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        微小RNA-503在急性腦梗死病人血清中的表達及對胰島素樣生長因子1受體信號通路的調(diào)控

        2019-11-07 02:01:00張珊珊蒲超張翼楊旭季一飛
        安徽醫(yī)藥 2019年11期
        關(guān)鍵詞:血清

        張珊珊,蒲超,張翼,楊旭,季一飛

        急性腦梗死(Acute cerebral infarction,ACI)是一種腦血管疾?。耗X部血管出現(xiàn)狹窄甚至堵塞后,血液循環(huán)出現(xiàn)障礙,腦部供血、供氧中斷,致使組織壞死以及神經(jīng)損傷。ACI以相應(yīng)神經(jīng)功能缺失為臨床表現(xiàn),具有較高的發(fā)病率、高致殘率和高死亡率,不僅危害病人生命,也加重了家庭和社會的負擔(dān)[1]。目前,關(guān)于ACI研究的熱點集中在ACI的預(yù)防、降低其致殘率和死亡率。

        研究表明,ACI病人和動物模型中的血清微小RNA(miRNA)表達譜發(fā)生了顯著改變,且miRNA被證實可參與作用腫瘤細胞增殖和耐藥。其中miRNA-503作為抑癌基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2]。胰島素樣生長因子1受體(Insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R)是一種跨膜受體,屬于酪氨酸激酶受體大家族,可被IGF-1和IGF-2等激活,常在結(jié)直腸癌、胃癌等腫瘤中過表達,促進腫瘤轉(zhuǎn)化、發(fā)展,并抑制癌細胞凋亡[3]。miRNA-503可通過調(diào)控IGF-1R的表達進而抑制肝癌細胞增殖,促進凋亡[4]。

        腦梗死的發(fā)生可能與惡性腫瘤有關(guān),被稱為惡性腫瘤相關(guān)腦梗死[5]。為研究miRNA-503在ACI病人體內(nèi)與腫瘤的關(guān)系,本文檢測了ACI病人血清中miRNA-503的表達水平,并初步分析了其在膠質(zhì)瘤細胞U87中對于IGF-1R表達及調(diào)控PI3K/Akt信號通路的作用。

        1 資料和方法

        1.1 一般資料選取2017年9月至2019年4月間于南充市中心醫(yī)院確診的92例急性腦梗死病人作為觀察組,其中男性57例,女性35例;年齡范圍為55~72歲,年齡(66.33±2.26)歲;體質(zhì)量范圍為52~61 kg,體質(zhì)量(56.83±2.87)kg。病人均無其他嚴重并發(fā)癥。同時挑選同期間于我院體檢健康者92例作為對照組,其中男性55例,女性37例;年齡范圍為52~70歲,平均(64.63±2.77)歲;體質(zhì)量范圍為51~63 kg,體質(zhì)量(57.44±2.96)kg。兩組一般資料比較,均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。所有病人及其家屬均知情并簽署同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

        1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn):所有病人的診斷均符合中國腦梗死中西醫(yī)結(jié)合診治指南(2017)[6]的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn),并經(jīng)過腦血管造影和CT檢查確診[7]。

        排除標(biāo)準(zhǔn):患有嚴重原發(fā)性疾病者,如肝腎疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、腫瘤、嚴重感染等;有腦梗死病史者;最近3個月內(nèi)受嚴重外傷者;近期接收過重大手術(shù)者。

        1.3 樣本采集及處理對照組于體檢當(dāng)日清晨空腹抽取肘靜脈血5 mL。觀察組于入院第2天、禁食10~12 h后清晨空腹抽取肘靜脈血5 mL。室溫放置2 h或4℃過夜后于1 000g離心20 min,分離血清標(biāo)本,密封保存置于-20℃冰箱或者-80℃冰箱保存,避免反復(fù)凍融。

        1.4 血清中miRNA-503及IGF-1R的表達水平分析取觀察組和對照組血清樣品,提取所有樣本RNA后,使用全式金公司的TransScript Two-Step RTPCR SuperMix(AT401-01)試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA。

        根據(jù)GeneBank中miRNA-503的序列(NR_030228.1),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成miRNA-503引物,F(xiàn):5′-TGCCCTAGCAGCGGGAA-3′,R:5′-TACCCTGGCAGCGGAAACA-3′。選用U6基因作為內(nèi)參,F(xiàn):5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,R:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。將上述cDNA作為模板,按照以下程序在Real-Time PCR儀(ABI 7500,USA)上進行qPCR擴增:95℃,5 min;95 ℃,15 s;60 ℃,30 s;40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt的方法計算miRNA-503的相對表達量。

        取對照組和觀察組血清樣本,按照人IGF-1R檢測試劑盒(96T/48T,上海紀(jì)寧酶聯(lián)科技有限公司)的操作說明,對兩組血清樣本中的IGF-1R表達水平進行檢測。

        1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡以將U87細胞miRNA-503模擬組細胞和miRNA-503對照組細胞以7×103個/孔的密度接種于96孔板中,加入含有10%胎牛血清的高糖DMEM細胞培養(yǎng)液100μL,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后,將miRNA-503模擬物以及對照物分別轉(zhuǎn)染細胞中,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收集細胞,流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡情況。重復(fù)3次實驗。

        1.6 Western blot檢測U87細胞置于加入含有10%胎牛血清的高糖DMEM細胞培養(yǎng)液中,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組細胞以3.0×105個/孔的密度接種12孔板,培養(yǎng)24 h后,收集細胞,進行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳:濃縮膠恒壓80 V,20 min;分離膠恒壓120 V,電泳至溴酚藍到凝膠底部。使用Bio-Rad半干轉(zhuǎn)印槽(Trans-Blot SD,170-3940)在恒壓15 V,30 min條件下轉(zhuǎn)印至PVDV膜(生工,F(xiàn)019532-0010)。取下PVDF膜放入封閉液(TBST,5%脫脂奶粉,pH7.4)中室溫孵育2 h;使用abcam公司生產(chǎn)的IGF-1R一抗稀釋液(ab39398,1∶5 000),Bax一抗稀釋液(ab32503,1:5 000),p-Akt一抗稀釋液(ab38449,1∶5 000),Bcl-xl一抗稀釋液(ab32370,1∶5 000),c-Myc一抗稀釋液(ab32072,1∶5 000),p-STAT3一抗稀釋液(EP2147Y,1∶5 000)室溫孵育PVDF膜1 h;TBST洗膜3次,每次10 min;使用全式金公司生產(chǎn)的HRP標(biāo)記的二抗羊抗兔IgG稀釋液(HS101-01,1∶10 000)室溫孵育PVDF膜1 h;TBST洗膜3次,每次10 min;最后根據(jù)ECL化學(xué)發(fā)光液(180-501,上海天能)使用說明,將PVDF膜置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中顯影。實驗重復(fù)3次。

        1.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以±s表示,兩組間比較采用兩獨立樣本均數(shù)的t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。當(dāng)P<0.05時認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 血清樣本中miRNA-503及IGF-1R的表達量比較觀察組miRNA-503表達量顯著低于對照組,而IGF-1R的檢測量則顯著高于對照組(P<0.05)。見表1。

        表1 急性腦梗死和健康對照血清中miRNA-503及IGF-1R的表達量

        2.2 miRNA-503及IGF-1R在HEB細胞和U87細胞中的表達量比較miRNA-503在HEB細胞中的表達顯著高于U87細胞(P<0.05);IGF-1R在HEB細胞中的表達顯著低于U87細胞(P<0.05)。見圖1,表2。

        圖1 IGF-1R在腦正常膠質(zhì)細胞(HEB)及膠質(zhì)瘤細胞U87中的表達

        表2 miRNA-503及IGF-1R在腦正常膠質(zhì)細胞(HEB)及膠質(zhì)瘤細胞U87中的表達量

        2.3 miRNA-503在不同處理的U87細胞中的表達量比較3組細胞中miRNA-503的相對表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中,miRNA-503在空白對照組和陰性對照組的相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與兩對照組相比,模擬組細胞中的miRNA-503的相對表達量顯著增高(P<0.05)。見表3。

        表3 miRNA-503不同處理的膠質(zhì)瘤細胞U87中的表達量

        2.4 不同處理的U87細胞的凋亡情況比較3組細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中,空白對照組和陰性對照組的凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與兩對照組相比,模擬組細胞凋亡率顯著增高(P<0.05)。見圖2,表4。

        2.5 IGF-1R信號通路相關(guān)蛋白在不同處理的U87細胞中表達情況比較3組細胞中的各種蛋白表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)??瞻讓φ战M和陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與空白對照組相比,IGF-1R、p-Akt、p-STAT3及Bcl-xL等蛋白表達量顯著下降(P<0.05);而c-Myc和Bax的表達量則顯著升高(P<0.05)。見圖3,表5。

        圖2 三組膠質(zhì)瘤細胞U87的凋亡情況

        表4 不同處理的膠質(zhì)瘤細胞U87組中細胞的凋亡情況

        3 討論

        ACI的發(fā)病機制相當(dāng)復(fù)雜,涉及多種機制。臨床檢測表明,患有不同疾病的病人的血漿miRNA表達不同[8]。多種miRNA在ACI病人血清中存在明顯差異,并發(fā)揮重要功能[9-11]。miRNA屬于非編碼RNA,通常由18~25個核苷酸組成,可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達。一般可通過降解靶基因mRNA或者抑制蛋白翻譯等手段對靶基因進行負調(diào)節(jié)[12]。目前研究已證實,miRNA可參與細胞發(fā)育、分化、生長、增殖以及凋亡等各種生理過程,并且能夠參與調(diào)節(jié)炎性細胞和介質(zhì)的表達[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn),與健康人相比,ACI病人血清中miRNA-503表達水平顯著降低,而IGF-1R水平則顯著升高。這表明,miRNA-503及IGF-1R極可能參與了ACI的發(fā)病過程。

        圖3 IGF-1R信號通路相關(guān)蛋白在不同處理的膠質(zhì)瘤細胞U87中表達

        表5 IGF-1R信號通路相關(guān)蛋白在不同處理的膠質(zhì)瘤細胞U87中表達/±s

        表5 IGF-1R信號通路相關(guān)蛋白在不同處理的膠質(zhì)瘤細胞U87中表達/±s

        組別空白對照組陰性對照組miRNA-503模擬組F值P值t值(空白對照組比陰性對照組)P值(空白對照組比陰性對照組)t值(空白對照組比miRNA-503模擬組)P值(空白對照組比miRNA-503模擬組)t值(陰性對照組比miRNA-503模擬組)P值(陰性對照組比miRNA-503模擬組)樣本數(shù)5 5 5 IGF-1R 0.93±0.09 0.90±0.10 0.49±0.05 44.000<0.001 0.499 0.632 9.556<0.001 8.2000<0.001 p-Akt 0.76±0.07 0.81±0.09 0.43±0.05 41.260<0.001 0.981 0.356 8.578<0.001 8.253<0.001 c-Myc 0.51±0.06 0.52±0.05 1.07±0.11 84.640<0.001 0.286 0.782 9.994<0.001 10.180<0.001 p-PI3K 1.06±0.09 0.99±0.10 0.30±0.04 134.300<0.001 1.163 0.278 17.250<0.001 14.330<0.001 Bcl-xL 1.12±0.10 1.11±0.10 0.52±0.07 71.100<0.001 0.158 0.878 10.990<0.001 10.810<0.001 Bax 0.44±0.05 0.45±0.04 1.09±0.11 128.400<0.001 0.349 0.736 12.030<0.001 12.230<0.001

        磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路的激活和相關(guān)免疫功能調(diào)控都與miRNA密切相關(guān)[15-16]。研究表明,多種miRNA都可參與該通路的調(diào)節(jié)[17-18],且都有IGF-1R的參與[19-21]。IGF-1R是細胞增殖、分裂以及分化中的重要調(diào)節(jié)因子,能夠預(yù)防各種細胞的凋亡損傷、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子的表達等[22],其高表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展明顯相關(guān)[23]?,F(xiàn)有的研究表明,miRNA-503參與了多種腫瘤細胞的生長調(diào)節(jié)過程[24],且都靶向IGF-1R發(fā)揮功能[2,4]。

        為研究miRNA-503在ACI相關(guān)腫瘤疾病中對IGF-1R及其信號通路中的作用,本研究以人腦正常膠質(zhì)細胞HEB細胞及膠質(zhì)瘤U87細胞為研究對象,進行了初步探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與HEB細胞相比,U87細胞中miRNA-503表達水平顯著降低,而IGF-1R水平則顯著升高。進一步證實了miRNA-503及IGF-1R在腫瘤細胞發(fā)展中起著重要作用。在U87細胞中過表達miRNA-503以后,細胞凋亡率增加,細胞增殖受到明顯抑制。有文獻報道,IGF-1R活化后,可以激活PI3K、Akt等信號分子,進而增強細胞的增殖和遷移能力[22],Bcl-xl和Bax的表達變化與細胞凋亡密切相關(guān)[25]。本實驗中Western blot結(jié)果顯示,PI3K/Akt信號通路中關(guān)鍵蛋白p-Akt、Bcl-xl和p-PI3K顯著降低,與IGF-1R表達降低一致;而c-Myc和Bax顯著升高,與細胞凋亡率增加一致。結(jié)果表明,miRNA-503表達水平升高,可抑制IGF-1R的表達,進而阻礙了PI3K/Akt信號通路的激活,同時Bcl-xl/Bax比例下降,共同致使癌細胞增殖減慢,凋亡增加。

        本文尚且存在不足之處:(1)本文僅在細胞學(xué)水平對miRNA-503對IGF-1R的生物學(xué)功能進行了初步探討,并代替體內(nèi)真實狀況,需要相關(guān)的動物模型,進一步驗證本文的結(jié)論。(2)CAI的發(fā)病機制比較復(fù)雜,miRNA-503影響的信號通路可能是多方向的,活血也有其他miRNA分子的參與,因此在今后的研究中需要驗證其他信號通路的激活及miRNA分子表達。

        綜上所述,在急性腦梗死病人血清中,miRNA-503呈現(xiàn)高水平表達,而IGF-1R則呈現(xiàn)低水平表達。miRNA-503在U87細胞中的過表達能夠抑制細胞增殖,可能是通過抑制IGF-1R表達,進而調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路中相關(guān)蛋白表達,從而抑制了U87的增殖。

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