陳碧霄、周 帆、楊 淼、朱 南、紀(jì)晗旭、張 露、喬 玲、楊 洋、祝晨辰、劉艷容、楊婷婷、杜亞瓊、馮詩旸、張馳

通訊作者： 張馳

南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院 210019

國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科技計(jì)劃項(xiàng)目2017QK038 南京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技項(xiàng)目KJ2017005

食品包裝紙是以紙漿及紙板為主要原料的包裝制品，需要滿足無毒，抗油、防水防潮，密封等要求，且符合食品包裝安全要求的用于包裝食品的紙。食品包裝紙因其與食品直接接觸，且其包裝物大部分都是直接入口的食品，所以食品包裝紙最基本的要求是必須符合食品衛(wèi)生的要求，其次根據(jù)食品包裝紙使用要求的不同,還必須達(dá)到相關(guān)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

我國(guó)對(duì)于食品包裝用紙的衛(wèi)生要求，在GB11680-1989食品包裝用原紙衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了食品包裝用紙衛(wèi)生指標(biāo)重金屬、微生物大腸菌群及致病菌的限量【1】，而在GB3561-1989食品包裝用原紙衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法中指出，食品包裝用紙的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控致病菌包括沙門氏菌、志賀氏菌、葡萄球菌和溶血性鏈球菌【2】。

在對(duì)食品包裝用紙的致病菌檢測(cè)過程中，溶血性鏈球菌檢測(cè)方法中使用了CNA哥倫比亞血瓊脂平板，我們?cè)跈z測(cè)過程中發(fā)現(xiàn)在血瓊脂平板上出現(xiàn)具有溶血環(huán)，但菌落形態(tài)與溶血性鏈球菌菌落形態(tài)不同的菌落。因懷疑為致病菌，對(duì)其進(jìn)行分離鑒定，分離出2種生物形態(tài)近似，且均能產(chǎn)生溶血環(huán)的菌株，定為X1和X2，并分別對(duì)X1和X2進(jìn)行16S rRNA鑒定。

實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

實(shí)驗(yàn)儀器

DNA電泳槽DYCP-31DN，北京六一儀器廠；穩(wěn)壓電泳儀DYY-5，北京六一儀器廠；電熱恒溫水槽 DK-8D，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；凝膠成像儀 FR980，上海復(fù)日科技儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱 DHP-9162，太倉(cāng)市科教器材廠；恒溫?fù)u床 TH2-C，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；PCR 儀 Applied Biosystems2720， thermal cycler；冷凍高速離心機(jī)HC-2518R，BBI ；Surf 系列精密單道可調(diào)移液器SP10-1000，上海生工生物工程有限公司。

實(shí)驗(yàn)試劑

Ezup 柱式細(xì)菌基因組 DNA 抽提試劑盒SK8255，上海生工生物工程有限公司；Ezup 柱式真菌基因組 DNA 抽提試劑盒SK8259 ，上海生工生物工程有限公司；Ezup 柱式酵母基因組 DNA 抽提試劑盒SK8257 ，上海生工生物工程有限公司；DreamTaq-TM DNA Polymerase EP0702，MBI；dNTP D0056，上海生工生物工程有限公司；瓊脂糖 AB0014， BBI；SanPrep柱式DNAJ膠回收試劑盒 SK8131，上海生工生物工程有限公司；DNA Ladder Mix maker SM0337，上海生工生物工程有限公司；pMD 18-T Vector連接試劑盒 D101A，Takara； SanPrep 柱式質(zhì)粒DNA 小量抽提試劑盒 SK8191，上海生工生物工程有限公司；槍頭、 PCR管、離心管等，上海生工生物工程有限公司

實(shí)驗(yàn)方法

16S rRNA的擴(kuò)增及序列測(cè)定 從平板上挑取單菌落，移入NB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期新鮮菌液1ml，12000g離心3min收集菌體，雙蒸水洗滌一次，60μL雙蒸水懸浮細(xì)胞，100℃水浴2min，13000g高速離心1min，上清作為DNA模板，-20℃?zhèn)溆茫瑓⒖技?xì)菌通用引物序列，上游引物F1：5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT，下游引物R1：5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA,由 生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

反應(yīng)體系為25ul反應(yīng)體系：PCRmaster 12.5μL，上下游引物各0.5μL，DNA模板（100ng/mL）0.5μL，加雙蒸水至25μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù) 變 性2min；95℃ 1min，59.4℃ 1min，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；70℃延伸10min。

取5μLPCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，用DNA Marker 作為參照。將PCR產(chǎn)物送到生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GeneBank軟件對(duì)相近序列進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

測(cè)序結(jié)果測(cè)序結(jié)果在NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast分析比對(duì)，發(fā)現(xiàn)未知菌X1的16s rRNA基因片段大小為1494 bp，未知菌X1為1491 bp。

測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)與未知菌X1匹配度最高的集中全序列是賴氨酸芽孢桿菌的各株系的16s rRNA序列，未知菌X2匹配度最高為環(huán)狀芽孢桿菌，其匹配度均高達(dá)99%。

系統(tǒng)發(fā)育樹根據(jù)軟件MEGA構(gòu)建進(jìn)化樹見圖X，分析菌株X1與Lysinibacillus菌屬的細(xì)菌具有較近的同源性。X2與Bacillus circulans具有較近的同源性。綜合前述的形態(tài)學(xué)和生理生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果，可判定試驗(yàn)分離得到的菌株為賴氨酸芽孢桿菌和環(huán)狀芽孢桿菌。

討論

在通過對(duì)食品包裝用紙的微生物檢測(cè)過程中，大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、葡萄球菌和溶血性鏈球菌都未曾檢出過，可能與食品包裝用紙生產(chǎn)的原料、加工工藝以及本身特性與食品不同。紙的原材料是木材，因此多見于動(dòng)物糞便、蛋奶、肉類制品來源的大腸桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌無法檢出。

市場(chǎng)上72批次食品包裝用紙中微生物檢測(cè)結(jié)果

而本次實(shí)驗(yàn)篩出的未知菌，以及大批量食品包裝用紙初篩過程中高檢出率的霉菌則都擁有一個(gè)特性，就是環(huán)境中存在的微生物，且都具有耐酸耐堿耐高壓耐高溫的芽孢。

賴氨酸芽孢桿菌和環(huán)狀芽孢桿菌都屬于芽孢桿菌屬，革蘭氏陽性桿菌，多發(fā)現(xiàn)于土壤、污水、木材等。賴氨酸芽孢桿菌和環(huán)狀芽孢桿菌不同的在于是指細(xì)胞壁上存在賴氨酸-天冬氨酸型肽聚糖。雖然二十世紀(jì)賴氨酸芽孢桿菌被認(rèn)為與熱帶潰瘍形成和皮膚或和呼吸道感染有關(guān)【3】，但很多實(shí)驗(yàn)都未證明這一結(jié)論【3、4】，仍不排除其安全風(fēng)險(xiǎn)。

環(huán)狀芽孢桿菌一種革蘭氏陽性菌，也是是一種條件致病菌[5]。從微生物安全等級(jí)分類，它屬于4類安全微生物，但是它可以引起免疫功能受損患者患敗血癥，并導(dǎo)致患者死亡[5]，或是引起傷口感染[6]。這種細(xì)菌也能引起菌血癥、膿腫，并能引起人類腦膜炎[5]。

環(huán)狀芽孢桿菌是一種兼性厭氧菌。有氧存在，可以通過有氧呼吸產(chǎn)生ATP（三磷酸腺苷），無氧狀態(tài)下可以切換到無氧呼吸。實(shí)驗(yàn)證明環(huán)狀芽孢桿菌在4℃、30℃、36℃、42℃均可生長(zhǎng)，最佳生長(zhǎng)溫度范圍應(yīng)為30℃～36℃。在pH6-9的酸堿度范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，最佳生長(zhǎng)pH應(yīng)為7. 這種細(xì)菌能在營(yíng)養(yǎng)匱乏產(chǎn)生內(nèi)孢子，孢子使細(xì)菌長(zhǎng)時(shí)間處于休眠狀態(tài)，營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)良好時(shí)會(huì)重新激活，進(jìn)入營(yíng)養(yǎng)階段。實(shí)驗(yàn)證明，內(nèi)孢子在高溫高壓高酸堿度情況下均可存活。

本次食品用包裝用紙微生物風(fēng)險(xiǎn)篩查中，篩出的環(huán)狀芽孢桿菌是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)監(jiān)控范圍外的具有致病風(fēng)險(xiǎn)的條件致病菌，也是國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)，希望在日后食品包裝用紙風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)工作中提供理論和數(shù)據(jù)支持。