始出現(xiàn)，雙乙酸鈉添加組可使TMR青貯飼料良好的保存15 d以上，提高TMR青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。因此，添加0.5%的雙乙酸鈉可以提高TMR青貯飼料有氧穩(wěn)定性且不影響發(fā)酵品質(zhì)，可應(yīng)用于生產(chǎn)中。