李澤冉 朱健萍 于涵洋 陳韻聰＊, 何衛(wèi)江 郭子建＊,

(1南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，配位化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210093)(2南京大學(xué)現(xiàn)代工程與應(yīng)用科學(xué)學(xué)院，南京 210008)

鐵是人體中含量較為豐富的必需過渡金屬元素[1-2]，在酶促反應(yīng)[3-4]、電子傳遞[5]及氧氣運(yùn)輸[6]等多種生理過程中發(fā)揮重要的作用。生命體通過復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制來維持鐵離子的平衡。過量的鐵離子會(huì)導(dǎo)致活性氧物種含量異常，進(jìn)而造成細(xì)胞損傷和器官功能紊亂[7-8]。鐵離子平衡的破壞與一系列重大疾病相關(guān)，如肝炎、癌癥以及阿爾茲海默病與帕金森病等神經(jīng)退行性疾病。在細(xì)胞的還原性環(huán)境中，鐵離子大多以Fe2+的形式存在[9-11]。利用熒光探針檢測Fe2+在生命體系中的實(shí)時(shí)分布信息對于理解鐵離子相關(guān)的生物學(xué)過程具有重要的意義。

目前報(bào)道較多的Fe2+探針主要分為反應(yīng)型和螯合型。反應(yīng)型Fe2+熒光探針發(fā)展比較成熟，大致可分為兩類。一類是Fe2+與羅丹明上的氮氧自由基反應(yīng)[12-13]，反應(yīng)后的羅丹明會(huì)發(fā)出熒光，達(dá)到檢測Fe2+的目的。另一類是利用Fe2+的催化水解作用，使得探針分子中的酰胺鍵水解[14-15]，恢復(fù)熒光信號。螯合型的Fe2+熒光探針[16]是利用N，O等原子與Fe2+的配位作用，使得探針分子的構(gòu)象[17]或發(fā)光性能[18]發(fā)生變化，從而反映Fe2+的水平。我們選擇穩(wěn)定性好、量子產(chǎn)率高的BODIPY[19-21]為熒光基團(tuán)，對Fe2+有較高結(jié)合能力的三聯(lián)吡啶為螯合團(tuán)，通過苯乙烯基將熒光團(tuán)與螯合團(tuán)連接起來，構(gòu)建了新型Fe2+螯合型探針BTPY，利用紫外吸收和熒光強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)了Fe2+特異性識別，并能有效區(qū)分Fe3+。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

所有藥品及試劑購自安耐吉、希恩斯或北京伊諾凱試劑公司，使用前均未經(jīng)過進(jìn)一步的處理。光譜性質(zhì)測試中，所用溶劑為光譜純試劑，購自Aldrich公司，水為MILLIPORE處理過的超純水。熒光光譜用FluoroMax-4光譜儀測試，紫外可見吸收光譜在Perkin-Elmer lambda 35光譜儀上測定。熒光光譜和紫外可見吸收光譜數(shù)據(jù)用Origin軟件處理。探針BTPY的1H NMR和13C NMR譜在Bruker AVANCEⅢ400和Bruker DPX 300核磁儀上用標(biāo)準(zhǔn)脈沖序列測定，用TMS作內(nèi)標(biāo)。電噴霧質(zhì)譜用LCQ電噴霧質(zhì)譜儀(ESMS，F(xiàn)innigan)測定，并用 ISOPRO 3.0 程序模擬其同位素分布。

1.2 化合物BTPY及中間體的合成和表征

1.2.1 化合物1的合成

將 4-甲基苯甲醛(9.00 mL，76.38 mmol)，2-乙酰基吡啶(9.00 mL，72.39 mmol)加入2%的NaOH水溶液(150 mL)中，室溫下攪拌6 h。將2-乙?；拎?9.00 mL，72.39 mmol)加入反應(yīng)體系，調(diào)節(jié)NaOH水溶液的濃度為20%。60℃下加熱攪拌6 h，冷卻至室溫并過濾，得到黃色濾渣。將濾渣用無水乙醇重結(jié)晶，得到淺白色針狀晶型化合物1[22]，產(chǎn)率：20%。1H NMR(300 MHz，CDCl3)：δ2.43(s，3H)，7.32(d，2H，J=8.5 Hz)，7.36(ddd，2H，J=7.7，4.8，1.2 Hz)，7.83(d，2H，J=8.2 Hz)，7.89(td，2H，J=7.7，1.8 Hz)，8.68(dt，2H，J=8.0，1.1 Hz)，8.72～8.76(m，4H)。

1.2.2 化合物2的合成

將化合物1(1.0 g，3.1 mmol)加入四氯化碳溶液(20 mL)中，攪拌15 min。向反應(yīng)體系中加入過氧化二苯甲酰 (0.05 g，0.2 mmol)和N-溴代琥珀酰亞胺(1.23 g，6.2 mmol)，加熱回流24 h。將溶液冷卻至室溫并旋蒸除去溶劑。將得到的黃色固體加入碳酸鈣(1.0 g，10 mmol)，1，4-二氧六環(huán)(40 mL)和水(10 mL)的混合溶液中，回流24 h。冷卻至室溫，旋蒸，硅膠柱層析分離(乙酸乙酯/石油醚，1∶1，V/V)得到白色固態(tài)的化合物2[23]，產(chǎn)率為23%。1H NMR(300 MHz，CDCl3)：δ7.39(ddd，2H，J=7.5，4.8，1.1 Hz)，7.92(td，2H，J=7.8，1.7 Hz)，8.01～8.11(m，4H)，8.70(dt，2H，J=8.0，1.1 Hz)，8.75(ddd，2H，J=4.8，1.9，0.9 Hz)，8.80(s，2H)，10.12(s，1H)。

1.2.3 化合物3的合成

N2保護(hù)下， 將 4-甲氧基苯甲醛 (1.36 g，10 mmol)，2，4-二甲基吡咯(2.09 g，22 mmol)加入二氯甲烷(400 mL)中，再加入1滴三氟乙酸，在室溫下攪拌。 12 h 后加入 2，3-二氯-5，6-二氰對苯醌(2.72 g，12 mmol)，室溫?cái)嚢琛?2 h后加入三乙胺(15 mL)，2 min后再加入三氟化硼乙醚(18 mL)。反應(yīng)體系室溫?cái)嚢? h后，旋蒸，用乙酸乙酯萃取。取有機(jī)相，用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥。旋蒸除去溶劑，硅膠柱層析分離(乙酸乙酯/石油醚，1∶15，V/V)得到紅色晶狀的化合物3[24],產(chǎn)率為38%。1H NMR(300 MHz,CDCl3)：δ1.43(s，6H)，2.55(s，6H)，3.87(s，3H)，5.97(s，2H)，7.01(d，2H，J=8.8 Hz)，7.17(d，2H，J=8.8 Hz)。

1.2.4 化合物BTPY的合成

圖1 探針BTPY及其中間體的合成路線Fig.1 Synthesis of probe BTPY and its intermediates

在微波反應(yīng)器中，加入化合物2(53.5 mg，0.15 mmol)，化合物 3(50.67 mg，0.15 mmol)，冰醋酸(0.35 mL)，哌啶(0.325 mL，3.28 mmol)和分子篩，以二甲基甲酰胺(10 mL)為反應(yīng)溶劑。微波反應(yīng)10 min，旋蒸除去溶劑，硅膠柱層析分離(甲醇/二氯甲烷，1∶20，V/V)得到紫色固態(tài)的目標(biāo)化合物(E)-3-(4-((2，2′∶6′，2″-terpyridin)-4′-yl)styryl)-5，5-difluoro-10-(4-methoxyphenyl)-1，7，9-trimethyl-5H-5λ4，6λ4-dipyrrolo[1，2-c∶2′，1′-f][1，3，2]diazaborinine,命名為 BTPY,產(chǎn)率為 16%。1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ1.47(s，3H)，1.51(s，3H)，2.63(s，3H)，3.89(s，3H)，6.03(s，1H)，6.65(s，1H，CH)，7.03(d，J=8.2 Hz，2H)，7.22(d，J=8.4 Hz，2H)，7.29(d，J=10.6 Hz,1H),7.39(dd,J=7.6，5.6 Hz,2H),7.73(d，J=5.5 Hz，2H)，7.77(d，J=11.3 Hz，1H)，7.88～7.99(m,4H),8.70(d,J=8.0 Hz,2H),8.74～8.80(m，4H)。13CNMR(100 MHz,CDCl3)：δ14.67，14.81，55.33，114.54，117.57，118.76，119.95，121.53，123.93，127.04，127.64,127.99,129.39,132.57，133.28，134.89，137.17，137.42,138.38,140.76,142.27，143.39，148.94，149.61，151.96,155.74,155.96,160.17。 ESI-MS(positive mode，m/z)：Calcd.674.29，F(xiàn)ound：674.42 for[M+H]+。

1.3 探針BTPY光譜性質(zhì)測試

BTPY用光譜純DMF(N，N-二甲基甲酰胺)配制成1.0 mmol·L-1的儲備溶液放置在4℃冰箱中備用。光譜測試在PBS緩沖溶液體系(10 mmol·L-1，pH=7.40)或光譜純DMF中進(jìn)行。向3 mL BTPY(10 μmol·L-1)的 PBS緩沖溶液和DMF溶液中，分別加入不同體積的FeCl2水溶液(1 mmol·L-1)，每次加入30μL，充分混合均勻后分別進(jìn)行熒光光譜滴定和紫外可見吸收光譜滴定測試。

國內(nèi)對高校實(shí)驗(yàn)室安全管理方面的研究較晚，通過學(xué)習(xí)國外的相關(guān)研究以及結(jié)合國內(nèi)高校實(shí)驗(yàn)室的具體情況，部分研究者曾試圖通過建立安全管理體系，來減少實(shí)驗(yàn)室事故的發(fā)生.如葉秉良等通過結(jié)合浙江理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)室安全管理的具體情況，從實(shí)驗(yàn)室布置、安全檢查、技術(shù)防范、應(yīng)急預(yù)案等幾個(gè)方面構(gòu)建我國高校實(shí)驗(yàn)室安全管理體系的基本思路[4].李家祥通過研究分析實(shí)驗(yàn)室安全管理中存在的問題及原因，構(gòu)建了安全建防、安全采購、安全教育等管理舉措，從而來提高實(shí)驗(yàn)室的安全[5].此外，還有部分學(xué)者嘗試?yán)脤哟畏治龇?、模糊評價(jià)、BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等方法對實(shí)驗(yàn)室安全管理進(jìn)行了科學(xué)有效評價(jià).

1.4 探針BTPY金屬離子選擇性測試

向 3 mL BTPY(10 μmol·L-1)的溶液中加入相應(yīng)濃度的金屬離子溶液，充分混合均勻后進(jìn)行測試。其中， 加入的 K+，Ca2+，Na+，Mg2+離子濃度為 1 mmol·L-1，其余金屬離子濃度為 100 μmol·L-1。

1.5 結(jié)合常數(shù)測試

向 3 mL BTPY(10 μmol·L-1)的 DMF 溶液中，分別加入不同體積的 FeCl2水溶液 (1 mmol·L-1)或Fe(NO3)3·9H2O 水溶液(1 mmol·L-1)，每次加 30 μL，充分混勻后進(jìn)行測試。結(jié)合常數(shù)根據(jù)如下公式擬合:

其中F0為探針BTPY在不加Fe2+時(shí)，628 nm處的熒光強(qiáng)度。F為加入不同濃度的Fe2+時(shí)628 nm處的熒光強(qiáng)度。探針BTPY與Fe2+的結(jié)合常數(shù)Ka是通過1/(F-F0)對1/cFe2+作圖得到的。1/(F-F0)與1/cFe2+呈線性關(guān)系，參照公式，由截距與斜率的比值得到Ka的值。

1.6 結(jié)合比測試

在3 mL探針BTPY的DMF溶液中，保持BTPY 與 Fe2+的總濃度為 30 μmol·L-1，調(diào)整 BTPY 與Fe2+的不同比例，測試紫外吸收強(qiáng)度。以607 nm處的吸光度對cFe2+/(cFe2++cBTPY)作圖，通過數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合2條直線，通過2條直線的交點(diǎn)得到探針BTPY與Fe2+的結(jié)合比。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針BTPY的光譜性質(zhì)

如圖 2a 所示，BTPY(10 μmol·L-1)在 10%(V/V)DMF的PBS緩沖溶液(pH=7.40)中有543和584 nm兩個(gè)最大吸收峰。其原因是BODIPY與TPY之間的苯乙烯基使得整個(gè)分子形成大的共軛體系，使得吸收波長較長。如圖2b熒光光譜所示，BTPY最大激發(fā)波長為582 nm，最大發(fā)射波長為678 nm，斯托克斯位移是96 nm。激發(fā)波長在可見光區(qū)，熒光發(fā)射波長則進(jìn)入近紅外區(qū)。

圖2 BTPY在10%(V/V)DMF的PBS緩沖溶液中的紫外-可見吸收光譜(a),熒光激發(fā)和發(fā)射光譜(b);BTPY在DMF中的紫外-可見吸收光譜(c),熒光激發(fā)和發(fā)射光譜(d)Fig.2 UV-Vis absorption spectrum(a),excitation and emission spectra(b)of BTPY obtained in PBSbuffer containing 10%(V/V)DMF;UV-Vis absorption spectrum(c),excitation and emission spectra(d)of BTPY obtained in DMF

而圖2c和d顯示，BTPY在純DMF中的紫外-可見吸收光譜與其在PBS緩沖溶液中明顯不同，最大吸收波長為573 nm，同時(shí)532 nm處有一個(gè)相對較弱的吸收峰。熒光光譜也發(fā)生了變化，最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為573和628 nm，較10%(V/V)DMF中的發(fā)射波長藍(lán)移了50 nm，依然在近紅外區(qū)。這表明不同的溶劑對BTPY的發(fā)射波長有很大影響。

2.2 探針BTPY與Fe2+作用的光譜研究

而探針BTPY在DMF中加入 100μmol·L-1的Fe2+，熒光幾乎完全猝滅(圖3b)。這應(yīng)當(dāng)與探針BTPY在DMF溶液中的溶解度相關(guān)，在純DMF溶劑中，BTPY的溶解度更大，使得與Fe2+的結(jié)合能力增強(qiáng)，熒光能夠被完全猝滅。

圖3 Fe2+對BTPY的熒光滴定曲線:(a)在10%(V/V)DMF的PBS緩沖溶液;(b)在DMF中Fig.3 Emission spectra of BTPY upon Fe2+titration:(a)in PBSbuffer containing 10%(V/V)DMF;(b)in DMF

當(dāng)10%(V/V)DMF的PBS緩沖溶液 (pH=7.40)體系中分別加入過量的Fe2+和 Fe3+(100μmol·L-1)，紫外吸收峰的波長并沒有發(fā)生明顯的變化(圖4)，僅僅強(qiáng)度稍有下降，可能的原因是在該緩沖溶液體系中，F(xiàn)e2+和Fe3+與探針結(jié)合能力較弱，因此引起的紫外光譜變化很小。

BTPY的 Fe2+和Fe3+的紫外滴定在DMF中完成。如圖5，當(dāng)逐漸增大金屬離子濃度，BTPY在573 nm處的吸收峰隨金屬離子濃度增大而降低，同時(shí)在607 nm處出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰，并且隨著Fe2+或Fe3+的加入而逐漸增強(qiáng)。這與文獻(xiàn)報(bào)道過的Fe2+會(huì)使螯合基團(tuán)的吸收峰紅移，即出現(xiàn)MLCT吸收峰吻合。實(shí)驗(yàn)也表明，除了Fe2+之外，F(xiàn)e3+的加入也會(huì)使光譜中出現(xiàn)MLCT吸收帶。

圖4 在10%(V/V)DMF的PBS緩沖溶液中,BTPY對Fe2+和Fe3+的紫外響應(yīng)情況Fig.4 UV-Vis spectra of BTPY obtained in PBSbuffer containing 10%(V/V)DMF upon addition of Fe2+and Fe3+

圖5 在DMF中Fe2+(a)和Fe3+(b)對BTPY的紫外滴定曲線和顏色變化Fig.5 UV-Vis absorption spectra and color change of BTPY obtained in DMF upon Fe2+(a)and Fe3+(b)titration

圖6 在DMF中BTPY對常見金屬離子的紫外光譜響應(yīng)Fig.6 UV-Vis absorption response of BTPY to common metal cations in DMF

探針BTPY對其它常見金屬離子的紫外響應(yīng)如圖6所示。其它金屬離子的加入，吸收峰不發(fā)生明顯紅移，同時(shí)溶液顏色也不發(fā)生變化。而Fe2+和Fe3+的加入使吸收光譜在607 nm處出現(xiàn)MLCT吸收帶，溶液顏色由亮紅色變?yōu)樗{(lán)紫色。探針BTPY對鐵離子獨(dú)特的紫外選擇性，且溶液顏色發(fā)生明顯變化，使得BTPY可用于鐵離子的可視化識別。

2.3 探針BTPY與Fe2+結(jié)合比及結(jié)合常數(shù)的測定

在DMF中測定BTPY與Fe2+的紫外吸收J(rèn)ob曲線。固定 BTPY 與 Fe2+的總濃度為 30 μmol·L-1，改變BTPY與Fe2+的比例，得到不同比值下的紫外可見吸收光譜圖。圖7為根據(jù)607 nm處的紫外吸收強(qiáng)度得到的Job曲線。吸收強(qiáng)度最大時(shí)對應(yīng)的Fe2+與總濃度的比值為0.56，這表明BTPY與Fe2+以1∶1的方式進(jìn)行結(jié)合。

圖7 在DMF中根據(jù)607 nm處的紫外吸光度測定的BTPY與Fe2+結(jié)合的Job曲線Fig.7 Job′s plot of BTPY upon addition of Fe2+in DMF determined by UV absorbance at 607 nm

圖8 BTPY與Fe2+在DMF中的Benesi-Hildebrand圖Fig.8 Benesi-Hildebrand plot of BTPY upon addition of Fe2+in DMF

根據(jù)熒光滴定光譜，取628 nm處的熒光強(qiáng)度繪制了探針與Fe2+結(jié)合的Benesi-Hildebrand圖(圖8)。利用結(jié)合常數(shù)公式對其進(jìn)行線性擬合，得到擬合直線的截距和斜率，由此計(jì)算得到Ka值為2.28×104L·mol-1。用同樣的方法測得探針與Fe3+的結(jié)合常數(shù)為 1.82×104L·mol-1(圖 9)。探針 BTPY 與 2種鐵離子的結(jié)合常數(shù)相差不大。

圖9 BTPY與Fe3+在DMF中的Benesi-Hildebrand圖Fig.9 Benesi-Hildebrand plot of BTPY upon addition of Fe3+in DMF

2.4 探針BTPY對金屬離子的選擇性

如圖10a所示，在10%(V/V)DMF的PBS緩沖溶液(pH=7.40)中，F(xiàn)e2+和Cu2+對熒光有較強(qiáng)的猝滅作用，而其它金屬離子對BTPY基本無響應(yīng)行為。這說明BTPY對Fe2+和Cu2+有較強(qiáng)的結(jié)合能力。在純DMF中(圖 10b)，探針 BTPY 除了對 Fe2+和 Cu2+有猝滅型響應(yīng)行為以外，也對Ni2+有同樣的熒光降低響應(yīng)。這說明在DMF溶劑比例增大的情況下，BTPY與Ni2+也能夠較強(qiáng)的結(jié)合。

圖10 在10%(V/V)DMF的PBS緩沖溶液(a)和DMF(b)中,BTPY在不同金屬離子存在時(shí)熒光強(qiáng)度的變化Fig.10 Fluorescence intensity changes of BTPY in the presence of different metal ions in PBSbuffer solution containing 10%(V/V)DMF(a)and DMF(b)

3 結(jié) 論

選擇量子產(chǎn)率較高的BODIPY作為熒光基團(tuán)，對Fe2+有較好結(jié)合能力的TPY作為螯合基團(tuán)，通過苯乙烯基將這2個(gè)基團(tuán)連接起來，增大了分子內(nèi)的共軛體系，使得探針BTPY的熒光發(fā)射進(jìn)入近紅外區(qū)。值得注意的是，在純DMF中，BTPY對Fe2+和Fe3+有特異性的紫外響應(yīng)，隨著這2種金屬離子的加入，其573 nm處的吸收峰紅移到607 nm處，為典型的MLCT吸收帶。同時(shí)，F(xiàn)e2+和Fe3+的加入，會(huì)使溶液顏色由亮紅色變?yōu)樗{(lán)紫色，而探針BTPY對其它離子則沒有這種響應(yīng)行為，因此，BTPY可用于鐵離子的可視化識別。在10%(V/V)DMF的PBS緩沖溶液中，BTPY選擇性地對Fe2+和Cu2+有熒光猝滅型響應(yīng)，而對包括Fe3+在內(nèi)的其它金屬離子基本無響應(yīng)行為。因此，只有Fe2+能同時(shí)引起B(yǎng)TPY紫外光譜的紅移和熒光光譜的猝滅效應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)對Fe2+的高度選擇性檢測。