張付民，李艷兵

失眠為臨床常見的精神系統(tǒng)疾病，常以入睡難、易醒、睡眠淺為主要臨床癥狀［1］，現(xiàn)已對人們的生活和工作造成了嚴重影響，迫切需要尋找切實有效的治療方法。據(jù)統(tǒng)計［2］，中國有3億睡眠障礙病人，發(fā)病率高達38.2%。過去數(shù)十年研究者主要通過神經(jīng)遞質(zhì)假說和神經(jīng)炎癥假說解釋了失眠的發(fā)病機制，但近幾年研究者發(fā)現(xiàn)下丘腦生物鐘基因失調(diào)與失眠存有相關(guān)性［3］。視交叉上核（Suprachiasmatic nucleus，SCN）為下丘腦中的重要神經(jīng)核團，為生物節(jié)律調(diào)節(jié)中樞，能調(diào)節(jié)包括晝夜節(jié)律在內(nèi)的多種生物節(jié)律［4］。SCN能調(diào)節(jié)Period1（Per1）、Period2（Per2）、Clock、Baml1等多種與晝夜節(jié)律相關(guān)的生物鐘基因，其中Per1和Per2的失調(diào)與失眠癥關(guān)系較為密切，為當前學術(shù)界研究的熱點［5-6］。動物實驗及臨床實驗均已證實酸棗仁湯對于失眠具有較好的療效，其機制可能與其調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平和神經(jīng)炎癥有關(guān)，但尚不能確定其是否可以通過調(diào)節(jié)生物鐘基因而改善睡眠。為進一步探明酸棗仁湯改善睡眠的作用機制，同時也為酸棗仁湯臨床應(yīng)用提供一定的實驗支撐，本實驗自2017年1月至2018年1

月通過腹腔注射PCPA以建立睡眠剝奪模型，并給予模型動物酸棗仁湯，應(yīng)用自主活動測試儀記錄大鼠自主活動時間，Real time-PCR、免疫組化和Western blot檢測SCN中Per1和Per2的基因和蛋白表達水平，以初步探明酸棗仁湯干預失眠的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物成年健康SPF級雄性SD大鼠，40只，體質(zhì)量為200～250 g，購自湖北省實驗動物研究中心，實驗動物許可證號及合格證號分別為SCXK（鄂）2015-0018、420006002854238。

1.2 主要藥品及試劑根據(jù)方劑學［7］中酸棗仁湯藥物組成及配伍計量確定本研究酸棗仁湯的藥物組成和藥物劑量，即酸棗仁湯由酸棗仁30 g、知母9 g、茯苓6 g、川芎6 g和甘草3 g組成，所有飲片均購自湖北省恩施州中心醫(yī)院中藥房。先用8倍于中藥體積的純水浸泡藥物20 min，浸泡后依次使用武火和文火各煎煮藥物20 min，用紗布過濾藥液，再次向飲片中加6倍于中藥體積的純水，煎煮40 min后濾出藥液，混勻兩次煎取的藥液，最后將藥液置于多級旋蒸儀中進行濃縮，最終制成每毫升含生藥0.486 g的水煎液。褪黑素片，湯臣倍健股份有限公司，批號20171125D。Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，大連Takara公司，批號AS4857。SYBR Green qPCR試劑盒，美國Thermo Fisher公司，批號A25780；Trizol，美國Thermo Fisher公司，批號15596026。一抗Per1和Per2均為羊抗鼠抗體，德國默克集團，批號分別為AB5424P、ABN299。HRP標記羊抗小鼠抗體二抗，武漢Cusabio公司，批號CSB-PA644737。

1.3 主要儀器ZZ-6型自主活動測試儀，上海益聯(lián)醫(yī)學。CFX96型實時熒光定量PCR擴增儀，美國Bio-Rad。Quick Drop型核酸蛋白分析儀，美國Molecular Devices。Tanon-1600型凝膠圖像成像分析系統(tǒng)，上海天能。

1.4 動物分組及給藥適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后使用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0生成的隨機數(shù)字表將實驗大鼠采用隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、褪黑素組和酸棗仁湯組，每組10只，除空白組外，其他3組進行腹腔注射對氯苯丙氨酸（PCPA）混懸液以構(gòu)建睡眠剝奪模型。根據(jù)“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值”計算動物給藥劑量，褪黑素組給予褪黑素溶液（36 mg·kg-1·d-1，10 mL·kg-1·d-1），酸棗仁湯組給予酸棗仁湯水煎液（4.86 g·kg-1·d-1，10 mL·kg-1·d-1），空白組和模型組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液（10 mL·kg-1·d-1），連續(xù)灌胃2周，1次/天。

1.5 睡眠剝奪模型的建立配置PCPA混懸液（按100 mg/mL溶于0.9%氯化鈉溶液，劑量500 mg/kg），按10 mL/kg的劑量對模型組、褪黑素組和酸棗仁湯組連續(xù)7 d腹腔注射PCPA混懸液以構(gòu)建睡眠剝奪模型，空白組則連續(xù)7 d腹腔注射等體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.6 動物取材及處理自主活動實驗完成后取材，從每組采用隨機數(shù)字表法選取4只大鼠以10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉（4 mL/kg），經(jīng)腹主動脈取血后斷頭取腦，剝離顱骨，冰上分離大鼠下丘腦后鏡下分離SCN，分裝后置液氮速凍，24 h內(nèi)移于-80℃冰箱以用于Western bolt實驗。對剩余大鼠以同樣方式麻醉，麻醉剪開胸腔，以4%多聚甲醛經(jīng)左心室灌注，斷頭取腦并分離下丘腦，置于4%多聚甲醛中固定48 h后進行免疫組化實驗。動物處置符合倫理原則。

1.7 指標檢測

1.7.1自主活動時間檢測實驗 末次灌胃結(jié)束后24 h，將大鼠置于自主活動測試儀敞箱中，同時啟動自主活動行為追蹤系統(tǒng)，記錄6 min內(nèi)各組大鼠的活動時間。

1.7.2Real time-PCR檢測SCN中Per1、Per2表達

取SCN組織20 mg，加入2 mL Trizol以提取組織中總mRNA；提取后使用核酸蛋白儀檢測各樣本純度和濃度，當OD26/OD280值為1.8～2.0時則表示可進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對純度合格的樣本進行逆轉(zhuǎn)錄以合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄合成步驟及逆轉(zhuǎn)錄條件參照說明書進行；按照SYBR Green qPCR Master Mix熒光定量試劑盒說明書對合成后的cDNA進行基因擴增，擴增步驟及擴增條件參照說明書進行。分析Real time-PCR過程各檢測樣本的Ct值，并用2-△△Ct表示mRNA相對表達水平。通過Primer Premier 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計Per1、Per2及內(nèi)參β-actin的序列，各基因序列見表1。

表1 引物序列

1.7.3免疫組化檢測SCN中Per1、Per2表達 取出多聚甲醛溶液中的腦組織，進行石蠟包埋。包埋后連續(xù)切取5μm厚度的切片，并用二甲苯和梯度乙醇對切片進行脫蠟；將切片平展于3%H2O2中浸泡15 min，使用PBS沖洗切片3 min，洗3次；向切片表面均勻滴加稀釋后的一抗 Perd1（1∶100）和Perd2（1∶200），室溫孵育1 h；使用PBS沖洗切片3 min，洗3次；向切片表面均勻滴加稀釋后二的抗（1∶1 000），室溫孵育15 min；使用PBS沖洗切片3 min，洗3次；滴加DAB顯色液，反應(yīng)5 min；最后再次使用梯度乙醇對切片進行水洗、復染、脫水和透明。顯微鏡下觀察切片，從每天切片中選取5個高倍（400X）視野，用Image Pro-Plus 6.0軟件進行圖像處理并獲取積分光密度（IOD）值。

1.7.4Western blot檢測SCN中Per1、Per2表達 取SCN 20 mg，加含PMSF的蛋白裂解液，組織研磨儀勻漿，以4℃，12 000 r/min離心15 min，取上清，用BCA法測定各樣本蛋白量；制作10%SDS-PAGE凝膠，每孔上樣40μg后依次電泳和轉(zhuǎn)膜；使用PBS洗片3 min，洗3次；按抗體說明書加入稀釋后一抗Per1（1∶1 000）和一抗Per2（1∶1 000），置4 ℃冰箱孵育過夜；使用PBST洗片3 min，洗3次；按抗體說明書加入稀釋后二抗（1∶2 000）；使用PBST洗片3 min，洗3次；向膜表面均勻滴加ECL顯色液，置凝膠圖像成像分析系統(tǒng)獲取各組蛋白條帶，拍照并保存各蛋白條帶。使用Image J計算各條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)均運用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0處理。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，均通過正態(tài)性檢驗。組間整體比較采用單因素方差分析，多重比較采用HSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 自主活動時間檢測結(jié)果空白組活動時間為（377.79±39.55）s，模型組為（478.43±38.89）s，褪黑素組為（394.09±31.27）s，酸棗仁湯組為（412.40±36.24）s，與空白組比較，模型組大鼠活動時間明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，褪黑素組和酸棗仁湯組大鼠活動時間都有減少（P＜0.01，P＜0.05）。各組大鼠活動軌跡圖見圖1。

圖1 各組大鼠活動軌跡圖：A為空白組；B為模型組；C為褪黑素組；D為酸棗仁湯組

2.2 Real time-PCR檢測結(jié)果空白組大鼠SCN中Per1 mRNA和Per2 mRNA表達水平較高，造模后，模型組大鼠SCN中Per1 mRNA和Per2 mRNA表達水平下降（P＜0.01），給藥后，褪黑素組和酸棗仁湯組大鼠SCN中Per1 mRNA和Per2 mRNA表達上升（P＜0.01，P＜0.05）。見表2。

表2 酸棗仁湯對各組大鼠下丘腦SCN中Per1、Per2 mRNA表達的影響/± s

表2 酸棗仁湯對各組大鼠下丘腦SCN中Per1、Per2 mRNA表達的影響/± s

注：多重比較為HSD-q檢驗

組別空白組模型組褪黑素組酸棗仁湯組方差分析F值P值鼠數(shù)6 6 6 6 Per1 mRNA 1.78±0.29 1.26±0.27 1.60±0.21 1.50±0.27 Per2 mRNA 1.50±0.27 1.09±0.25 1.38±0.23 1.34±0.2 3.613 0.025 5.458 0.004

2.3 免疫組化實驗結(jié)果空白組大鼠SCN中Per1和Per2表達水平較高，造模后，模型組大鼠SCN中Per1和Per2表達水平下降（P＜0.01），給藥后，褪黑素組大鼠SCN中Per1和Per2表達上升（P＜0.01，P＜0.05），酸棗仁湯組大鼠SCN中Per1表達也上升（P＜0.05），Per2表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組大鼠SCN中Per1、Per2的IOD（累積光密度）值見圖2。

圖2 各組大鼠SCN中Per1、Per2的IOD（累積光密度）值

2.4 Western blot實驗結(jié)果空白組大鼠SCN中Per1和Per2蛋白表達水平較高，造模后，模型組大鼠SCN中Per1和Per2蛋白表達水平下降（P＜0.01），給藥后，褪黑素組和酸棗仁湯組大鼠SCN中Per1和Per2蛋白表達上升（P＜0.01，P＜0.05）。各組大鼠SCN中Per1和Per2蛋白條帶見圖3，各組大鼠SCN中Per1、Per2灰度值見圖4。

圖3 各組大鼠SCN中Per1和Per2蛋白條帶

圖4 各組大鼠SCN中Per1、Per2灰度值分析

3 討論

酸棗仁湯具有養(yǎng)血滋陰、除煩安神之功，主治“虛勞虛煩不得眠”［8］。該方源自張仲景《金匱要略》，由酸棗仁、川芎、茯苓、知母和炙甘草組成。自古以來，酸棗仁湯就備受醫(yī)家追捧，為臨床治療失眠的有效方。近年來，研究人員從不同角度闡述了酸棗仁湯治療失眠的機制，但其分子機制尚不明確。近幾年，分子生物學的迅猛發(fā)展為研究酸棗仁湯治療失眠的分子機制奠定了良好基礎(chǔ)。

煩躁為失眠病人臨床上常見的軀體癥狀之一，睡眠剝奪也會導致嚙齒類動物出現(xiàn)煩躁不安的行為表現(xiàn)，該種行為則常表現(xiàn)為自主活動時間的改變［9］。自主活動測試儀可以觀察大鼠自主活動時間和活動軌跡，本實驗發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪后模型大鼠活動時間明顯增加（P＜0.01），而給與模型動物酸棗仁湯后，大鼠自主活動時間明顯減少（P＜0.05），這說明成功通過PCPA構(gòu)建了睡眠剝奪模型，同時酸棗仁湯可以改善睡眠剝奪模型大鼠的睡眠狀態(tài)。

SCN為生物節(jié)律的起搏器和調(diào)節(jié)中樞，能廣泛調(diào)節(jié)體溫、呼吸、心臟搏動、血壓、血糖和睡眠等多種生物節(jié)律［10］。SCN 中可通過調(diào)節(jié) Per1、Per2、Clock、Bmal1等多種節(jié)律基因而調(diào)節(jié)睡眠-覺醒周期，同時這些基因相互作用共同構(gòu)成調(diào)節(jié)睡眠的反饋環(huán)路，當這些節(jié)律基因表達異常時則會引起睡眠障礙［11-12］。研究發(fā)現(xiàn)［13］，Per1和Per2的基因表達異常則會導致晝夜節(jié)律周期改變，動物實驗研究表明敲出小鼠Per1和Per1基因則會導致晝夜節(jié)律逐漸消失?；诖耍緦嶒炓訮er1、Per2這一正向晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)基因為研究對象，以闡明酸棗仁湯調(diào)節(jié)睡眠的分子機制。本實驗發(fā)現(xiàn)，空白組大鼠SCN中Per1、Per2表達水平較高，造模后，模型組大鼠SCN中Per1、Per2表達水平下降（P＜0.01），給藥后，褪黑素組和酸棗仁湯組大鼠SCN中Per1、Per2表達都有不同程度上升（P＜0.01，P＜0.05）。這說明睡眠剝奪可以引起大鼠下丘腦SCN中節(jié)律基因Per1、Per2的異常，而酸棗仁湯可以通過調(diào)節(jié)SCN中Per1、Per2的表達而達到防治失眠的療效。

綜合分析，課題組認為酸棗仁湯可能通過調(diào)節(jié)大鼠SCN中Per1、Per2的表達進而改善慢睡眠剝奪大鼠的睡眠狀態(tài)。本研究機制初步闡明了酸棗仁湯干預失眠的作用機制，但其調(diào)節(jié)節(jié)律基因的分子機制有待于進一步研究。此外，本研究也為其他中醫(yī)經(jīng)典方的現(xiàn)代化研究提供了一定的借鑒意義。