鐘玉君 陳振鋒 梁 宏

(廣西師范大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，省部共建藥用資源化學(xué)與藥物分子工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，桂林 541004)

化療是治療癌癥的重要手段之一，在Rosenberg等發(fā)現(xiàn)順鉑的抗腫瘤活性后，人們合成了許多順鉑類似物并應(yīng)用于臨床。至今，鉑類藥物仍是應(yīng)用最廣泛的化療藥物[1-2]。但由于鉑類藥物的耐藥性和嚴(yán)重的副作用，如急性腎毒性、骨髓抑制和慢性神經(jīng)毒性[3-4]，促使人們尋找新的非鉑類抗腫瘤金屬配合物[5]。

銅在人體內(nèi)的含量?jī)H次于鐵和鋅，并且參與生物體中幾個(gè)關(guān)鍵的生命過程[6]。一般來說，銅的毒性比其他金屬小，因此，銅（Ⅱ）配合物被認(rèn)為具有克服毒副作用和耐藥性的特性。許多銅（Ⅱ）配合物被報(bào)道具有較強(qiáng)的結(jié)合與裂解DNA的能力，其中一些具有抗癌和調(diào)控凋亡的能力[7-9]。三聯(lián)吡啶及其衍生物可以作為DNA結(jié)合劑、拓?fù)涿敢种苿┖涂鼓[瘤藥物，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[10-11]。此外，三聯(lián)吡啶作為一種三齒配體，有3個(gè)共平面的氮原子，具有與金屬形成穩(wěn)定金屬配合物的能力，是構(gòu)建金屬配合物的重要配體[12,14-15]。

為此，我們合成了1個(gè)新的三聯(lián)吡啶銅（Ⅱ）配合物[Cu2(μ-L-κO，O)2Cl2](1)，通過單晶 X 射線衍射確定了配合物1的晶體結(jié)構(gòu)，測(cè)定了配合物1對(duì)5種腫瘤細(xì)胞株(MGC80-3、T24、A549、HeLa、Hep-G2)的體外抗腫瘤活性，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定了配合物1對(duì)MGC80-3細(xì)胞的凋亡效應(yīng)及周期阻滯情況。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

所用儀器有：Bruker APEX-Ⅱ CCD單晶衍射儀，德國(guó)Bruker AvanceⅢHD 400 MHz核磁共振譜儀，德國(guó)Bruker HCT離子阱質(zhì)譜儀，美國(guó)Spectrum Two傅里葉變換紅外光譜儀，德國(guó)Vario ELⅢ元素分析儀，美國(guó)CARY ECLIPSE紫外可見分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)TECANM1000酶標(biāo)定量測(cè)定儀，美國(guó)BD公司FACSVerse流式細(xì)胞儀。

3-氯水楊醛、2-乙酰吡啶及氯化銅均為分析純?cè)噭?，購于阿拉丁。胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基購自CIBCO公司，MTT購自Solarbio公司。

1.2 配體及配合物的合成與結(jié)構(gòu)表征

配體 4-(2-羥基-3-氯)苯基-2，2′∶6′，2″-三聯(lián)吡啶(HL)的合成參考文獻(xiàn)已報(bào)道的方法[13]，產(chǎn)率為81.7%。用3-氯水楊醛和2-乙酰吡啶反應(yīng)合成配體(HL)(Scheme 1)。其結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)為：ESI-MSm/z：397.5[L+K+]。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ15.57(s，1H)，9.08(d，J=1.3 Hz，1H)，8.89(d，J=1.3 Hz，1H),8.84(d，J=4.8 Hz,2H),8.48(d，J=8.0 Hz,1H),8.32(s,1H)，8.23(d，J=7.9 Hz，1H)，8.13(s，1H)，8.06(d，J=17.3 Hz，1H)，7.57(s，2H)，7.56(d，J=9.2 Hz，1H)，7.00(s，1H)。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)：δ155.54，155.42，150.65，150.50，149.79，148.10，137.90，130.83,129.48,129.10,124.89，122.65，121.59，121.30。 IR(KBr，cm-1)：3 910(w)，3 889(w)，3 808(w)，3 786(w)，3 697(w)，3 659(w)，3 636(w)，3 574(w)，3 055(m)，3 010(m)，1 693(w)，1 585(s)，1 566(s)，1 547(s)，1 468(s)，1 436(s)，1 391(s)，1 263(m)，1 228(m)，1 177(m)，1 140(m)，1 080(m)，1 042(m)，991(w)，890(m)，867(m)，829(w)，775(s)，737(s)，665(m)，637(m)，621(m)，564(w)，510(w)。

Scheme 1 Synthesis of ligand HL

配合物[Cu2(μ-L-κO，O)2Cl2](1)的合成方法如下：稱取10 mg(0.028 mmol)配體和10 mg(0.056 mmol)CuCl2·2H2O于一端閉合的25 cm Pyrex厚壁玻璃管中，滴加0.25 mL丙酮與1 mL甲醇，液氮冷凍后，在真空條件下將玻璃管開口端熔封，待玻璃管內(nèi)溶液恢復(fù)室溫后置于65℃的烘箱反應(yīng)72 h。反應(yīng)結(jié)束后梯度降溫至室溫，管內(nèi)生成墨綠色塊狀晶體(配合物1)，產(chǎn)率為62.7%。挑選出大小、形狀適合的單晶，進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。配合物1的晶體學(xué)及結(jié)構(gòu)修正數(shù)據(jù)見表1。其結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)如下：ESI-MS m/z：498.6[M-Cu-L-Cl+K+H]+。 元素分析按 C42H26Cl4Cu2N6O2計(jì)算值(%)：C 55.10，H 2.86，N 9.18；實(shí)測(cè)值(%)：C 54.87，H 2.89，N 9.15。IR(KBr，cm-1)：3 909(w)，3 890(w)，3 858(w)，3 843(w)，3 826(w)，3 807(w)，3 787(w)，3 738(w)，3 715(w)，3 695(m)，3 680(w)，3 659(w)，3 635(w)，3 572(m)，3 433(m)，3 057(m)，2 344(w)，1 604(s)，1 569(m)，1 554(m)，1 475(s)，1 450(m)，1 414(s)，1 325(m)，1 301(m)，1 246(s)，1 164(m)，1 138(m)，1 093(m)，1 067(m)，1 052(w)，1 036(m)，1 019(s)，890(m)，870(m)，783(s)，749(m)，736(m)，715(m)，680(m)，656(m)，645(m)，510(w)，414(w)。

1.3 配合物1晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定

挑選出大小、形狀適合的單晶置于Bruker APEX-ⅡCCD單晶衍射儀上，采用經(jīng)石墨單色器單色化的 Mo Kα 射線(λ=0.071 073 nm)，在 296.15 K下,2.417°～29.601°(θ)范圍內(nèi)對(duì)配合物 1 的單晶 X 射線衍射數(shù)據(jù)進(jìn)行收集。晶體結(jié)構(gòu)使用具有各向異性熱參數(shù)的SHELXL-2015[16]的直接方法解出并通過全矩陣最小二乘法 (the full-matrix least-squares method on F2)進(jìn)行精修。碳原子上的氫原子為理論加氫。配合物1的部分晶體學(xué)及結(jié)構(gòu)修正數(shù)據(jù)見表1。

CCDC：1959094。

表1 配合物1的晶體學(xué)及結(jié)構(gòu)修正數(shù)據(jù)Table 1 Crystal data and structure refinement for complex 1

1.4 體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)

采用MTT比色法測(cè)定CuCl2·2H2O、配體HL、配合物1及順鉑對(duì)所選5種癌細(xì)胞株(MGC80-3、T24、A549、HeLa、Hep-G2)的 IC50值。 使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)配合物1誘導(dǎo)MGC80-3細(xì)胞凋亡以及周期阻滯的情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物1的晶體結(jié)構(gòu)

配合物1的晶體結(jié)構(gòu)如圖1所示，部分鍵長(zhǎng)和鍵角數(shù)據(jù)詳見表2。配合物1屬于三斜晶系，P1空間群。配合物1為雙核結(jié)構(gòu)，在對(duì)稱單元中，中心銅（Ⅱ）離子為五配位扭曲四方錐幾何構(gòu)型，每個(gè)銅離子與1個(gè)Cl-以及來自配體L-的2個(gè)N原子和2個(gè)羥基O原子配位；2個(gè)銅（Ⅱ）離子通過羥基的橋聯(lián)形成雙核結(jié)構(gòu)。

2.2 配合物1在溶液中的穩(wěn)定性

用紫外光譜檢測(cè)配體HL和配合物1的穩(wěn)定性(圖 2、3)。 濃度為 20 μmol·L-1的配合物在 pH=7.35的Tris-HCl緩沖液中，置于室溫下0和48 h后，分別用紫外光譜儀各測(cè)1次吸光度[17-18]。從圖中可以看出各組吸收峰沒有發(fā)生紅移或藍(lán)移現(xiàn)象，也沒有新的吸收峰出現(xiàn)，說明配合物1在Tris-HCl緩沖液中能夠穩(wěn)定存在至少48 h。

圖1 配合物1的橢球率50%的晶體結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Crystal structure of complex 1 with 50%probability ellipsoids

表2 配合物1部分鍵長(zhǎng)(nm)和鍵角(°)Table 2 Selected bond lengths(nm)and angles(°)for complex 1

圖2 配體HL的紫外光譜圖Fig.2 UV spectra of ligand HL

圖3 配合物1的紫外光譜圖Fig.3 UV spectra of complex 1

2.3 體外抗腫瘤活性

為了研究配合物1的體外抗腫瘤活性，我們以人正常肝細(xì)胞HL-7702為對(duì)照，采用MTT法測(cè)定了 CuCl2·2H2O、 配體 HL、配合物 1和順鉑對(duì)MGC80-3，T24，A549，HeLa 和 Hep-G2 五種腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒性[19-22]。由表3可知，配合物1對(duì)所選的腫瘤細(xì)胞株的抑制率均高于CuCl2·2H2O、配體HL及順鉑。其中對(duì)人胃癌MGC80-3細(xì)胞的抑制率最高，達(dá)到了(84.30±1.28)%。如表4所示，從IC50也可以看出，配合物1對(duì)人胃癌MGC80-3細(xì)胞的細(xì)胞毒性最高，其 IC50值為(3.36±0.43)μmol·L-1。 與正常細(xì)胞HL-7702相比，配合物1對(duì)5種腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)出較高的細(xì)胞毒性，說明配合物1在一定程度上可以選擇性抑制腫瘤細(xì)胞。

表3 化合物對(duì)不同細(xì)胞株的抑制率Table 3 Inhibition rates of ligand HL,CuCl2·2H2O,complex 1 and cisplatin on the six selected human cell lines%

表4 化合物對(duì)不同細(xì)胞株的IC50值Table 4 IC50 values of ligand HL,CuCl2·2H2O,complex 1 and cisplatin on the six selected human cell lines μmol·L-1

2.4 細(xì)胞凋亡

采用Annexin V FITC和PI雙染色法測(cè)定配合物1對(duì)MGC80-3細(xì)胞的凋亡效應(yīng)。圖4為藥物濃度分別為 1.5、3.0 和 4.5 μmol·L-1，作用 24 h 后，配合物1誘導(dǎo)人胃癌MGC80-3細(xì)胞凋亡的百分?jǐn)?shù)。在給藥濃度4.5μmol·L-1下，細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)為41.4%，比對(duì)照組增加了33.45%，可推測(cè)配合物1誘導(dǎo)MGC80-3細(xì)胞進(jìn)入早期凋亡[23]。

圖4 配合物1誘導(dǎo)MGC80-3凋亡的情況Fig.4 Apoptosis in MGC80-3 cells exposure to complex 1 for 24 h

2.5 周期阻滯

圖5 配合物1對(duì)MGC80-3細(xì)胞周期的影響Fig.5 Cell cycle distribution of MGC80-3 cells exposure to complex 1 for 24 h

采用流式細(xì)胞術(shù)研究了配合物1誘導(dǎo)MGC80-3細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯情況[24-25]。圖5為不同濃度下，配合物1作用MGC80-3細(xì)胞24 h后的細(xì)胞周期阻滯情況。與空白對(duì)照組相比，隨著給藥濃度從1.5、3.0、4.5 μmol·L-1逐漸增大，MGC80-3 細(xì)胞在G1期的百分比明顯增加，由43.81%分別增至72.14%、72.68%和74.19%，呈濃度依賴關(guān)系。說明配合物1使MGC80-3細(xì)胞阻滯于G1期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

3 結(jié) 論

以 4-(2-羥基-3-氯) 苯基-2，2′∶6′，2″-三聯(lián)吡啶(HL)作為配體合成了配合物[Cu2(μ-L-κO，O)2Cl2](1)，并用多種分析方法對(duì)其進(jìn)行完整的表征。采用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)對(duì)5種腫瘤細(xì)胞株及人正常肝細(xì)胞HL-7702進(jìn)行抑制生長(zhǎng)活性、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯測(cè)試。與配體和順鉑相比，配合物1對(duì)不同的細(xì)胞株具有更高的細(xì)胞毒性，其中對(duì)人胃癌MGC80-3細(xì)胞的細(xì)胞毒性最高，IC50值為(3.36±0.43)μmol·L-1。 配合物 1可以誘導(dǎo) MGC80-3細(xì)胞凋亡，且配合物1使MGC80-3細(xì)胞阻滯于G1期。